Ảnh hưởng microbial transglutaminase đến chất lượng phô mai tươi - ĐHSPKT TP.HCM

Đồ án tốt nghiệp này nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme transglutaminase từ nguồn gốc vi sinh vật đến việc nâng cao chất lượng sản phẩm phô mai tươi.

• Tác giả: Huỳnh Anh Thư
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Hoàn
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Ảnh hưởng của mTGase đến chất lượng sản phẩm phô mai tươi
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về phô mai tươi và enzyme transglutaminase

Phô mai tươi là sản phẩm sữa lên men có giá trị dinh dưỡng cao, chứa protein, canxi và các vitamin thiết yếu. Quá trình sản xuất phô mai tươi dựa trên cơ chế đông tụ casein thông qua axit hóa bởi vi khuẩn lactic. Khi pH giảm xuống 4,6, casein đạt điểm đẳng điện và kết tụ thành gel. Transglutaminase nguồn gốc từ vi sinh vật (mTGase) là enzyme xúc tác phản ứng tạo liên kết ngang giữa các chuỗi protein. Enzyme này hoạt động bằng cách liên kết nhóm ε-amino của lysine với nhóm γ-amide của glutamine. Công nghệ sử dụng mTGase trong sản xuất phô mai giúp cải thiện cấu trúc, tăng độ đặc và giảm hiện tượng tách whey. Nghiên cứu ứng dụng mTGase vào phô mai tươi mở ra hướng phát triển mới cho ngành công nghiệp sữa tại Việt Nam. Phương pháp này thân thiện với môi trường, an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.

1.1. Giá trị dinh dưỡng và phân loại phô mai

Phô mai cung cấp lượng protein dồi dào, chiếm khoảng 20-30% trọng lượng khô. Sản phẩm chứa hàm lượng canxi cao, hỗ trợ phát triển xương và răng. Phô mai còn cung cấp vitamin A, B12, K2 và các khoáng chất như phốt pho, kẽm. Theo phương pháp chế biến, phô mai được phân loại thành phô mai tươi, phô mai mềm, phô mai bán cứng và phô mai cứng. Phô mai tươi có đặc điểm mềm mịn, hàm lượng nước cao và thời hạn sử dụng ngắn hơn so với các loại phô mai chín. Quá trình lên men axit lactic đóng vai trò quyết định chất lượng sản phẩm cuối cùng.

1.2. Cơ chế đông tụ casein trong sản xuất phô mai

Casein là nhóm protein chính trong sữa, chiếm khoảng 80% tổng protein. Casein tồn tại dưới dạng micelle chứa αs1-casein, αs2-casein, β-casein và κ-casein. Trong quá trình axit hóa, các ion hydro trung hòa điện tích âm trên bề mặt micelle. Lực đẩy tĩnh điện giảm dần khi pH hạ xuống. Ở pH 5,2, micelle bắt đầu tổng hợp. Tại pH 4,6, canxi phosphate tách khỏi micelle, casein đạt điểm đẳng điện và kết tụ thành gel. Vi khuẩn lactic chuyển đổi lactose thành axit lactic, thúc đẩy quá trình đông tụ tự nhiên này.

II. Vai trò của mTGase trong cải thiện chất lượng phô mai

Transglutaminase nguồn gốc từ vi sinh vật催化 phản ứng liên kết ngang giữa các phân tử protein trong sữa. Enzyme tạo cầu nối isopeptide giữa nhóm ε-amino của lysine và nhóm γ-carboxamide của glutamine. Phản ứng này cải thiện đáng kể tính chất gel của phô mai tươi. Sản phẩm có cấu trúc đặc hơn, mịn hơn và giảm hiện tượng tách nước whey. Hàm lượng protein retained trong phô mai tăng lên rõ rệt. Nghiên cứu cho thấy nồng độ enzyme từ 1,8 đến 3,0 U/g protein mang lại hiệu quả tối ưu. Nhiệt độ phản ứng thích hợp nằm trong khoảng 45-60°C. Thời gian xử lý enzyme từ 1,5 đến 6 giờ ảnh hưởng trực tiếp đến độ cứng và tính dẻo của sản phẩm. Ứng dụng mTGase giúp giảm tổn thất protein trong quá trình sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế cho nhà sản xuất.

2.1. Tác động đến cấu trúc và tính chất gel của phô mai

mTGase tạo liên kết cộng hóa trị giữa các chuỗi casein, hình thành mạng lưới protein ba chiều bền vững. Cấu trúc gel trở nên chặt chẽ hơn so với gel hình thành chỉ bằng axit hóa. Độ cứng của phô mai tăng 20-40% khi xử lý với nồng độ enzyme phù hợp. Tính đàn hồi cải thiện, sản phẩm ít bị vỡ khi cắt. Độ nhớt tăng giúp phô mai có kết cấu kem mịn hơn. Liên kết ngang do mTGase tạo ra ổn định trong điều kiện acid, phù hợp với môi trường pH thấp của phô mai tươi. Các nghiên cứu microscopy cho thấy kích thước lỗ trong gel giảm đáng kể.

2.2. Ảnh hưởng đến hàm lượng protein và giảm tách whey

Xử lý mTGase giúp tăng tỷ lệ protein retained trong phô mai từ 5-15%. Protein whey cũng tham gia phản ứng liên kết ngang với casein, giảm lượng whey tách ra ngoài. Hiện tượng syneresis giảm rõ rệt khi nồng độ enzyme tăng. Sản phẩm có năng suất cao hơn, giảm lãng phí nguyên liệu. Hàm lượng protein trong phô mai thành phẩm tăng cải thiện giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, cần kiểm soát chặt chẽ liều lượng enzyme để tránh tạo gel quá cứng, ảnh hưởng đến cảm quan. Nồng độ enzyme vượt ngưỡng tối ưu có thể làm giảm tính tan của protein whey.

III. Phương pháp nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất

Nghiên cứu áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp hai với ba yếu tố: nồng độ mTGase, nhiệt độ và thời gian xử lý. Bố trí thực nghiệm gồm 18 mẫu, bao gồm 8 điểm thí nghiệm factorial, 6 điểm trục và 4 lần lặp tại tâm. Nồng độ enzyme khảo sát từ 0,1 đến 3,5 U/g protein. Nhiệt độ phản ứng dao động từ 23,8 đến 66,2°C. Thời gian xử lý từ 0,57 đến 6,93 giờ. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng bao gồm độ cứng, tính dẻo, độ nhớt, hàm lượng protein và lượng whey tách ra. Ma trận thực nghiệm được xây dựng theo công thức thống kê, đảm bảo tính trực giao và hiệu quả kinh tế. Phương pháp tối ưu hóa giúp xác định điều kiện xử lý enzyme tốt nhất cho sản phẩm phô mai tươi.

3.1. Thiết kế thực nghiệm trực giao cấp hai

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao sử dụng công thức tính số thí nghiệm N = 2k + 2k + n0. Với k = 3 yếu tố, số thí nghiệm là 18 mẫu. Cánh tay đòn α được tính bằng 1,414 để đảm bảo tính trực giao của ma trận. Điều kiện trực giao满足 λ = 0,667. Bố trí gồm 8 điểm góc (±1), 6 điểm trục (±1,414, 0, 0) và 4 điểm tâm (0, 0, 0). Thiết kế này cho phép đánh giá đồng thời ảnh hưởng của ba yếu tố và tương tác giữa chúng. Phương pháp giảm số thí nghiệm so với full factorial nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác thống kê.

3.2. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm

Độ cứng được đo bằng máy texture analyzer, thể hiện lực cần thiết để nén mẫu phô mai. Tính dẻo đánh giá khả năng phục hồi hình dạng sau khi loại bỏ lực nén. Độ nhớt đo bằng viscometer, phản ánh tính chảy của sản phẩm. Hàm lượng protein xác định theo phương pháp Kjeldahl. Lượng whey tách ra được đo bằng ly tâm mẫu ở tốc độ và thời gian tiêu chuẩn. Cảm quan được đánh giá bởi panel gồm 10 người trained. Các chỉ tiêu hóa lý và cảm quan kết hợp đánh giá toàn diện chất lượng phô mai tươi xử lý mTGase.

IV. Kết luận và ứng dụng công nghệ mTGase trong thực tế

Kết quả nghiên cứu chứng minh mTGase cải thiện đáng kể chất lượng phô mai tươi. Nồng độ enzyme 1,8-3,0 U/g protein, nhiệt độ 45-60°C và thời gian 3-6 giờ là điều kiện tối ưu. Sản phẩm có độ cứng tăng, tính dẻo cải thiện và giảm tách whey rõ rệt. Hàm lượng protein retained tăng 5-15% so với mẫu đối chứng. Công nghệ mTGase có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành sản xuất phô mai Việt Nam. Phương pháp này giúp tăng năng suất, giảm lãng phí nguyên liệu và cải thiện giá trị dinh dưỡng sản phẩm. Quy trình sản xuất dễ dàng tích hợp vào dây chuyền hiện có. Chi phí enzyme hợp lý, hiệu quả kinh tế cao. Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm phô mai chất lượng cao, cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu. Ứng dụng mTGase góp phần nâng cao giá trị gia tăng cho ngành công nghiệp sữa trong nước.

4.1. Tối ưu hóa quy trình và hiệu quả kinh tế

Điều kiện tối ưu giúp giảm thời gian sản xuất và tăng năng suất phô mai. Chi phí enzyme mTGase chiếm tỷ lệ nhỏ trong tổng chi phí sản xuất. Lợi ích kinh tế thu được từ tăng năng suất và giảm tổn thất protein lớn hơn nhiều so với chi phí đầu tư enzyme. Quy trình xử lý enzyme đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp. Doanh nghiệp dễ dàng áp dụng vào sản xuất quy mô công nghiệp. Sản phẩm chất lượng cao giúp tăng khả năng cạnh tranh trên thị trường. Giá bán phô mai tươi có thể tăng 10-20% nhờ cải thiện chất lượng cảm quan và dinh dưỡng.

4.2. Hướng phát triển và tiềm năng ứng dụng

Nghiên cứu cần tiếp tục tối ưu hóa trên quy mô pilot trước khi scale-up công nghiệp. Ứng dụng mTGase có thể mở rộng sang các sản phẩm sữa khác như yogurt, kefir và cream cheese. Kết hợp mTGase với các enzyme khác như protease để tạo sản phẩm có hương vị đặc trưng. Nghiên cứu tác động của mTGase đến quá trình lão hóa phô mai trong thời gian dài. Phát triển sản phẩm phô mai tươi chức năng bổ sung probiotics. Hợp tác với doanh nghiệp để thương mại hóa kết quả nghiên cứu. Công nghệ mTGase góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sữa Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. Tổng quan tài liệu - Xuất phát từ thói quen: Phô mai là loại thực phẩm rất giàu giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng phô mai của nước ta lại không cao, có thể do mùi vị phô mai không phù hợp với sở thích của người Việt Nam. Nhưng theo ghi nhận, sản phẩm sữa chua lại lại được sự chấp nhận cũng như ưa thích rất cao ở nước ta.

Vì thế, chúng tôi lựa chọn sản xuất loại phô mai với các tiêu chuẩn hướng đến sản phẩm mục tiêu là phô mai Quark – loại phô mai vừa giàu dinh dưỡng vừa có độ chua nhất định, phù hợp với thị hiếu của người Việt Nam. - Đa dạng hóa sản phẩm: Sản phẩm phô mai có thể được sử dụng trực tiếp hoặc được sử dụng kết hợp để làm bánh, làm nhân,. từ đó làm tăng nhu cầu sử dụng phô mai hơn trong đời sống con người Việt. Thành phần của một số sản phẩm sữa bột (%) Các thành phần Sữa bột nguyên kem Sữa bột gầy Nước 3,5 4,3 Protein 25,2 35,0 Lipid 26,2 1,0 Lactoza 38,1 51,9 Chất khoáng 7,0 7,8 Nguồn: Lâm Xuân Thanh, 2003 1.

Cơ chế đông tụ casein trong quá trình sản xuất phô mai Trong quá trình sản xuất phô mai tươi, casein trong sữa được đông tụ bởi hai tác nhân chính là acid hoặc/và enzyme (Fox và cộng sự, 2004). Một trong những ưu điểm của sản phẩm sữa lên men nhờ sử dụng vi khuẩn lactic sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo kết cấu và hương vị đặc trưng của sản phẩm cuối cùng (Tiina Kriščiunaite, 2013). Hai trong số vi khuẩn lactic thường được tìm thấy trong các sản phẩm sữa lên men là Streptococcus thermophilus (Str.

thermophilus) vàLactobacillus delbrueckii subsp. Tuy nhiê việc sử dụng vi khuẩn lactic như làtác nhâ gây đông tụ casein trong quá trình sản xuất phô mai tươi còn chưa phổ biến, vì thế với mong muốn 8 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chương 1. Tổng quan tài liệu thu được sản phẩm phô mai tươi với hương vị đặc trưng của sản phẩm lên men chúng tôi đề xuất sử dụng tổ hợp chủng vi khuẩn lactic trong nghiên cứu này. Vi khuẩn lactic Một trong những nhóm vi khuẩn sản xuất axit quan trọng nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm làvi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria - LAB).

LAB làvi khuẩn gram dương thường không di động, không hình thành bào tử. Vi khuẩn này thuận lợi phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng vẫn có thể phát triển khi có mặt oxy (Khalisanni Khalid, 2011). Chúng gây ra sự axit hóa nhanh chóng các nguyên liệu thô thông qua việc sản xuất axit hữu cơ, chủ yếu là axit lactic (Ahmed and Kanwal, 2004). Ngoài axit lactic, quá trình lên men còn sản xuất axit axetic, ethanol, các hợp chất hương liệu,….và một số enzyme quan trọng góp phần tăng thời hạn sử dụng vàan toàn vi sinh vật, tạo ra sản phẩm cókết cấu vàhương vị mong muốn (Leroy và Vuyst, 2004).

Việc lựa chọn chủng vi khuẩn để sử dụng trong quátrình sản xuất rất quan trọng. Một chủng hiếm khi tạo ra được hiệu quả tốt nhất cho sản phẩm, vìvậy hỗn hợp các chủng vi khuẩn thường được sử dụng (Moon vàcộng sự, 1976). Trong nghiê cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Str. bulgaricus, loại dùng bổ sung trực tiếp vào dung dịch sữa để lên men.

Cómối quan hệ cộng sinh giữa Str. bulgaricus, trong đó cả hai loài vi khuẩn kích thích sự phát triển của nhau (Farnworth, 2003). Các enzyme phân giải protein của Lb. bulgaricus làm suy giảm casein với sự giải phóng các peptide và axit amin trọng lượng phân tử thấp.

Các axit amin phát sinh từ hoạt động phân giải protein này đã được xác định làchất kích thích tăng trưởng cụ thể đối với Str. thermophilus, cho phé Str. thermophilus phát triển nhanh hơn trong giai đoạn đầu của quá trình ủ (Bautista vàcộng sự, 1966; Mitchell vàSandine, 1984). Trong khi đó, Str.

thermophilus tạo ra axit formic, kích thích sự phát triển của Lb. bulgaricus, dẫn đến thời gian lên men được rút ngắn (Farnworth, 2003).  Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus được coi là loài vi khuẩn acid lactic quan trọng thứ hai sau Lactococcus lactis trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm sữa lên men (De Vuyst và Tsakalidou, 2008; Hols và cộng sự, 2005). 9 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chương 1.

Tổng quan tài liệu Một trong những vai tròchính của Str. thermophilus trong quátrình lên men sữa làthực hiện quá trình axit hóa nhanh chóng. Ngoài ra, Str. thermophilus cũng có một số tính chất công nghệ quan trọng khác như chuyển hóa đường, sử dụng galactose, hoạt động phân giải protein và hoạt hóa urease (Iyer và cộng sự, 2010).

thermophilus chịu nhiệt, nó được nuôi cấy trong môi trường có nhiệt độ 35- 43 C. thermophilus cóthể tồn tại ở 60 C trong 30 phút nhưng không phát triển ở 10 C (De o Ramesh vàcộng sự, 2013). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của Str. Tuy o nhiên, khi kết hợp với Lb.

thermophilus phát triển tốt ở nhiệt độ ủ là 43 C (De Ramesh và cộng sự, 2013).  Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) là vi khuẩn Gram dương, dạng sợi, không di chuyển và không hình thành bào tử, hoạt động mạnh tại pH axit 4,6 - 5,4.

bulgaricus sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 45 C, nhưng trong quá trình sản xuất các sản phẩm từ sữa chúng thường được sử dụng kết hợp với Str. thermophilus nê quátrình lên men o thường diễn ra ở nhiệt độ 42- 43 C để phù hợp với nhiệt độ sinh trưởng của Str. Tương tự như Str. bulgaricus cũng cókhả năng tạo ra enzyme lactase để thủy phân lactose thành glucose và galactose.

Glucose chuyển hóa thành axit lactic. Cơ chế đông tụ casein Vignola (2002) định nghĩa sự đông tụ sữa là sự mất ổn định của các micelle casein, kết bông và kết tụ để tạo thành gel bao quanh các thành phần sữa hòa tan. Trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi sẽ trình bày về cơ chế đông tụ casein trong nguyên liệu sữa bò dưới tác nhân gây đông tụ là các chủng vi khuẩn lactic. Trong giai đoạn lên men, vi khuẩn lactic sử dụng cơ chất (chủ yếu làđường lactose) tạo ra sản phẩm trao đổi chất làm thay đổi môi trường lên men vàcá thành phần trong sữa nguyê liệu.

Trong đó, lactose dưới tác dụng của enzyme galactosidase tạo thành hai đường đơn là glucose vàgalactose. Hai loại đường này sẽ đi theo hai con đường khác nhau, glucose sẽ đi trực tiếp theo con đường đường phân, còn galactose sau một vài phản ứng tạo thành glucose vàcũng 10 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chương 1. Tổng quan tài liệu đi theo con đường đường phân tạo ra pyruvate (Baglio, 2014). Pyruvate trong điều kiện yếm khí sẽ tạo thành axit lactic.

Casein là các phosphoprotein chứa khoảng 80% tổng hàm lượng protein sữa. Casein được tạo thành từ nhiều thành phần. Các thành phần chính là α s1-casein, αs2-casein, β-casein và κ-casein với một lượng đáng kể micellar hoặc colloidal calcium phosphate (CCP) dưới dạng tổng hợp gọi là casein micelles. Sau khi axit hóa, nhiều tính chất hóa lý của micelles casein bị thay đổi đáng kể, đặc biệt là trong phạm vi pH từ 5,0 đến 5,5.

+ Quátrình axit hóa cá ion H được giải phóng trung hòa dần các điện tích âm: lực đẩy + tĩnh điện giảm khi tăng nồng độ H và sau đó biến mất. Ở nhiệt độ phòng, các micelles casein bắt đầu tổng hợp ở pH 5,2 (Thibault Troch và cộng sự, 2017). Khi pH đạt 4,6, canxi phosphate bị tách khỏi cá hạt micelle, đồng thời casein đạt tới điểm đẳng điện. Khi đó, micelle không còn tích điện nữa, do đó casein có xu hướng kết tụ lại với nhau, gây ra hiện tượng đông tụ casein (De Ramesh và cộng sự, 2013).

Giới thiệu về Transglutaminase (TGase) Transglutaminse (TGase) là enzyme phổ biến trong tự nhiên. Nó đã được tìm thấy trong các mô động vật có vú, ở nhiều động vật không xương sống, cá và trong các mô thực vật như đậu nành, củ cải xanh và táo vườn (Kieliszek và Misiewicz, 2013 ; DeJong và Koppelman, 2002). TGase xúc tác cho sự hình thành các liên kết ngang giữa các phân tử protein làm thay đổi về chức năng của protein như: độ hòa tan, khả năng nhũ hóa, tính chất tạo bọt và tạo gel ( Kieliszek và Misiewicz, 2013). Bên cạnh đó sự hình thành liên kết ngang còn giúp cải thiện kết cấu, khả năng hydrat hóa và độ ổn định nhiệt của protein trong thực phẩm (Soleymanpuori và cộng sự, 2014).

Liên kết ngang gây ra bởi TGase phụ thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ protein, pH, nhiệt độ vàthời gian ủ với enzyme (Domagała vàcộng sự, 2015). Tốc độ tạo liên kết ngang phụ thuộc vào cấu trúc các phân tử của protein (Soleymanpuori và cộng sự, 2014). Hoạt tính của 2+ 2+ + TGase tăng lên khi có mặt Co , Ba vàK (Kieliszek vàMisiewicz, 2013). 11 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chương 1.

Tổng quan tài liệu Kiểm soát phản ứng TGase Nếu không cóbất kỳ sự can thiệp nào, phản ứng liên kết ngang sẽ tiếp tục đến khi không còn glutamines hay lysine nào cho enzyme (DeJong vàKoppelman, 2002). Để ngăn chặn sự hình thành của các liên kết ngang, ta có thể sử dụng các phương pháp sau (DeJong vàKoppelman, 2002): - Bất hoạt TGase bằng nhiệt là một cách đơn giản để ngăn chặn sự hình thành các liên kết ngang. Tuy nhiên, quy trình này không phải lúc nào cũng có thể áp dụng được vì nhiệt độ cao có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein. - Bất hoạt TGase bằng cách thay đổi độ pH làmột giải phá thay thế.

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với sự biên tính của protein và có thể dẫn đến kết tủa. - Sử dụng chất ức chế có thể ngăn chặn hoạt động của TGase mà không gây ra bất kỳ thay đổi vật lýhoặc hóa học nào của protein liên kết ngang. Tuy nhiên, tại thời điểm này, chỉ có một số chất ức chế tổng hợp của TGase được biết đến như: N-ethylmaleimide, iodoacetamide vàpara-mercury benzoic acid. Theo Kieliszek và Misiewicz, 2013 thì nhiệt độ 40°C ở pH 5,5 là thuận lợi nhất cho hoạt động xúc tác của TGase.

TGase có nguồn gốc vi sinh (mTGase) là một bước phát triển đáng kể được ứng dụng rộng rãi. Enzyme này có thể được sản xuất với số lượng lớn và có sẵn trên thị trường, do đó có thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng một cách triệt để (DeJong và Koppelman, 2002). MTGase có trọng lượng phân tử thấp, trái ngược với TGase phân lập từ mô động vật, mTGase là một protein đơn phân đơn giản (không phải là glycoprotein hoặc lipoprotein) (Motoki và Seguro, 1998) và nó được xác nhận là một thành phần an toàn trong các loại thực phẩm chế biến sẵn ở Mỹ, Nhật Bản và châu Âu (Gharibzahedi và Chronakis, 2018).