Khóa luận tốt nghiệp về nghiên cứu sản xuất asparaginase từ vi sinh vật tái tổ hợp

Nghiên cứu công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít, tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu suất sản phẩm.

• Tác giả: Phạm Nguyệt Hằng
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Hương Trà
• Trường học: Viện Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất asparaginase từ vi sinh vật tái tổ hợp
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. MỤC TIÊU
• 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 250 rpm
• 3.2. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 300 rpm
• 3.3. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 350 rpm
• 3.4. Nghiên cứu thu hồi asparaginase
• 3.5. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít
• 4. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 4.1. Giới thiệu chung về asparaginase
• 4.2. Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên
• 4.3. Cấu tạo và đặc tính
• 4.4. Giới thiệu về acrylamide
• 4.5. Khả năng gây bệnh
• 4.6. Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm
• 4.7. Phương pháp giảm acrylamide trong sản xuất bánh nướng
• 4.8. Cơ chế xúc tác của asparaginase
• 4.9. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên thế giới
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 5.1. Môi trường. Thiết bị và dụng cụ
• 5.2. Phương pháp. Làm tươi chủng giống
• 5.3. Nhân giống cấp 1
• 5.4. Nhân giống cấp 2
• 5.5. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy
• 5.6. Nghiên cứu thu hồi asparaginase
• 5.7. Phương pháp xác định asparaginase
• 5.8. Xác định hoạt độ asparaginase
• 6. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 6.1. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít
• 6.2. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 250 rpm
• 6.3. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 300 rpm
• 6.4. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 350 rpm
• 6.5. Nghiên cứu thu hồi asparaginase
• 6.6. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Asparaginase tái tổ hợp và ứng dụng tiềm năng

Asparaginase (EC 3.1) là enzyme xúc tác quá trình thủy phân L-asparagine thành axit aspartic và ammonia. Hiện nay, asparaginase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, nó được sử dụng như một chất phụ gia để giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm nướng. Trong y học, Asparaginase đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính (ALL). Asparaginase tái tổ hợp mở ra tiềm năng sản xuất enzyme quy mô lớn, ổn định và hiệu quả hơn so với các phương pháp truyền thống. Khóa luận tốt nghiệp của Phạm Nguyệt Hằng đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất asparaginase từ chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp mang gen pPIC9asp2.

1.1. Định nghĩa và cơ chế hoạt động của enzyme Asparaginase

L-Asparaginase là một enzyme bao gồm 4 tiểu phần với tổng cộng 321 amino acid, xúc tác cho phản ứng thủy phân L-asparagine. Enzyme có cấu trúc phân tử là C1377H2208N382O442S17. Asparaginase làm phân hủy L-asparagine, một hóa chất trong các tế bào khối u, cần thiết cho sự phát triển của chúng. Do đó, enzyme này ngăn cản sự tổng hợp protein của khối u, gây chết tế bào bằng cách hoạt hóa quá trình chết tế bào theo chương trình.

1.2. Ưu điểm của Asparaginase tái tổ hợp so với nguồn tự nhiên

So với asparaginase thu từ các chủng tự nhiên, asparaginase tái tổ hợp mang lại nhiều lợi thế. Thứ nhất, sản lượng thường cao hơn đáng kể. Thứ hai, quy trình sản xuất asparaginase tái tổ hợp có thể được kiểm soát chặt chẽ hơn, đảm bảo tính đồng nhất và độ tinh khiết của sản phẩm. Thứ ba, việc sử dụng vi sinh vật tái tổ hợp có thể giúp giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm và các vấn đề an toàn khác liên quan đến việc sử dụng các nguồn enzyme tự nhiên.

1.3. Tiềm năng ứng dụng rộng rãi của Asparaginase trong công nghiệp

Asparaginase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác. Trong thực phẩm, nó được sử dụng để giảm acrylamide, một chất gây ung thư tiềm ẩn, trong các sản phẩm nướng. Trong y học, nó được sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư máu. Ngoài ra, asparaginase còn có thể được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm hóa học và trong xử lý chất thải.

II. Thách thức trong sản xuất Asparaginase quy mô công nghiệp lớn

Sản xuất asparaginase quy mô công nghiệp lớn đối mặt với nhiều thách thức. Việc lựa chọn chủng vi sinh vật phù hợp, tối ưu hóa điều kiện lên men, và phát triển quy trình thu hồi, tinh sạch hiệu quả là những yếu tố then chốt. Ngoài ra, cần đảm bảo tính ổn định và an toàn của enzyme trong quá trình sản xuất và lưu trữ. Chi phí sản xuất cũng là một yếu tố quan trọng cần cân nhắc.

2.1. Tìm kiếm và tối ưu hóa chủng vi sinh vật sản xuất Asparaginase

Việc lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất asparaginase với hiệu suất cao, ổn định và an toàn là một thách thức lớn. Các chủng vi sinh vật tái tổ hợp thường được ưu tiên do khả năng kiểm soát và tối ưu hóa quá trình sản xuất. Tuy nhiên, việc tạo và duy trì các chủng tái tổ hợp cũng đòi hỏi kỹ thuật và chi phí nhất định.

2.2. Tối ưu hóa các yếu tố môi trường lên men để tăng hiệu suất

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan, và thành phần môi trường lên men (nguồn carbon, nguồn nitrogen) ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất sản xuất asparaginase. Việc tối ưu hóa các yếu tố này đòi hỏi các nghiên cứu thực nghiệm và phân tích thống kê kỹ lưỡng. Theo nghiên cứu, quá trình lên men sản xuất asparaginase chịu ảnh hưởng của một số tác nhân như nguồn carbon, nguồn nitơ với các thông số khác như độ pH, nhiệt độ.

2.3. Phát triển quy trình thu hồi và tinh sạch Asparaginase hiệu quả

Quy trình thu hồi và tinh sạch asparaginase cần đảm bảo hiệu suất cao, loại bỏ các tạp chất và bảo toàn hoạt tính của enzyme. Các phương pháp thường được sử dụng bao gồm ly tâm, kết tủa, sắc ký, và lọc màng. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của asparaginase và các tạp chất cần loại bỏ. Trong đề tài, nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu thu hồi asparaginase, phương pháp xác định asparaginase, xác định hoạt độ asparaginase để xây dựng quy trình công nghệ sản xuất asparaginase.

III. Phương pháp sản xuất Asparaginase tái tổ hợp hiệu quả cao

Sản xuất asparaginase tái tổ hợp thường sử dụng các hệ thống biểu hiện gen trong vi sinh vật. Escherichia coli (E. coli), Pichia pastoris (P. pastoris) và Aspergillus niger (A. niger) là những chủng được sử dụng phổ biến. Mỗi chủng có ưu và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào yêu cầu cụ thể của sản phẩm và quy trình sản xuất. Các kỹ thuật kỹ thuật di truyền tiên tiến được áp dụng để tối ưu hóa quá trình biểu hiện gen và tăng hiệu suất sản xuất.

3.1. Biểu hiện gen Asparaginase trong hệ thống E. coli tái tổ hợp

E. coli là một hệ thống biểu hiện gen phổ biến do tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy và có nhiều công cụ kỹ thuật di truyền được phát triển. Tuy nhiên, việc biểu hiện asparaginase trong E. coli có thể gặp khó khăn do sự hình thành thể vùi và thiếu các hệ thống biến đổi sau dịch mã cần thiết. Do đó, việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và sử dụng các chủng E. coli đặc biệt có thể giúp cải thiện hiệu suất sản xuất asparaginase.

3.2. Sử dụng nấm men Pichia pastoris để biểu hiện gen Asparaginase

P. pastoris là một hệ thống biểu hiện gen mạnh mẽ, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai với hiệu suất cao. P. pastoris có hệ thống biến đổi sau dịch mã tương tự như tế bào eukaryote, giúp tạo ra asparaginase có cấu trúc và chức năng tương tự như enzyme tự nhiên. Theo khóa luận, nhóm đề tài đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất asparaginase từ chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp mang gen pPIC9asp2 trên hệ thống lên men chìm sục khí 5 lít.

3.3. Biểu hiện gen Asparaginase trong nấm sợi Aspergillus niger

A. niger là một chủng vi sinh vật an toàn và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. A. niger có khả năng tiết protein ngoại bào, giúp đơn giản hóa quy trình thu hồi và tinh sạch asparaginase. Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM đã sản xuất và thương mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng là A. niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

IV. Nghiên cứu quy trình sản xuất Asparaginase trên hệ thống 100 lít

Để mở rộng quy mô sản xuất asparaginase, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm lên men trên hệ thống 100 lít. Mục tiêu là xác định các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình lên men và đánh giá hiệu suất sản xuất asparaginase ở quy mô lớn hơn. Các yếu tố như tốc độ khuấy, nhiệt độ, pH và nồng độ oxy hòa tan được kiểm soát và điều chỉnh để đạt hiệu quả cao nhất.

4.1. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sản xuất Asparaginase

Tốc độ khuấy ảnh hưởng đến sự hòa tan của oxy, sự phân bố chất dinh dưỡng và sự ổn định của tế bào vi sinh vật. Quá trình sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít được thực hiện ở các tốc độ khuấy khác nhau (250 rpm, 300 rpm, 350 rpm) để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất sản xuất enzyme. Kết quả cho thấy tốc độ khuấy tối ưu cần được xác định để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như hiệu suất sản xuất asparaginase cao nhất.

4.2. Thu hồi Asparaginase sau quá trình lên men bằng phương pháp ly tâm

Sau quá trình lên men, asparaginase được thu hồi từ dịch lên men bằng phương pháp ly tâm. Quá trình này giúp loại bỏ các tế bào vi sinh vật và các chất rắn lơ lửng khác. Dịch ly tâm sau đó có thể được sử dụng cho các bước tinh sạch tiếp theo. Hiệu quả của quá trình ly tâm phụ thuộc vào tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm và loại máy ly tâm được sử dụng.

4.3. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất Asparaginase trên hệ thống 100 lít

Dựa trên kết quả nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít. Quy trình này bao gồm các bước: chuẩn bị môi trường, cấy giống, lên men, thu hồi, tinh sạch và kiểm tra chất lượng. Mục tiêu là tạo ra một quy trình sản xuất asparaginase hiệu quả, ổn định và có thể áp dụng trong thực tế.

V. Ứng dụng Asparaginase tái tổ hợp trong giảm Acrylamide thực phẩm

Asparaginase có vai trò quan trọng trong việc giảm hàm lượng acrylamide trong thực phẩm nướng. Việc sử dụng asparaginase tái tổ hợp giúp chuyển đổi asparagine thành acid aspartic và ammonia, ngăn chặn sự hình thành acrylamide trong quá trình nướng. Ứng dụng này có tiềm năng lớn trong việc cải thiện an toàn thực phẩm và giảm nguy cơ ung thư cho người tiêu dùng.

5.1. Cơ chế giảm Acrylamide bằng Asparaginase trong sản xuất bánh

Asparaginase hoạt động bằng cách thủy phân asparagine, một axit amin tự do có trong nhiều loại thực phẩm, thành axit aspartic và ammonia. Asparagine là một trong những tiền chất chính của acrylamide, một chất gây ung thư tiềm ẩn được hình thành trong quá trình nướng hoặc chiên ở nhiệt độ cao. Do đó, việc loại bỏ asparagine bằng asparaginase giúp giảm đáng kể sự hình thành acrylamide.

5.2. Ứng dụng Asparaginase tái tổ hợp vào quy trình sản xuất bánh quy

Asparaginase tái tổ hợp có thể được thêm vào bột bánh quy trước khi nướng. Liều lượng asparaginase cần thiết phụ thuộc vào hàm lượng asparagine trong bột bánh quy và mức giảm acrylamide mong muốn. Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM đã sản xuất và thương mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng là A. niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

5.3. Nghiên cứu hiệu quả giảm Acrylamide khi dùng Asparaginase

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sử dụng asparaginase có thể giảm hàm lượng acrylamide trong bánh quy từ 50% đến 90% mà không ảnh hưởng đến hương vị, màu sắc hoặc cấu trúc của sản phẩm. Các nghiên cứu cũng cho thấy asparaginase có thể được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm khác nhau, bao gồm khoai tây chiên, bánh mì và ngũ cốc.

VI. Kết luận và triển vọng phát triển của Asparaginase tái tổ hợp

Nghiên cứu sản xuất asparaginase tái tổ hợp từ vi sinh vật mở ra triển vọng lớn trong nhiều lĩnh vực. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, giảm chi phí và mở rộng ứng dụng sẽ góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu của Phạm Nguyệt Hằng là một đóng góp quan trọng trong lĩnh vực này.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu về sản xuất Asparaginase

Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc sản xuất asparaginase tái tổ hợp từ vi sinh vật là khả thi và hiệu quả. Việc tối ưu hóa điều kiện lên men và quy trình thu hồi, tinh sạch có thể giúp tăng hiệu suất sản xuất và giảm chi phí. Đặc biệt là kết quả của nhóm đề tài đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất asparaginase từ chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp mang gen pPIC9asp2 trên hệ thống lên men chìm sục khí 5 lít.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo về sản xuất Asparaginase hiệu quả

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật mới có khả năng sản xuất asparaginase với hiệu suất cao hơn, phát triển các quy trình lên men và thu hồi, tinh sạch hiệu quả hơn, và nghiên cứu ứng dụng của asparaginase trong các lĩnh vực mới.

6.3. Tiềm năng thương mại hóa Asparaginase trong tương lai

Asparaginase có tiềm năng thương mại hóa lớn trong tương lai, đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm. Việc giảm hàm lượng acrylamide trong thực phẩm và điều trị ung thư là những ứng dụng quan trọng có thể mang lại lợi ích to lớn cho xã hội.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong công nghệ chế biến thực phẩm, việc xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao (trên 120°C) qua các quá trình nướng, chiên, quay đối với nguồn nguyên liệu giàu carbohydrate nhưng ít protein (như bột mì, khoai tây) dẫn đến sự hình thành acrylamide (C3H5NO). Hợp chất này được xác định là sản phẩm phụ sinh ra từ phản ứng Maillard giữa đường khử và axit amin tự do L-asparagine. Các nghiên cứu độc chất học chỉ ra rằng acrylamide gây độc hại gen, phá hủy tế bào mầm dẫn đến biến đổi di truyền, gây tổn thương hệ thần kinh trung ương lẫn thần kinh ngoại biên, đồng thời có nguy cơ cao gây ung thư trên động vật thực nghiệm.

Để giải quyết vấn đề an toàn thực phẩm trên, việc sử dụng enzym L-asparaginase được xem là giải pháp khả thi nhất. Enzym này xúc tác quá trình thủy phân L-asparagine thành axit aspartic và amoniac, loại bỏ cơ chất của phản ứng Maillard, qua đó làm giảm từ 50% đến 90% lượng acrylamide sinh ra mà không làm thay đổi giá trị dinh dưỡng cũng như cảm quan của sản phẩm bánh nướng. Trên thế giới, các tập đoàn như Novozymes (chế phẩm Acrylaway® từ Aspergillus oryzae) và DSM (chế phẩm PreventASe™ từ Aspergillus niger) đã thương mại hóa thành công nguồn enzym này. Tại Việt Nam, nhóm đề tài "Nghiên cứu sản xuất enzym asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh nướng" đã biểu hiện thành công enzym trên chủng nấm men Pichia pastoris SMD1168 mang gen pPIC9asp2 ở quy mô lên men 5 lít, đạt hoạt độ 114 U/ml và tạo chế phẩm đông khô đạt 3800 U/g. Khóa luận này được thực hiện nhằm nâng cấp và hoàn thiện quy trình lên men ở quy mô pilot lớn hơn.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể:

• Xác định các thông số công nghệ của quy trình lên men sản xuất asparaginase từ chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris SMD1168-pPIC9asp2 trên hệ thống thiết bị lên men chìm sục khí dung tích 100 lít.

Để đạt được mục tiêu nêu trên, khóa luận triển khai 5 nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 250 rpm.
2. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 300 rpm.
3. Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 350 rpm.
4. Nghiên cứu công đoạn thu hồi asparaginase từ dịch lên men.
5. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít.

Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris SMD1168 mang gen pPIC9asp2. Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch (Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch) phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển công nghệ sinh học (Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội), hoàn thành vào tháng 5 năm 2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về enzym L-asparaginase (EC 3.1 hay L-asparaginase amidohydrolase), cấu trúc phân tử dạng đại phân tử gồm 4 tiểu phần với tổng số 321 axit amin, khối lượng phân tử khoảng 160 kDa, công thức hóa học C1377H2208N382O442S17. Enzym có điểm đẳng điện pI từ 5,0 đến 6,8; khoảng pH bền vững từ 6,0 đến 8,5; dạng tinh thể hình kim hoặc hình trụ, tan trong nước và không tan trong dung môi hữu cơ. Tiêu chuẩn an toàn của chủng sinh enzym và sản phẩm thương mại được tham chiếu theo chứng nhận GRAS của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cùng các quy định an toàn phụ gia thực phẩm của Hội đồng chuyên gia FAO/WHO (JECFA).

Chủng vi sinh vật sử dụng là Pichia pastoris SMD1168 mang vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen asp2. Gen asp2 là gen mã hóa asparaginase từ Aspergillus oryzae đã được tối ưu hóa toàn bộ bộ ba mã hóa (codon) để thích ứng với hệ thống dịch mã của nấm men P. pastoris, đạt chỉ số phù hợp 80%.

Hệ thống môi trường nuôi cấy bao gồm:

• Môi trường MD (làm tươi và nhân giống cấp 1): YNB cải biến 1X, 4×10⁻⁵% biotin, 1% glucose.
• Môi trường BMGY (nhân giống cấp 2): đệm phosphate 100 mM (pH 7,0), YNB cải biến 1X, 4×10⁻⁵% biotin, 1% glycerol, 1% cao nấm men, 2% pepton.
• Môi trường BMMY (lên men chính): đệm phosphate 100 mM (pH 7,0), YNB cải biến 1X, 4×10⁻⁵% biotin, 0,5% methanol, 1% cao nấm men, 2% pepton. Dung dịch YNB cải biến 10X được tự pha chế từ Biodizim, Fevintamax, biotin, các muối vi khoáng (CuSO4, KI, Na2MoO4, PAPA, B3, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, Inositol) cùng dung dịch Ca-Na, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2SO4; dung dịch PE bổ sung gồm pepton và cao nấm men.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện trên hệ thống lên men chìm sục khí BIOSTAT® Dplus dung tích 100 lít (Sartorius Stedim Biotech, Đức) với thể tích làm việc 50 lít môi trường BMMY, nhiệt độ cố định 30°C, lưu lượng thổi khí 30 l/phút (tương ứng 0,6 vvm), oxy hòa tan duy trì pO2 ≥ 20% bão hòa. Khảo nghiệm ảnh hưởng của chế độ khuấy được thực hiện ở ba mức: 250 rpm, 300 rpm và 350 rpm. Chế độ cảm ứng methanol được áp dụng ngắt quãng: châm 0,5% methanol tại các thời điểm OD600 đạt 4, 8, 12, 16; khi OD600 đạt xấp xỉ 20 thì bổ sung 5 lít YNB 10X, 3,4 lít dung dịch PE 15X và 500 ml methanol (1%); sau đó tiếp tục châm 1% methanol sau mỗi chu kỳ OD600 tăng thêm 8-10 đơn vị.

Quy trình thu hồi enzym ứng dụng công nghệ lọc tiếp tuyến:

• Tách sinh khối tế bào: sử dụng màng lọc tiếp tuyến kích thước lỗ 0,2 µm (Cross Flow Fiber Cartridge, GE Healthcare).
• Cô đặc enzym: siêu lọc qua màng tiếp tuyến cut-off 10 kDa (GE Healthcare) với áp suất đầu vào nhỏ hơn 5 Bar, áp suất đầu ra nhỏ hơn 2,5 Bar, giảm thể tích xuống 1/30 (cô đặc 30 lần).
• Trao đổi đệm: lọc tiếp tuyến với đệm PBS 1X thể tích gấp 3 lần thể tích dịch cô đặc để loại môi trường.
• Tạo chế phẩm dạng bột: đông khô dịch enzym ở -55°C, áp suất chân không 550 - 450 mmHg, bổ sung chất bảo vệ maltodextrin theo tỷ lệ 0,5:1 (w/v).

Các phương pháp phân tích và kiểm tra hóa sinh:

• Đo mật độ quang học OD600 bằng máy quang phổ để đánh giá đường cong sinh trưởng.
• Điện di SDS-PAGE biến tính trên gel polyacrylamide (gel tách 12,6%, gel cô 5%) để phân tích thành phần protein tổng số.
• Thử hoạt tính bằng zymography: điện di trên gel polyacrylamide không biến tính (gel tách 9%, gel cô 5%), sau đó ép bản gel lên đĩa thạch chứa 1,8% agar, 2,5% L-asparagine và 2,5% chỉ thị màu phenol đỏ, ủ ở 37°C trong 20 phút.
• Định lượng hoạt độ asparaginase: thực hiện theo phương pháp so màu Nessler (Imada và cộng sự, 1973), đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 450 nm xác định ion amoni giải phóng qua phản ứng tạo phức Iodua dimercua amoni [HgO.Hg(NH2)I] màu vàng. Một đơn vị hoạt độ (U) tương ứng lượng enzym giải phóng 1 µmol NH3 trong 1 phút ở 45°C.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Chương tổng quan tập trung hệ thống hóa cơ sở khoa học và thực tiễn về asparaginase và acrylamide. Tác giả phân tích nguồn gốc phân bố asparaginase trong tự nhiên (vi khuẩn E. coli, Erwinia caratovora, Serratia marcescens; nấm sợi Aspergillus; thực vật); cấu tạo phân tử và hai lĩnh vực ứng dụng chính là y học (điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính) và thực phẩm (ngăn ngừa acrylamide). Về độc chất acrylamide, tác giả trình bày cơ chế hình thành từ phản ứng Maillard khi gia nhiệt trên 120°C, các tác hại bệnh lý nghiêm trọng và 4 nhóm giải pháp giảm thiểu, khẳng định phương pháp sử dụng asparaginase là tối ưu nhất vì không làm biến đổi quy trình sản xuất bánh nướng và giữ nguyên cảm quan sản phẩm. Phần tổng quan cũng tóm tắt công nghệ sản xuất asparaginase thương mại của hai hãng Novozymes và DSM theo tiêu chuẩn GMP và tiêu chuẩn chất lượng ISO 9001, FCC, JECFA. Cuối chương, tác giả khái quát kết quả giai đoạn trước của nhóm nghiên cứu: thiết kế dòng tái tổ hợp P. pastoris SMD1168-pPIC9asp2, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy BMGY/BMMY với YNB cải biến, và thành công trên hệ thống lên men 5 lít làm tiền đề nâng quy mô lên 100 lít.

Phần II: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết nguồn vật liệu, hệ thống máy móc và các bước thực nghiệm. Tác giả công bố đầy đủ nguồn gốc chủng P. pastoris SMD1168 mang gen pPIC9asp2 (bảo quản glycerol ở -80°C); công thức định lượng chi tiết cho 1 lít YNB cải biến 10X (gồm 2 ống Biodizim, 200 µl dung dịch Fevintamax, 100 µl biotin, 10 ml dung dịch vi khoáng và các muối); thành phần các môi trường MD, BMGY, BMMY. Thiết bị phục vụ nghiên cứu gồm hệ thống lên men chìm sục khí BIOSTAT® Dplus dung tích 10 lít và 100 lít, hệ thống lọc tiếp tuyến màng rỗng sợi 0,2 µm và 10 kDa của GE Healthcare, cùng các thiết bị đo quang phổ, điện di Bio-Rad, máy đông khô. Các quy trình kỹ thuật được chuẩn hóa từng bước: làm tươi giống trên đĩa MD (30°C, 48 giờ); nhân giống cấp 1 trong bình tam giác 150 ml (30°C, 220 rpm, 24 giờ); nhân giống cấp 2 trong bình lên men 10 lít chứa 6 lít BMGY (30°C, 220 rpm, 24 giờ, đạt OD600 từ 6-8); tiếp giống vào nồi 100 lít chứa 50 lít BMMY với OD600 ban đầu bằng 1; vận hành lên men và kiểm soát nồng độ cơ chất cảm ứng; quy trình siêu lọc tiếp tuyến cô đặc 30 lần kết hợp trao đổi đệm; các bước pha gel và điện di SDS-PAGE, kỹ thuật zymography trên thạch phenol đỏ; và phương trình xây dựng đường chuẩn NH3 bằng thuốc thử Nessler.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận trình bày dữ liệu thực nghiệm qua 5 nội dung chính:

• Khảo nghiệm lên men ở tốc độ khuấy 250 rpm: Chủng nấm men sinh trưởng chậm trong 4 giờ đầu, sau đó tăng nhanh và đạt đỉnh sinh khối OD600 = 44,12 tại thời điểm 40 giờ, sau đó giảm dần do bước vào pha suy vong. Hoạt độ enzym tăng dần từ 26 U/ml (10 giờ) lên đỉnh 90 U/ml (40 giờ) rồi hạ xuống 82 U/ml (44 giờ). So với quy mô 5 lít (30-33 giờ, OD650 đạt 54-56, hoạt tính 114 U/ml), tốc độ 250 rpm cho thời gian lên men dài hơn, sinh khối và hoạt tính đều thấp hơn.
• Khảo nghiệm lên men ở tốc độ khuấy 300 rpm: Sinh khối tăng trưởng nhanh vượt trội, đạt đỉnh OD600 = 55,84 tại thời điểm 31 giờ. Hoạt độ asparaginase tăng liên tục từ 48 U/ml (12 giờ) lên cực đại 125 U/ml tại thời điểm 31 giờ, sau đó giảm còn 110 U/ml tại 32 giờ. Tốc độ sinh trưởng và thời gian lên men tương đương quy mô 5 lít nhưng hoạt độ enzym thu được cao hơn (125 U/ml so với 114 U/ml).
• Khảo nghiệm lên men ở tốc độ khuấy 350 rpm: Sinh khối đạt đỉnh OD600 = 46,17 tại 32 giờ và hoạt độ cực đại đạt 98 U/ml tại 32 giờ (giảm xuống 91 U/ml sau 33 giờ). Quá trình lên men tạo lượng bọt rất lớn, phải bổ sung liên tục dầu phá bọt qua 11 mốc thời gian (tổng lượng tiêu hao lớn). Tác giả thảo luận rằng việc tạo bọt làm giảm diện tích thoáng khí và giảm hiệu quả truyền oxy, đồng thời tốc độ khuấy quá cao gây lực cắt mạnh làm tổn thương cấu trúc tế bào nấm men và tăng nguy cơ nhiễm tạp. Do đó, tốc độ 300 rpm được chọn là thông số tối ưu.
• Kết quả thu hồi và phân tích sinh hóa: Sử dụng lọc tiếp tuyến 0,2 µm loại triệt để xác tế bào; siêu lọc màng 10 kDa giúp cô đặc dịch enzym 30 lần và trao đổi sạch môi trường qua đệm PBS 1X. Điện di SDS-PAGE cho thấy xuất hiện băng kép rõ nét trong khoảng 50 - 60 kDa ở các mẫu dịch lên men quy mô 5 lít (ASP5), quy mô 100 lít (ASP100) và mẫu sau trao đổi đệm (ASP), trong khi mẫu đối chứng âm không mang gen (pPIC9) không xuất hiện băng này. Băng kép được giải thích do hiện tượng glycosyl hóa khác nhau của protein tái tổ hợp khi tiết ra môi trường. Thử nghiệm zymography không biến tính trên đĩa thạch asparagine bổ sung phenol đỏ cho thấy tại các mẫu ASP5, ASP100, ASP hình thành vệt phân giải màu vàng nhạt trong suốt ở kích thước phân tử trên 130 kDa (do enzym tồn tại ở dạng phức hợp polyme hoạt tính xúc tác giải phóng axit aspartic làm giảm pH tại chỗ), khẳng định enzym biểu hiện có hoạt tính sinh học nguyên vẹn.
• Hoàn thiện quy trình công nghệ 100 lít: Tổng hợp sơ đồ công nghệ hoàn chỉnh từ khâu làm tươi giống, nhân giống hai cấp, lên men chìm 50 lít môi trường BMMY trong 32-33 giờ (300 rpm, cấp khí 0,4-0,6 vvm, châm methanol ngắt quãng), tách tế bào qua màng 0,2 µm, siêu lọc tiếp tuyến cô đặc 30 lần qua màng 10 kDa, trao đổi đệm PBS 1X gấp 3 lần thể tích, bổ sung chất bảo vệ maltodextrin (tỷ lệ 0,5:1 w/v) và đông khô (-55°C, 550-450 mmHg) tạo chế phẩm bột có hoạt tính 3800 U/g.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã so sánh thực nghiệm động học phát triển và sinh tổng hợp enzym của chủng P. pastoris SMD1168-pPIC9asp2 trên hệ thống lên men 100 lít BIOSTAT® Dplus ở ba chế độ khuấy khác nhau:

Thông số theo dõi	Tốc độ khuấy 250 rpm	Tốc độ khuấy 300 rpm	Tốc độ khuấy 350 rpm
Thời điểm đạt sinh khối cực đại	40 giờ	31 giờ	32 giờ
Mật độ tế bào cực đại (OD600nm)	44,12	55,84	46,17
Dải biến thiên pH trong quá trình	6,58 - 7,04	6,47 - 7,08	6,50 - 7,12
Thời điểm đạt hoạt tính cực đại	40 giờ	31 giờ	32 giờ
Hoạt độ enzym cực đại trong dịch thô	90 U/ml	125 U/ml	98 U/ml
Mức độ tạo bọt và bổ sung chất phá bọt	Rất ít tạo bọt, không bổ sung	Tạo bọt ít, bổ sung 2 lần (2 ml)	Tạo bọt liên tục, bổ sung 11 lần (khoảng 20,5 ml)
Đánh giá hiệu quả công nghệ	Thời gian kéo dài, năng suất thấp	Tối ưu về thời gian, sinh khối và hoạt độ	Lực cắt cao, bọt cản oxy, năng suất giảm

Kết quả công đoạn thu hồi và tinh chế kỹ thuật:

• Quá trình tách tế bào bằng màng lọc tiếp tuyến 0,2 µm thu được dịch trong không chứa tế bào, thay thế hiệu quả cho biện pháp ly tâm.
• Quá trình siêu lọc màng 10 kDa cô đặc dịch enzym xuống 1/30 thể tích ban đầu, đưa hoạt tính dịch enzym cô đặc đạt trên 2500 U/l.
• Quá trình đông khô có bổ sung maltodextrin tỷ lệ 0,5:1 (w/v) ở -55°C và áp suất 550 - 450 mmHg tạo ra chế phẩm enzym dạng bột đạt hoạt tính 3800 U/g với độ ẩm 5%.

Về đóng góp khoa học và công nghệ so với các nghiên cứu trước:

• Nâng quy mô thành công quá trình lên men sản xuất asparaginase tái tổ hợp từ hệ thống 5 lít trong phòng thí nghiệm lên hệ thống lên men chìm sục khí pilot 100 lít, xác định chính xác tốc độ khuấy tối ưu là 300 rpm cho hoạt độ dịch lên men đạt 125 U/ml (cao hơn mức 114 U/ml ở quy mô 5 lít).
• Thay thế hoàn toàn phương pháp ly tâm gián đoạn (5000 rpm trong 10 phút áp dụng ở quy mô 5 lít) bằng công nghệ lọc màng tiếp tuyến 0,2 µm, tạo khả năng liên tục hóa công đoạn tách sinh khối cho quy mô công nghiệp.
• Ứng dụng thành công công thức môi trường tự pha chứa YNB cải biến giá thành thấp trên quy mô lớn, chứng minh chủng vẫn sinh trưởng ổn định và đạt hoạt tính cao tương đương hóa chất thương mại ngoại nhập.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số hạn chế kỹ thuật trong quá trình thực nghiệm:

• Tốc độ khuấy 350 rpm làm gia tăng hiện tượng tạo bọt nghiêm trọng, việc phải châm liên tục dầu phá bọt làm giảm độ truyền oxy và tiềm ẩn nguy cơ nhiễm vi sinh vật ngoại lai.
• Enzym tái tổ hợp khi tiết ra ngoài môi trường bị glycosyl hóa ở các mức độ khác nhau tùy thuộc điều kiện lên men, tạo ra dải phân tử phân tán (băng kép 50 - 60 kDa trên SDS-PAGE), gây khó khăn cho việc định lượng chính xác hàm lượng protein tuyệt đối.
• Nghiên cứu mới dừng lại ở việc tạo ra chế phẩm enzym kỹ thuật dạng bột ở quy mô pilot và đánh giá hoạt tính bằng phản ứng hóa sinh in vitro, chưa tiến hành thử nghiệm ứng dụng trực tiếp chế phẩm vào công đoạn nhào bột và nướng bánh trên dây chuyền sản xuất thực phẩm công nghiệp để định lượng tỷ lệ suy giảm acrylamide thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định là: nghiên cứu giải pháp kiểm soát bọt tự động ổn định hơn; phân tích cấu trúc glycan và tinh sạch sâu enzym; thử nghiệm bổ sung chế phẩm bột asparaginase thu được vào quy trình sản xuất các sản phẩm bánh nướng cụ thể để đánh giá hiệu quả giảm acrylamide và tính chất cảm quan thực phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, Kỹ thuật vi sinh và Kỹ thuật hóa học đang thực hiện các đề tài về công nghệ lên men vi sinh vật tái tổ hợp, đặc biệt là hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris.
• Các kỹ sư công nghệ quan tâm đến bài toán chuyển giao quy mô (scale-up) từ thiết bị lên men phòng thí nghiệm (5 lít) sang hệ thống pilot bán công nghiệp (100 lít), bao gồm kinh nghiệm thiết lập thông số sục khí (vvm), kiểm soát oxy hòa tan (pO2), tốc độ khuấy chống lực cắt và chế độ châm cơ chất cảm ứng methanol theo mật độ tế bào.
• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm cần tham khảo quy trình phân tích hoạt tính enzym đặc thù: phương pháp zymography trên thạch có chất chỉ thị pH phenol đỏ để định tính nhanh hoạt tính thủy phân asparagine, quy trình đo quang so màu với thuốc thử Nessler, và quy trình vận hành hệ thống lọc tiếp tuyến màng rỗng sợi để cô đặc protein.

Câu hỏi thường gặp

1. Tốc độ khuấy nào được kết luận là tối ưu cho quá trình lên men quy mô 100 lít và các thông số đạt được là bao nhiêu?
Tốc độ khuấy tối ưu là 300 rpm. Tại chế độ này, mật độ tế bào đạt đỉnh OD600 = 55,84 sau 31 giờ nuôi cấy, hoạt độ enzym trong dịch lên men thô đạt cực đại 125 U/ml (cao hơn mức 114 U/ml của hệ thống 5 lít trước đó). Quá trình lên men diễn ra ổn định, ít tạo bọt (chỉ cần bổ sung 2 ml dầu phá bọt).

2. Tại sao việc tăng tốc độ khuấy lên 350 rpm lại làm giảm sinh khối và hoạt tính enzym so với mức 300 rpm?
Ở tốc độ 350 rpm, lực khuấy quá mạnh tạo ra lực cắt lớn làm va đập cơ học giữa tế bào nấm men và thành thiết bị, gây tổn hại cấu trúc tế bào. Đồng thời, tốc độ này làm bọt trào mạnh và liên tục; việc phải châm một lượng lớn dầu phá bọt (11 lần với tổng lượng trên 20 ml) làm giảm độ thoáng khí và cản trở quá trình hòa tan oxy vào dịch nuôi cấy, từ đó ức chế hô hấp và sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật.

3. Khâu thu hồi enzym ở quy mô 100 lít có điểm cải tiến kỹ thuật cốt lõi nào so với quy mô 5 lít?
Ở quy mô 5 lít, xác tế bào nấm men được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm gián đoạn ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Khi nâng quy mô lên 100 lít, công đoạn này được cải tiến hoàn toàn bằng việc ứng dụng hệ thống lọc màng tiếp tuyến 0,2 µm (Cross Flow Fiber Cartridge), cho phép tách liên tục toàn bộ tế bào nấm men để thu dịch trong mà không cần thiết bị ly tâm dung tích lớn.

4. Vì sao trên bản điện di SDS-PAGE enzym asparaginase lại xuất hiện dưới dạng băng kép ở khoảng 50 - 60 kDa dù lý thuyết chỉ khoảng 39,5 - 40 kDa?
Hiện tượng xuất hiện băng kép trong khoảng 50 - 60 kDa là do enzym asparaginase tái tổ hợp khi được tế bào chủ nấm men Pichia pastoris tiết ra môi trường đã bị biến đổi sau dịch mã qua quá trình glycosyl hóa ở các mức độ khác nhau. Theo dữ liệu tham khảo trong văn bản, enzym có 7 vị trí glycosyl hóa; khi xử lý enzym bằng endoglycosidase H để cắt bỏ các gốc đường, khối lượng phân tử phân tích sẽ trở về mức 40 - 42 kDa.

5. Cơ chế xác định hoạt tính của asparaginase trong phương pháp zymography dùng chỉ thị phenol đỏ là gì?
Bản gel polyacrylamide không biến tính sau khi điện di được ép lên đĩa thạch chứa agar 1,8%, L-asparagine 2,5% và chất chỉ thị phenol đỏ 2,5%, sau đó ủ ở 37°C trong 20 phút. Asparaginase hoạt tính sẽ phân giải L-asparagine thành axit aspartic và amoniac. Khí amoniac bay hơi, axit aspartic giải phóng làm giảm pH cục bộ tại vị trí có enzym, khiến chỉ thị phenol đỏ đổi màu từ cam/hồng sang vệt màu vàng nhạt trong suốt tại vùng phân tử có kích thước lớn hơn 130 kDa.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Nguyệt Hằng đã hoàn thiện thành công các thông số công nghệ của quá trình lên men sản xuất enzym L-asparaginase tái tổ hợp từ Pichia pastoris SMD1168-pPIC9asp2 trên hệ thống lên men chìm sục khí BIOSTAT® Dplus 100 lít, xác định chế độ khuấy 300 rpm là tối ưu với hoạt độ dịch lên men đạt 125 U/ml tại thời điểm 31 giờ. Nghiên cứu đã chuẩn hóa quy trình thu hồi không dùng ly tâm nhờ hệ thống lọc màng tiếp tuyến 0,2 µm và màng cô đặc 10 kDa, kết hợp đông khô bổ sung chất bảo vệ maltodextrin để thu được chế phẩm dạng bột đạt hoạt tính 3800 U/g và độ ẩm 5%. Kết quả thực nghiệm này cung cấp đầy đủ dữ liệu công nghệ tin cậy, làm tiền đề trực tiếp cho việc ứng dụng enzym asparaginase vào kiểm soát độc chất acrylamide trong sản xuất thực phẩm quy mô công nghiệp tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Asparaginase (EC 3.1) hay còn có tên gọi khác là L-asparaginase amidohydrolase; asparaginase II; L-asparaginase; colaspase; elspar; leunase; crasnitin; α-asparaginase. Asparaginase là một đại phân tử có cấu trúc phân tử là C1377H2208N382O442S17. Asparaginase là enzym xúc tác cho quá trình thủy phân axit amin L-asparagine thành axit aspartic và ammonia. Hiện nay, asparaginase thường được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dược phẩm.

Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase được sử dụng như là chất phụ gia được dùng để bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm nhằm làm giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm. Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM (Pháp) đã sản xuất và thương mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng là A. niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Tên thương mại của sản phẩm asparaginase từ A.

oryzae là Acrylaway® còn asparaginase từ A. Niger là PreventASeTM. Trong khuôn khổ của đề tài này, nhóm đề tài của đề tài "Nghiên cứu sản xuất enzym asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh nướng" đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất asparaginase từ chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp mang gen pPIC9asp2 trên hệ thống lên men chìm sục khí 5 lít.

Bằng phương pháp điện di kiểm tra trên gel acrylamide, ép gel định tính hoạt tính và định lượng bằng phương pháp so màu cho thấy trong các lần lên men, asparaginase đã được biểu hiện thành công và có hoạt tính. Tạo chế phẩm asparaginase dạng bột bằng phương pháp đông khô có bổ sung chất bảo vệ là maltodextrin với tỷ lệ maltodextrin : dịch enzym là 0,5:1 (w/v). Chế phẩm có hoạt độ asparaginase khoảng 3800 U/g, độ ẩm 5%. Với mong muốn sản xuất thử nghiệm asparaginase ở quy mô lớn, chúng tôi đã tiến hành thực hiện nội dung ”Nghiên cứu công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít” dựa trên các thông số của quy trình lên men trên hệ thống lên men chìm sục khí 5 lít.

Phạm Nguyệt Hằng 1 Lớp: CNSH-1103 MỤC TIÊU Có được các thông số công nghệ của quy trình lên men sản xuất asparaginase từ P. pastoris SMD1168-pPIC9asp2 trên hệ thống thiết bị lên men chìm sục khí dung tích 100 lít NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 250 rpm - Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 300 rpm - Nghiên cứu sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ở tốc độ khuấy 350 rpm - Nghiên cứu thu hồi asparaginase - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít Phạm Nguyệt Hằng 2 Lớp: CNSH-1103 PHẦN I: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung về asparaginase 1. Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên Asparaginae được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên như thực vật, vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn vv.

Vi sinh vật thường được sử dụng cho sản xuất L-asparaginase là Erwinia caratovora, Bacillus sp., Corynebacterium glutamicum và E. coli (Ashraf et al, 2003; Cammack. et al, 1972; Wade. Nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn thường được sử dụng cho sản xuất L-asparaginase là Erwinia caratovora, Bacillus sp., Corynebacterium glutamicum và E.

coli (Ashraf et al, 2003; Cammack. et al, 1972; Wade. Tổng hợp asparaginase từ hai dòng đột biến, WF và 933 của Serratia marcescens được nghiên cứu. Thành phần môi trường lên men khác nhau ảnh hưởng đến sản lượng enzym.

Sản lượng enzyme tối đa khi trong môi trường lên men chứa glycerol peptone. Bên cạnh đó, quá trình lên men sản xuất asparaginase cũng chịu ảnh hưởng của một số tác nhân như nguồn carbon, nguồn nitơ với các thông số khác như độ pH, nhiệt độ. Nguồn nấm men và nấm mốc: Sản xuất của asparaginase từ các chủng khác nhau của nấm đã được ghi nhận. Các chủng sản xuất asparaginase thường sử dụng là Aspergillus tamarii, Aspergillus terreus, A.

Nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn phân lập từ đất vùng rễ của cây thuốc Thái có khả năng sinh tổng hợp asparaginase. Xạ khuẩn biển cũng được phân lập từ các mẫu trầm tích vùng ven biển Parangipettai và Cochin ở Nam Ấn Độ. Sản xuất và tinh chế asparaginase bởi Streptomyces tendae TK-VL_333. Nguồn thực vật: Một loạt các loài thực vật được mô tả có khả năng sinh asparaginase.

Ớt xanh (Capsicum annum L.) và me (Tamarindus indica) chứa lượng asparaginase nhất định. Gen mã hóa cho enzyme asparaginase được phân lập từ thực vật bởi Lupinus angustifolius. Tuy nhiên, asparaginase thu từ các chủng tự nhiên thường có sản lượng thấp, như E. coli 0 - 255 U/g (đơn vị/g tế bào khô), Erwinia caratovora 40 - 450 U/g, Serratia marcescens 100 - 335 U/g (Gulati et al.

niger 70 U/l (Ferrara et Phạm Nguyệt Hằng 3 Lớp: CNSH-1103 al. Cấu tạo và đặc tính Asparaginase (EC 3.1) hay còn có tên gọi khác là L-asparaginase amidohydrolase; asparaginase II; L-asparaginase; colaspase; elspar; leunase; crasnitin; α-asparaginase. Asparaginase là một đại phân tử có cấu trúc phân tử là C1377H2208N382O442S17. Asparaginase là enzym xúc tác cho quá trình thủy phân axit amin L-asparagine thành axit aspartic và ammonia.

L-asparaginase là một enzym bao gồm 4 tiểu phần với tổng cộng 321 amino acid. Tinh thể hình kim hay hình trụ, rất tan trong nước, không tan trong methanol, acetone, chloroform. Độ bền vững: dạng tinh thể bền với nhiệt, pH, ánh sáng. Khoảng pH bền vững 6,0 - 8,5.

Điểm đẳng điện trong khoảng từ 5,0 - 6,8. Khối lượng phân tử khoảng 160 kDa. Nhiệt độ tối ưu của một số vi sinh vật cho sản xuất enzym khoảng 37oC. Ứng dụng trong y học Asparaginase được ứng dụng để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính (ALL).

Nó cũng có thể được sử dụng để điều trị một số căn bệnh về máu khác. Asparaginase làm phân hủy một hóa chất trong các tế bào khối u. Các tế bào khối u cần chất này để làm cho protein tạo ra các tế bào ung thư khác. Mô bình thường tổng hợp L-asparagine với một lượng đủ cho quá trình tổng hợp protein.

Hầu hết các mô khối u cần tổng hợp asparaginase từ bên ngoài để sinh trưởng. Asparaginase có tác dụng làm ngăn cản sự tổng hợp protein của khối u. Nó gây chết tế bào bằng cách hoạt hóa quá trình gây chết tế bào theo chương trình. Do L-asparagine là chất nền thiết yếu cho sự tăng trưởng của tế bào khối u nên có thể giảm bằng cách tiêm asparaginase làm cạn nguồn dinh dưỡng cho phát triển khối u.

Phạm Nguyệt Hằng 4 Lớp: CNSH-1103 Hình 1. Cơ chế tác dụng của asparaginase trong quá trình phát triển của các mô khối u 1. Ứng dụng trong thực phẩm Asparaginase có thể được sử dụng như một chất phụ gia trong chế biến thực phẩm nhằm làm giảm sự hình thành acrylamide. Acrylamide là một hợp chất hóa học, hình thành trong các loại thực phẩm giàu tinh bột khi được nướng hoặc chiên.

Trong thời gian làm nóng asparagine và đường khử trong các loại thực phẩm giàu tinh bột được chuyển đổi thành acrylamide trong một quá trình được gọi là phản ứng Maillard. Phản ứng cho các loại thực phẩm nướng hoặc chiên màu nâu, vỏ và hương vị nướng. Sử dụng asparaginase trước khi nướng hay chiên thực phẩm làm chuyển đổi asparagine thành acid aspartic và amoni. Kết quả là, asparagine không thể tham gia vào phản ứng Maillard và do đó làm giảm sự hình thành acrylamide.

Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM đã sản xuất và thương mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng là A. niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm. Tên thương mại của sản phẩm asparaginase từ A. oryzae là Acrylaway®L (dạng lỏng) và Acrylaway®3500 BG (dạng bột), còn asparaginase từ A.

niger là PreventASeTML (dạng lỏng) và PreventASeTMW, PreventASeTMM (dạng bột). Quy trình sản xuất thực hiện theo tiêu chuẩn thực hành sản xuất tốt (GMP). Chủng sản xuất và chế phẩm enzym thương mại đều được FDA chứng nhận an toàn theo GRAS (Generally Recognized as Safe). Giới thiệu về acrylamide 1.

Khả năng gây bệnh Acrylamide là một hợp chất hóa học có công thức hóa học là C3H5NO. Acrylamide là thành phần cấu tạo nên các hợp chất polyacrylamide và acrylamide Phạm Nguyệt Hằng 5 Lớp: CNSH-1103 copolyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp như giấy, nhuộm, chất dẻo, xử lý nước uống và nước thải. Thí nghiệm trên động vật (đối với chuột) cho thấy acrylamide gây ra bệnh ung thư khi sử dụng ở liều lượng cao. Sự lo ngại về acrylamide trong thực phẩm dấy lên từ tháng 4 năm 2002, khi cơ quan quản lý thực phẩm quốc gia Thụy Điển tìm thấy độc tố này trong một số loại thực phẩm chứa nhiều tinh bột khoai tây khi chế biến ở nhiệt độ cao.

Nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy, Thụy Sĩ, Anh và Mỹ sau đó đã làm rõ thêm vấn đề: Không chỉ có tinh bột khoai tây mà các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật giàu carbohydrate, ít protein khác khi được chế biến bằng các phương pháp đòi hỏi phải có nhiệt độ cao (>120oC) như rán, quay, nướng đều có xuất hiện acrylamide. Trong khi đó hiện tượng này không thấy xảy ra ở các thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, cá, sữa,.Và các thực phẩm có nguồn gốc thực vật nhưng được chế biến ở nhiệt độ thấp. Các nghiên cứu cũng cho thấy, khi tiêu thụ acrylamide với hàm lượng cao trong thời gian ngắn sẽ gây ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương. Trong khi đó cho tiêu thụ acrylamide trong thời gian dài với liều lượng thấp gây ảnh hưởng lên thần kinh ngoại biên là chủ yếu.

Triệu chứng như ngủ lơ mơ, ảo giác, lẫn lộn, cảm giác không bình thường, không phối hợp được các động tác. Các chuyên gia y tế cũng cho rằng việc tiếp xúc nhiều với acrylamide sẽ khiển cơ thể đổ mồ hôi, đi tiểu không kiểm soát, buồn nôn, đau mỏi cơ,. Acrylamide là hợp chất độc hại gen với tiềm năng ảnh hưởng lên tế bào mầm từ đó dẫn đến các biến đổi về di truyền. Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm Acrylamide là phản ứng trung gian của quá trình chế biến thực phẩm ở nhiệt độ cao (>120oC).

Nó là sản phẩm phụ của phản ứng Maillard. Ở nhiệt độ cao, aspargine (một acid amin trong thực phẩm) tác dụng với đường khử tạo ra acrylamide. Phản ứng tổng hợp Phản ứng tổng hợp Phạm Nguyệt Hằng 6 Lớp: CNSH-1103 acrylamide acrylamide OH NH2 H NH2 NH2 C=O C=O C=O X X CH CH CH CH2 CH2 CH2 Acrylic acid Acrylamide Acrolein Cacbonyl của đường khử NH2 Phản ứng hình thành acrylamide C=O ở nhiệt độ cao CH2 NH2 CH COOH Asparagine Hình 1. Cơ chế phản ứng hình thành acrylamide 1.