ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN VĂN HÙNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO TRẦM HƢƠNG TRÊN CÂY DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2014 CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: Phó Giáo sƣ, Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS Lê Thị Thủy Tiên Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Trần Trung Hiếu Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày 15 tháng 8 năm 2014. Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn Thạc sĩ) 1. Chủ tịch Hội đồng: PGS. TS Bùi Văn Lệ 2.
Ủy viên Phản biện 1: PGS. TS Lê Thị Thủy Tiên 3. Ủy viên Phản biện 2: TS Trần Trung Hiếu 4. Ủy viên Hội đồng: PGS.
TS Nguyễn Đức Lƣợng 5. Thƣ ký Hội đồng: TS Nguyễn Tấn Trung Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Văn Hùng MSHV: 11310608 Ngày, tháng, năm sinh: 08/03/1983 Nơi sinh: Bình Định Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu phân lập và đánh giá tác động của vi sinh vật trong quá trình tạo trầm hƣơng trên cây dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thu thập mẫu trầm hƣơng (trầm kiến) của cây dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte) trong rừng tự nhiên và rừng trồng, thu đƣợc từ hai tỉnh Bình Định và Hà Tĩnh. Phân lập những vi sinh vật có trong các mẫu trầm hƣơng. Bƣớc đầu thử nghiệm sơ bộ khả năng làm biến đổi màu trên gỗ cây dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex.
Lecomte) của những vi sinh vật phân lập đƣợc từ những mẫu trầm hƣơng. Tuyển chọn những vi sinh vật làm đổi màu gỗ cây dó bầu và tiến hành định danh để xác định loài vi sinh vật có khả năng tạo trầm hƣơng trên cây dó bầu. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 19/08/2013 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2014 V.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN : Phó Giáo sƣ, Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng Tp. năm 2014 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) PGS. TS Nguyễn Đức Lƣợng TRƢỞNG KHOA….……… (Họ tên và chữ ký) LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ sự giúp đỡ rất lớn từ Thầy của tôi: Phó Giáo sƣ - Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng, Thầy đã truyền đạt kiến thức chuyên ngành quý báu trong suốt 3 năm tôi học tập tại trƣờng. Thầy luôn quan tâm nhắc nhở, động viên trong quá trình làm luận văn, chia sẽ những khó khăn và giúp đỡ mỗi khi tôi cần.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô: Phó Giáo sƣ - Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hƣơng, Phó Giáo sƣ - Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh đã quan tâm tạo điều kiện về thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm và những góp ý trong quá trình làm luận văn của tôi. Xin gửi lời cảm ơn: Thạc sĩ Nguyễn Ngọc Thanh – ĐH Mở Tp. Hồ Chí Minh, Thạc sĩ Liêu Mỹ Đông – ĐH Công nghiệp Thực phẩm, Tp.
Hồ Chí Minh, Kỹ sƣ Nguyễn Hoàng Anh đã giúp tôi rất nhiều, cô Võ Thị Ly Tao, Thạc sĩ Trần Trúc Thanh, Kỹ sƣ Nguyễn Anh Tuấn, đã giúp đỡ về dụng cụ, hóa chất phòng thí nghiệm cho tôi. Đặc biệt, gia đình luôn dõi theo và động viên tinh thần để tôi toàn tâm trong quá trình học tập của mình. TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu phân lập và đánh giá tác động của vi sinh vật trong quá trình tạo trầm hƣơng trên cây dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex. Lecomte)”, đối tƣợng nghiên cứu là hai mẫu trầm hƣơng (trầm kiến) của cây dó bầu thu thập từ Hà Tĩnh và Bình Định.
Sau khi phân lập hai mẫu trầm hƣơng này trên môi trƣờng PDA ở 28oC sau 7 ngày chúng tôi tiến hành thu nhận bào tử, tuyển chọn những sinh vật có khả năng tạo trầm hƣơng và thu đƣợc những kết quả nhƣ sau: (1) Kết quả phân lập đã xác định đƣợc những vi sinh vật hiện diện trong những mẫu trầm hƣơng chủ yếu là những loài nấm sợi, chúng thuộc nhóm nấm sợi có hình thái khuẩn lạc, màu sắc và khả năng tạo bào tử khác nhau. Trong đó, mẫu 1 (trầm hƣơng – Bình Định) có 4 chủng nấm, chúng tôi ký hiệu 4 chủng nấm phân lập đƣợc là: BĐ 1, BĐ 2, BĐ 3, BĐ 4; kết quả phân lập mẫu 2 (trầm hƣơng – Hà Tĩnh) có 4 chủng nấm, chúng tôi ký hiệu 4 chủng nấm phân lập đƣợc là: HT 1, HT 2, HT 3, HT 4. Tuy nhiên, chủng nấm BĐ 2 có trong mẫu trầm hƣơng Bình Định và HT 4 trên mẫu trầm hƣơng Hà Tĩnh đều có hình thái giống nhau hoàn toàn. Kết quả định danh hai chủng này theo phƣơng pháp giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH (Phòng xét nghiệm NK-Biotek Tp Hồ Chí Minh), sau khi giải trình tự gen 28S và tra cứu trên BLAST SEARCH có kết quả nhƣ sau : BĐ 2 (HT 4) là loài nấm mốc Aspergillus niger (phụ lục 1).
BĐ 3 là nấm Bionectria ochroleuca (phụ lục 2). LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Ngƣời viết cam đoan MỤC LỤC Mục lục………………………………………………………………………………i Danh mục bảng…………………………………………………………………….iv Danh mục hình………………………………………………………………………v Các từ viết tắc…………………………………………………………………….vii Chƣơng 1. Tính cấp thiết của đề tài………………………………………………………. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………………2 1. Nội dung nghiên cứu……………………………………………………………2 1.
Phạm vi nghiên cứu……………………………………………………………. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài………………………………………. Ý nghĩa khoa học……………………………………………………………. Về mặt thực tiễn…………………………………………………………….
TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………. Giới thiệu về cây dó bầu……………………………………………. Đặc tính sinh học……………………………………………………………. Sinh thái, sinh trƣởng và phát triển………………………………………….
Tình trạng hiện nay. Cây dó bầu trong tự nhiên…………………………………………………. Cây dó bầu trồng…………………………………………………………. Sự hình thành trầm hƣơng trong tự nhiên…………………………………….
Những vi sinh vật tham gia quá trình tạo trầm hƣơng………………………. Những phƣơng pháp kích tạo trầm……………………………………………15 2. Giá trị của trầm hƣơng………………………………………………………. Trong mỹ phẩm…………………………………………………………….
Trong sản xuất nhang………………………………………………………. Các lĩnh vực khác……………………………………………………………20 2. Tinh dầu trầm hƣơng (Agarwood oil) ………………………………………21 2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trầm hƣơng……………………………………23 2.
Trầm hƣơng trên thị trƣờng quốc tế…………………………………………23 2.Các dạng trầm hƣơng trong thƣơng mại…………………………………. Sự phân loại trầm hƣơng trong thƣơng mại………………………………23 2. Sự khác nhau giữa trầm hƣơng và kỳ nam…………………. Tình hình khai thác và buôn bán trầm hƣơng………………………….
NGHUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……. Nguyên vật liệu……………………………………………………………. Môi trƣờng…………………………………………………………. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………….
Phƣơng pháp phân lập và bảo quản vi sinh vật. Tăng sinh và pha loãng……………………………………………………32 3. Cấy mẫu và ủ mẫu…………………………………………………………32 3. Phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trƣng…………………………………….
Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật………………………………. Định danh các chủng nấm phân lập đƣợc…………………………………33 3. Phƣơng pháp bảo quản vi sinh vật………………………………………. Xác định trực tiếp số lƣợng tế bào bằng buồn đếm hồng cầu…………….
Cách tiến hành………………………………………………………………. Thu thập mẫu…. Môi trƣờng PDA (Patato Dextrose Agar)………. Phân lập nấm…………………………………………………………….
Phƣơng pháp quan sát hình thái……………………………. Phƣơng pháp thu nhận bào tử nấm……………………………………. Tuyển chọn chủng nấm có khả năng tạo trầm hƣơng…………………. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………….
Kết quả phân lập vi sinh vật dƣới dạng vi thể và đại thể……………………. Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập đƣợc từ mẫu 1………………. Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập đƣợc từ mẫu 2………………. Thu nhận bào tử các chủng nấm đƣợc phân lập từ hai mẫu trầm hƣơng thu thập……………………………………………………………………………….
Kết quả tuyển chọn và định danh chủng nấm có khả năng tạo trầm hƣơng…. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………….…………57 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….61 Trang ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần tinh dầu trầm hƣơng………………………………………. Số lƣợng bào tử thu đƣợc (bào tử/ml) và thể tích (ml) dịch chứa bào tử (1.107 bào tử/ml) cần lấy để phun trên gỗ dó bầu sau quá trình nuôi cấy………….
Tuyển chọn các chủng nấm có khả năng làm đổi màu gỗ cây dó bầu….51 Trang x DANH MỤC HÌNH Hình 2. Lá, hoa, quả và hạt dó bầu……………………………………………. Mặt cắt dọc và mặt cắt ngang của phần thân cây có trầm hƣơng………. Kỹ thuật khoan và cấy tạo trầm trên cây dó bầu ……………………….
Trầm hƣơng mỹ nghệ (Phúc Trạch - Hƣơng Khê - Hà Tĩnh)…………. Trầm hƣơng trong tự nhiên (Giá bán: 3. Trầm kiến của cây dó bầu tự nhiên (huyện Hoài Ân – tỉnh Bình Định). Trầm kiến của cây dó bầu trồng (Phúc Trạch –Hƣơng Khê – Hà Tĩnh).
Sơ đồ tổng quát nghiên cứu…………………………………………….4: Sơ đồ qui trình phân lập nấm từ mẫu trầm hƣơng………………………36 Hình 3. Phƣơng pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân………………. Hệ sợi nấm BĐ 1 sau 48 h nuôi cấy trên môi trƣờng PDA……………. Bào tử nấm BĐ 1 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)………….
Hệ sợi nấm BĐ 2 sau 18 h và 7 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA…. Bào tử nấm BĐ 2 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)…………. Hệ sợi nấm BĐ 3 sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA…………. Bào tử nấm BĐ 3 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)………….
Hệ sợi nấm BĐ 4 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA………. Bào tử nấm BĐ 4 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)…………. Hệ sợi nấm HT 1 sau 24 h và 7 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA…. Bào tử nấm HT 1 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)……….
Hệ sợi nấm HT 2 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA…………. Bào tử nấm HT2 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)…………46 Hình 4. Hệ sợi nấm HT 3 sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA………. Bào tử nấm HT 3 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)…….…47 Trang xi Hình 4.
Hệ sợi nấm HT 4 sau 18 h và 7 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA…48 Hình 4. Bào tử nấm HT 4 chụp dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x40)…………48 Hình 4. BĐ 1 không làm biến đổi màu gỗ sau 10 ngày…………. BĐ 2 làm biến đổi màu gỗ sau 10 ngày…………….
BĐ 3 làm biến đổi màu gỗ sau 10 ngày ….
