Luận án tiến sĩ về quá trình tiền xử lý và vi sinh vật phân giải vỏ cà phê vối để sản xuất ethanol

Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối để lên men tạo ethanol, góp phần phát triển bền vững.

• Tác giả: Đỗ Viết Phương
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Nguyễn Đoan Duy
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Nghiên Cứu Quá Trình Tiền Xử Lý Và Vi Sinh Vật Phân Giải Vỏ Cà Phê Vối Để Sản Xuất Ethanol
• Loại tài liệu: luận án tốt nghiệp tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. Chương 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa của luận án
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.5. Điểm mới của luận án
• 2. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Nguyên liệu cà phê
• 2.1.1. Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối
• 2.1.2. Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê
• 2.1.3. Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol
• 2.2. Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học)
• 2.2.1. Cấu tạo và tính chất của cellulose
• 2.2.2. Cấu tạo và tính chất của hemicellulose
• 2.2.3. Cấu tạo và tính chất của lignin
• 2.3. Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê
• 2.3.1. Cơ chế phân hủy sinh học cellulose
• 2.3.2. Cơ chế thủy phân hemicellulose
• 2.3.3. Cơ chế phân hủy lignin
• 2.4. Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose
• 2.4.1. Tiền xử lý bằng acid
• 2.4.2. Tiền xử lý bằng kiềm
• 2.4.3. Tiền xử lý bằng vi sinh vật
• 2.5. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus và Trichoderma
• 2.5.1. Giới thiệu về Aspergillus niger
• 2.5.2. Giới thiệu về Trichoderma
• 2.5.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase
• 2.6. Thực trạng sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.6.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới
• 2.6.2. Tình hình sản xuất ethanol ở Việt Nam
• 2.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.7.1. Một số nghiên cứu về tiền xử lý sinh khối lignocellulose
• 2.7.2. Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose
• 3. Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
• 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu
• 3.2.2. Các phương pháp phân tích và đo đạc
• 3.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
• 3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.3.1. Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối
• 3.3.2. Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê
• 3.3.3. Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc
• 3.3.4. Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
• 3.3.5. Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men
• 4. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối
• 4.2. Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
• 4.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol
• 4.2.2. Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol
• 4.2.3. Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
• 4.2.4. Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
• 4.2.5. Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P
• 4.2.6. Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả cà phê
• 4.3. Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc
• 4.3.1. Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma
• 4.3.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc phân lập được
• 4.3.2.1. Định danh năm dòng nấm mốc phân lập được
• 4.3.3. Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T
• 4.3.4. Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối (NH4)2SO4
• 4.3.5. Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối NaCl
• 4.3.6. Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng dung môi ethanol và acetone
• 4.4. Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê bởi hệ enzyme cellulase
• 4.4.1. Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy phân
• 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
• 4.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân
• 4.4.4. Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc T
• 4.4.5. Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân
• 4.5. Nghiên cứu quá trình lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê
• 4.5.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên men
• 4.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được
• 4.5.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được
• 4.5.4. Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được
• 5. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH
• PHỤ LỤC B: BẢNG KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH
• PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu này nhằm xác định phương pháp tiền xử lý tối ưu cho vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta). Vỏ cà phê là một nguồn biomass phong phú, có thể được sử dụng để sản xuất ethanol thông qua quá trình lên men. Việc sử dụng vỏ cà phê không chỉ giúp giảm thiểu chất thải nông nghiệp mà còn tạo ra nguồn năng lượng tái tạo. Nghiên cứu cũng tập trung vào việc thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc, nhằm tối ưu hóa quá trình thủy phân vỏ cà phê. Kết quả cho thấy, việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý phù hợp có thể nâng cao hiệu suất thu hồi đường khử, từ đó tăng cường hiệu quả sản xuất ethanol.

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Sự gia tăng nhu cầu về năng lượng tái tạo đã thúc đẩy nghiên cứu về các nguồn nguyên liệu sinh học. Vỏ cà phê vối, với thành phần lignocellulose phong phú, có tiềm năng lớn trong việc sản xuất ethanol. Việc nghiên cứu quá trình tiền xử lý và vi sinh vật phân giải vỏ cà phê không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn góp phần vào việc phát triển bền vững trong ngành nông nghiệp.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp tiền xử lý khác nhau, bao gồm acid, kiềm, và vi sóng. Các thí nghiệm được thiết kế để khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân này đến mức độ suy giảm hemicellulose và lignin trong vỏ cà phê. Bên cạnh đó, việc phân lập nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn khác nhau cũng được thực hiện. Kết quả cho thấy, chủng nấm Trichoderma asperellum có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhất, đạt 1,17 U/mL sau 48 giờ nuôi cấy. Việc thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và so sánh với enzyme thương mại là một phần quan trọng trong nghiên cứu này.

2.1 Quá trình thu nhận enzyme cellulase

Quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc được thực hiện bằng các tác nhân kết tủa như (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone. Kết quả cho thấy enzyme cellulase thu nhận được có hoạt tính cao hơn so với enzyme thương mại. Việc tối ưu hóa quy trình thu nhận enzyme không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn nâng cao hiệu quả thủy phân vỏ cà phê, từ đó tăng cường khả năng sản xuất ethanol.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp tiền xử lý bằng acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất trong việc loại bỏ hemicellulose và lignin. Cụ thể, 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin được loại bỏ, trong khi vẫn giữ lại 69,5% cellulose. Điều này cho thấy, việc kết hợp các phương pháp tiền xử lý có thể tối ưu hóa quá trình thủy phân và lên men. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt thời gian.

3.1 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý

Các phương pháp tiền xử lý khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong vỏ cà phê. Kết quả cho thấy, phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng đạt hiệu suất khử caffeine và polyphenol cao nhất, với 92,3% và 87,7% tương ứng. Tuy nhiên, do lý do kinh tế, phương pháp trích ly thông thường bằng nước nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol.

IV. Kết luận

Nghiên cứu đã xác định được phương pháp tiền xử lý tối ưu cho vỏ quả cà phê vối, đồng thời thu nhận thành công enzyme cellulase từ nấm mốc. Kết quả cho thấy, việc sử dụng enzyme cellulase thu nhận được có thể cải thiện hiệu suất thủy phân và lên men, từ đó nâng cao khả năng sản xuất ethanol. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các quy trình sản xuất năng lượng tái tạo từ nguồn nguyên liệu sinh học.

4.1 Ý nghĩa thực tiễn

Việc nghiên cứu và ứng dụng các phương pháp tiền xử lý và enzyme sinh học trong sản xuất ethanol từ vỏ cà phê không chỉ giúp giảm thiểu chất thải nông nghiệp mà còn tạo ra nguồn năng lượng tái tạo, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp và năng lượng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Việt Nam là quốc gia xuất khẩu cà phê vối (Coffea robusta) đứng đầu thế giới và đứng thứ hai về tổng sản lượng cà phê nhân xuất khẩu, đạt sản lượng 1.000 tấn cà phê nhân trong năm 2018 (theo số liệu USDA, 2018). Đi kèm với hoạt động chế biến cà phê nhân, khối lượng phụ phẩm thải ra môi trường hàng năm ước tính khoảng 460.000 đến 500.000 tấn vỏ cà phê khô. Nguồn phụ phẩm này chủ yếu bị đốt làm chất đốt sấy nông sản gây ô nhiễm không khí hoặc ủ đống tự phát với hiệu quả chuyển đổi thấp do chưa qua xử lý phù hợp. Trong bối cảnh nhu cầu năng lượng tái tạo gia tăng nhằm thay thế nhiên liệu hóa thạch và cắt giảm phát thải khí nhà kính (việc sử dụng ethanol thay xăng có thể giảm hơn 80% phát thải carbon theo Mussatto et al., 2011), việc chuyển hóa sinh khối lignocellulose từ vỏ quả cà phê thành ethanol sinh học là một hướng tiếp cận kỹ thuật cần thiết.

Tuy nhiên, rào cản kỹ thuật chính đối với vỏ quả cà phê nằm ở hàm lượng lignin cao (chiếm khoảng 17,5% đến 20,07% hoặc lên tới 24,2% theo các phân tích thành phần), kết hợp với hemicellulose tạo thành cấu trúc bảo vệ bao bọc sợi cellulose, cản trở sự tiếp cận của hóa chất và enzyme thủy phân. Bên cạnh đó, vỏ cà phê còn chứa các hợp chất kháng vi sinh vật như caffeine (0,74% – 1,8%) và polyphenol/tannin (1,8% – 2,0%), có khả năng ức chế mạnh mẽ nấm men trong quá trình lên men và nấm mốc trong quá trình sinh tổng hợp enzyme. Ngoài ra, chi phí nhập khẩu các chế phẩm cellulase thương mại còn ở mức cao. Do đó, luận án tiến sĩ ngành Công nghệ thực phẩm (Mã ngành: 62.01) của nghiên cứu sinh Đỗ Viết Phương, thực hiện tại Trường Đại học Cần Thơ dưới sự hướng dẫn của PGS. Lê Nguyễn Đoan Duy và TS. Phạm Văn Tấn vào năm 2020, mang tên: "Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol", đã được triển khai nhằm giải quyết các mắt xích công nghệ này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

• Mục tiêu tổng quát: Sử dụng các tác nhân acid, kiềm, vi sóng hoặc nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ tối đa hemicellulose và lignin; đồng thời thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc tự nhiên để ứng dụng thủy phân vỏ quả cà phê, khử độc dịch thủy phân và lên men tạo ethanol, so sánh hiệu quả kỹ thuật và kinh tế với enzyme thương mại.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và tiền xử lý vỏ quả cà phê vối; tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình khử các chất kháng khuẩn này.
  2. Phân lập nấm mốc, thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô và tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với muối vô cơ và dung môi hữu cơ.
  3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tối ưu hóa quá trình thủy phân vỏ quả cà phê bằng enzyme thu nhận được và so sánh hiệu quả đường hóa với enzyme thương mại.
  4. Kiểm tra thành phần hóa học của dịch thủy phân, xác định các chất ức chế và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân.
  5. Khảo sát các yếu tố công nghệ và so sánh các phương pháp lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê để tạo ethanol.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) thu nhận tại xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đắk Lắk, được tách vỏ và sấy khô ở 60°C trong 12 giờ.
  • Nguồn phân lập nấm mốc: Quả cà phê mốc, cành, thân, lá cây cà phê và đất trồng tại vườn cà phê thuộc xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đắk Lắk.
• Phạm vi nghiên cứu: Luận án tập trung vào các khâu công nghệ chính gồm tiền xử lý nguyên liệu, nuôi cấy phân lập nấm mốc, thu nhận enzyme thô, thủy phân và lên men ethanol. Các công đoạn tinh sạch sâu enzyme và chưng cất thu hồi ethanol không thuộc phạm vi khảo sát. Về thời gian, công đoạn tiền xử lý bằng vi sinh vật được giới hạn theo dõi tối đa trong 60 ngày.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc quả cà phê, sinh khối lignocellulose và công nghệ sản xuất ethanol sinh học thế hệ thứ hai:

Nhóm nội dung	Các tác giả và công trình được điểm luận	Phát hiện và cơ sở lý thuyết ghi nhận
Cấu tạo và thành phần vỏ quả cà phê	Murillo et al. (1977), Rojas et al. (2003), Nguyễn Thị Hiền & Nguyễn Văn Tặng (2010), Mussatto et al. (2011)	Lớp vỏ quả chiếm 43,2% trọng lượng tươi (28,7% trọng lượng khô), chứa 28,4% - 28,6% cellulose, 3,8% hemicellulose, 24,2% lignin, 8% - 12,3% protein, 10,1% đường tổng, 0,74% - 1,8% caffeine và 1,8% - 2% tannin.
Ứng dụng phế phẩm cà phê	Leifa et al. (2001), Shankaran & Lonsane (1994), Franca et al., Shenoy et al., Kwon et al.	Tận dụng vỏ cà phê làm giá thể trồng nấm, lên men acid citric/gibberellic, chế tạo than hoạt tính, hoặc thủy phân hóa học tạo ethanol bằng acid/kiềm đặc gây ô nhiễm.
Khả năng ức chế của caffeine và polyphenol	Ramanavičienė et al., Ibrahim et al., Sugiyama et al., Rahman et al., Akbar et al., Sanders & Mixon (1979), Scalbert (1991), Dương Thanh Liêm (2012)	Caffeine ở nồng độ >0,0025 g/mL ức chế vi khuẩn; >10 mM gây đột biến nấm men; 0,1% - 1% ức chế tổng hợp protein; tannin và phenolic phá hủy màng tế bào, làm biến tính enzyme và kìm hãm vi sinh vật lên men.
Cấu trúc sinh khối lignocellulose	Balat & Ayar (2005), Wyman et al., Palonen & Hetti (2004), Ramos & Pereira (2003), Pérez et al., Rubin (2008), Sun & Cheng (2002), Mosier et al. (2005)	Cellulose (mạch thẳng liên kết β-1,4-glucoside, vùng kết tinh và vô định hình); hemicellulose (heteropolysaccharide phân nhánh); lignin (polymer mạng 3D của coniferyl, coumaryl, sinapyl alcohol).
Tiền xử lý bằng acid	Henri Braconnot (1819), Melsens (1855), Sherrard & Kressman (1944), Taherzadeh & Karimi (2007 - quy trình Scholler/Madison), Saha et al., Cara et al., Schell et al.	Acid đặc phân giải cellulose ở nhiệt độ thấp nhưng ăn mòn thiết bị; acid loãng (0,5% - 5%, 120°C - 215°C) hòa tan tốt hemicellulose, tăng khả năng tiếp cận cellulose nhưng sinh chất ức chế furan.
Tiền xử lý bằng kiềm và vi sinh vật	Wang et al., Karunanithy & Muthukumarappan (2011), Chang et al. (2001, 2007), Sindhu et al. (2014, 2015), Castillo et al. (1994), Castillo del Pilar (1997)	Kiềm (NaOH, Ca(OH)2) cắt liên kết ester, xà phòng hóa và hòa tan lignin tốt hơn acid; nấm đảm mục trắng Phanerochaete chrysosporium tiết lignin peroxidase, phân hủy lignin có chọn lọc nhưng thời gian xử lý kéo dài.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định: Các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng hóa chất đơn lẻ ở nồng độ cao, quy trình xử lý acid đặc gây ăn mòn và ô nhiễm nghiêm trọng, hoặc phụ thuộc hoàn toàn vào enzyme thương mại nhập khẩu đắt đỏ (như cellulase từ A. niger hay T. reesei). Hơn nữa, việc loại bỏ hợp chất kháng khuẩn (caffeine, polyphenol) và khử độc các hợp chất furan (furfural, 5-HMF sinh ra từ thoái biến đường pentose/hexose) trước khi lên men trên cơ chất vỏ quả cà phê vối tại Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống. Do đó, luận án tập trung thiết lập quy trình tiền xử lý kết hợp giảm thiểu hóa chất độc hại, khai thác chủng nấm mốc bản địa trên chính phụ phẩm cà phê để tự sản xuất enzyme cellulase, và hoàn thiện các thông số lên men ethanol.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cơ chế chuyển hóa

1. Cơ chế phân giải phức hệ cellulose: Thủy phân cellulose thành glucose đòi hỏi sự phối hợp của ba nhóm enzyme:
   • Endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4, CMCase): Cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glucosidic ở vùng vô định hình của cellulose, tạo ra các đoạn mạch ngắn (oligosaccharide).
   • Exo-β-1,4-glucanase / Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91, CBH): Phân cắt liên tiếp từ đầu khử (CBH I) hoặc đầu không khử (CBH II) của mạch cellulose để giải phóng đường đôi cellobiose.
   • β-Glucosidase (EC 3.2.1.21): Thủy phân cellobiose và cello-oligosaccharide mạch ngắn thành các phân tử D-glucose đơn phân.
2. Cơ chế thủy phân hemicellulose và hình thành chất ức chế: Tác nhân xúc tác H⁺/OH⁻ cắt các liên kết glycosidic của chuỗi heteropolymer để tạo ra đường monomer (xylose, arabinose, mannose, galactose). Ở nhiệt độ cao và môi trường acid, đường pentose (C5) bị khử nước tạo thành furfural, còn đường hexose (C6) bị khử nước tạo thành 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF). HMF tiếp tục bị hydrat hóa phân rã thành acid formic và acid levulinic, đây là các tác nhân ức chế nghiêm trọng hoạt động trao đổi chất của nấm men.
3. Cơ chế phân hủy lignin: Trong môi trường kiềm loãng, các liên kết β-O-4 trong mạng polymer lignin bị cắt đứt tạo thành sản phẩm trung gian quinone methide rồi chuyển thành rượu coniferyl hòa tan. Trong môi trường acid, lignin bị phân cắt tạo thành các dẫn xuất ketone Hibbert.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Bố trí thí nghiệm: Triển khai theo 4 nội dung thực nghiệm chính: (1) Khảo sát quá trình tiền xử lý và khử caffeine/polyphenol; (2) Phân lập, định danh nấm mốc và thu nhận enzyme cellulase thô bằng kết tủa; (3) Khảo sát và tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng enzyme; (4) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và phương pháp lên men ethanol.
• Kỹ thuật tối ưu hóa và xử lý thống kê: Áp dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai tâm xoay CCF (Central Composite Face-centered) kết hợp phần mềm chuyên dụng; phân tích phương sai (ANOVA) để đánh giá độ tương thích của phương trình hồi quy và mức độ ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ.
• Phương pháp phân tích công cụ:
  • Xác định hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo phương pháp phân tích chất xơ tiêu chuẩn (xác định NDF, ADF, ADL).
  • Phân tích hình thái vi cấu trúc bề mặt vật liệu trước và sau tiền xử lý bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy - SEM).
  • Xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS).
  • Định lượng caffeine, polyphenol tổng số bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu; xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS; phân tích đường đơn và các chất ức chế furan (furfural, 5-HMF) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng ô nhiễm môi trường do hàng trăm nghìn tấn vỏ cà phê thải ra mỗi năm tại Việt Nam, nhu cầu cấp bách về năng lượng sinh học tái tạo, và khó khăn do cấu trúc lignin phức tạp cùng giá thành enzyme cellulase thương mại cao. Luận án xác định 1 mục tiêu tổng quát, 5 mục tiêu cụ thể, xác lập đối tượng nghiên cứu là vỏ quả cà phê vối và nấm mốc phân lập tại Đắk Lắk. Chương 1 cũng khẳng định ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp cơ sở dữ liệu về phụ phẩm giàu lignin, ý nghĩa thực tiễn trong định hướng sản xuất ethanol quy mô công nghiệp, và chỉ rõ các điểm mới về công nghệ tiền xử lý kết hợp vi sóng, quy trình khử độc dịch thủy phân và tuyển chọn chủng Trichoderma asperellum QT5.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận về giải phẫu học quả cà phê vối (Coffea robusta), tỷ lệ khối lượng các lớp vỏ (vỏ quả 43,2% tươi, vỏ nhớt 11,8%, vỏ trấu 6,1%, nhân 38,9%), thành phần sinh hóa và đặc tính kháng vi sinh vật của caffeine và hợp chất polyphenol/tannin. Tổng quan chi tiết cấu trúc phân tử của ba hợp phần lignocellulose (cellulose, hemicellulose, lignin), động học và cơ chế xúc tác của hệ đa enzyme cellulase (Endoglucanase, Cellobiohydrolase, β-Glucosidase), cơ chế thoái biến carbohydrate tạo thành furan và cơ chế phân cắt liên kết β-O-4 trong lignin. Chương này cũng phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp tiền xử lý bằng acid đậm đặc, acid loãng, kiềm (NaOH, Ca(OH)₂, KOH, NH₃), vi sinh vật (Phanerochaete chrysosporium), đặc điểm sinh học của hai chi nấm mốc Aspergillus và Trichoderma, cùng bức tranh tổng thể về tình hình sản xuất ethanol sinh học trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết địa điểm nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ và Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM. Nguyên liệu vỏ quả cà phê được thu gom tại Đắk Lắk, làm sạch, sấy ở 60°C trong 12 giờ và nghiền đạt kích thước quy định. Mô tả cụ thể các hóa chất, chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy (PGA, môi trường lỏng cơ bản) và hệ thống thiết bị phân tích. Thiết lập chi tiết sơ đồ bố trí thí nghiệm cho từng nội dung: quy trình 3 phương pháp trích ly khử caffeine/polyphenol (ngâm chiết thường, vi sóng, siêu âm); quy trình tiền xử lý đơn lẻ và kết hợp (acid H₂SO₄, kiềm NaOH, nấm mục trắng P. chrysosporium, vi sóng); quy trình phân lập, sàng lọc, định danh nấm mốc và kết tủa cellulase bằng 4 tác nhân ((NH₄)₂SO₄, NaCl, ethanol, acetone); quy trình tối ưu hóa thủy phân bằng mô hình CCF; quy trình khử độc bằng Ca(OH)₂; và quy trình lên men so sánh 3 phương thức SHF, SSF, SHF+SSF.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm, số liệu phân tích và thảo luận khoa học qua các nội dung:

1. Thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối: Xác định hàm lượng các chất khô, protein, lipid, đường tổng, tro, và đặc biệt là tỷ lệ các hợp phần lignocellulose (cellulose ~28,4%, hemicellulose ~3,8%, lignin ~24,2%), cùng hàm lượng caffeine và polyphenol.
2. Hiệu quả của các phương pháp tiền xử lý:
   • So sánh 3 phương pháp khử caffeine và polyphenol cho thấy phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng đạt hiệu suất cao nhất (92,3% đối với caffeine và 87,7% đối với polyphenol). Tuy nhiên, xét về mặt chi phí năng lượng và tính khả thi kỹ thuật trên quy mô lớn, trích ly ngâm chiết bằng nước nóng thông thường được lựa chọn.
   • Khảo sát các tác nhân tiền xử lý đơn lẻ bằng H₂SO₄ loãng và NaOH ở các dải nhiệt độ, nồng độ và thời gian khác nhau cho thấy sự biến đổi rõ rệt của hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. Xử lý sinh học bằng P. chrysosporium có khả năng phân hủy lignin nhưng tốc độ chậm.
   • Phương pháp kết hợp đa tác nhân Acid - Kiềm - Vi sóng mang lại hiệu quả vượt trội nhất:

Phương pháp tiền xử lý	Điều kiện công nghệ tối ưu	% Hemicellulose loại bỏ	% Lignin loại bỏ	% Cellulose giữ lại
H₂SO₄ loãng đơn lẻ	Nồng độ 0,5% - 2,0%, 120°C - 140°C	50% - 65%	15% - 25%	>80%
NaOH đơn lẻ	Tỷ lệ 0,1 - 0,2 g/g sinh khối, 120°C	30% - 45%	55% - 68%	75% - 82%
Nấm P. chrysosporium	Nuôi cấy bề mặt 10 - 60 ngày	Thấp	20% - 35%	Cao
Kết hợp Acid - Kiềm - Vi sóng	H₂SO₄ 2% (140°C, 45 phút) + NaOH 0,2 g/g (120°C, 20 phút) + Vi sóng 327 W (20 phút)	71,4%	79,2%	69,5%

• Ảnh chụp hiển vi điện tử quét (SEM) khẳng định cấu trúc bề mặt vỏ quả sau tiền xử lý kết hợp bị phá vỡ hoàn toàn mạng lưới che phủ của lignin và hemicellulose, tạo độ xốp và lộ rõ các vi sợi cellulose, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme tiếp cận.

3. Phân lập và thu nhận enzyme cellulase:
   • Phân lập được 5 dòng nấm mốc từ đất, quả mốc và cành lá cà phê. Trong đó, chủng Trichoderma asperellum QT5 (phân lập từ quả cà phê) thể hiện hoạt lực sinh tổng hợp cellulase cao nhất, đạt hoạt tính CMCase 1,17 U/mL sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng cơ bản.
   • So sánh 4 tác nhân kết tủa để tinh sạch sơ bộ enzyme thô:

Tác nhân kết tủa	Tỷ lệ / Nồng độ tối ưu	Hoạt tính CMCase sau kết tủa (U/mL)	Đánh giá hiệu quả
(NH₄)₂SO₄	60% - 80% bão hòa	Trung bình	Tinh sạch protein tốt nhưng cần thẩm tích loại muối
NaCl	Bão hòa	Thấp	Hiệu suất thu hồi không cao
Ethanol	Tỷ lệ enzyme : ethanol = 1 : 3,5	21,72	Tăng hoạt tính cao nhất, dễ thu hồi dung môi
Acetone	Tỷ lệ 1 : 3	Khá	Dễ bay hơi, hiệu quả thấp hơn ethanol

4. Nghiên cứu quá trình thủy phân và khử độc dịch đường:
   • Thủy phân vỏ quả cà phê sau tiền xử lý bằng cellulase từ T. asperellum QT5 tạo ra hàm lượng đường khử đạt 26,02 g/L, trong khi enzyme thương mại Viscozyme đạt 43,26 g/L. Mặc dù nồng độ đường khử tạo thành thấp hơn, enzyme tự thu nhận giúp tiết kiệm đáng kể chi phí hóa chất enzyme.
   • Tối ưu hóa các thông số thủy phân (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) theo mô hình CCF đạt sự tương thích cao giữa giá trị thực nghiệm và dự đoán.
   • Quá trình tiền xử lý acid-nhiệt sinh ra các chất ức chế furan (furfural và 5-HMF). Luận án đã xác lập chế độ khử độc bằng dung dịch Ca(OH)₂ bổ sung nhằm điều chỉnh pH, loại bỏ hoàn toàn độc tính ức chế và kết tủa loại bỏ ion sulfate dư dưới dạng thạch cao CaSO₄.
5. Nghiên cứu quá trình lên men tạo ethanol:
   • Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu, nhiệt độ và thời gian lên men đến tốc độ chuyển hóa đường và hàm lượng ethanol.
   • Hàm lượng ethanol thu được khi lên men dịch thủy phân bằng enzyme T. asperellum QT5 chỉ thấp hơn 13,8% so với khi sử dụng enzyme thương mại Viscozyme.
   • So sánh 3 phương thức lên men: Lên men riêng rẽ (SHF), Lên men đồng thời (SSF), và kết hợp (SHF+SSF). Kết quả cho thấy phương pháp SHF cho hiệu quả thủy phân và hàm lượng ethanol cao hơn nếu không giới hạn về mặt thời gian; ngược lại, phương pháp SSF cho hiệu quả thủy phân và tốc độ tạo ethanol cao hơn khi so sánh trong cùng một khoảng thời gian nuôi cấy.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Chương 5 đúc kết toàn bộ các thông số kỹ thuật cốt lõi đạt được của quy trình từ khâu khử độc nguyên liệu, tiền xử lý đa tác nhân, tinh sạch enzyme cellulase, khử độc dịch thủy phân bằng vôi đến phương thức lên men ethanol; đồng thời đề xuất các hướng nghiên cứu hoàn thiện quy trình ở quy mô pilot và nghiên cứu tận dụng bã thải sau lên men.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

1. Thiết lập quy trình tiền xử lý đa tác nhân có hỗ trợ vi sóng: Luận án đã chứng minh việc kết hợp tuần tự acid loãng (H₂SO₄ 2%), kiềm loãng (NaOH 0,2 g/g) và vi sóng (327 W) giúp phá vỡ triệt để cấu trúc liên kết lignocellulose trong vỏ quả cà phê vối (loại bỏ 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin, bảo tồn 69,5% cellulose), giúp giảm thiểu nồng độ hóa chất đậm đặc và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường so với các phương pháp truyền thống.
2. Khai thác thành công chủng vi sinh vật bản địa sinh cellulase: Phân lập, định danh và tuyển chọn được chủng nấm mốc Trichoderma asperellum QT5 từ chính quả cà phê vối hư hỏng tại Đắk Lắk có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh (1,17 U/mL), và xác lập điều kiện kết tủa bằng ethanol (tỷ lệ 1:3,5) nâng hoạt tính CMCase lên 21,72 U/mL.
3. Làm rõ cơ chế hình thành và loại trừ chất ức chế lên men: Đánh giá được sự hình thành của các chất độc sinh ra do thoái biến đường và lignin (furfural, 5-HMF, acid hữu cơ), đồng thời thiết lập giải pháp khử độc dịch thủy phân hiệu quả bằng Ca(OH)₂ kết hợp kết tủa CaSO₄ trước khi lên men.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu công nghệ hoàn chỉnh để xây dựng quy trình sản xuất ethanol sinh học từ nguồn phụ phẩm vỏ quả cà phê vối ở quy mô công nghiệp tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực Tây Nguyên.
• Đề xuất giải pháp thay thế một phần enzyme thương mại nhập khẩu đắt tiền bằng chế phẩm enzyme cellulase tự sản xuất từ chủng giống nấm mốc địa phương, giúp hạ giá thành sản xuất ethanol sinh học.
• Đóng góp giải pháp công nghệ xử lý chất thải rắn cho ngành chế biến cà phê, biến nguồn phế phụ phẩm gây ô nhiễm thành nhiên liệu sinh học tái tạo có giá trị gia tăng cao.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án:
  • Tiền xử lý sinh học bằng nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium bị giới hạn thời gian khảo sát tối đa trong 60 ngày do tốc độ phân hủy chậm, chưa thể áp dụng độc lập trong sản xuất quy mô công nghiệp ngắn ngày.
  • Luận án mới dừng lại ở mức độ tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase bằng kết tủa dung môi/muối vô cơ và chưa thực hiện các bước tinh sạch sâu hay nghiên cứu động học enzyme chi tiết.
  • Các công đoạn nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa khảo sát công đoạn chưng cất thu hồi cồn tinh khiết và đánh giá hiệu quả kinh tế - kỹ thuật trên mô hình thiết bị liên tục.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ ở quy mô pilot và quy mô bán công nghiệp tại các vùng nguyên liệu chế biến cà phê trọng điểm.
  • Nghiên cứu biến tính di truyền hoặc đột biến thực nghiệm để nâng cao hơn nữa hoạt lực sinh tổng hợp enzyme của chủng Trichoderma asperellum QT5.
  • Khảo sát tận dụng bã thải rắn sau quá trình thủy phân và lên men để sản xuất phân bón hữu cơ sinh học hoặc thức ăn chăn nuôi nhằm khép kín chu trình không phát thải.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học và Khoa học Môi trường trong việc giảng dạy, nghiên cứu về công nghệ enzyme, công nghệ sinh khối lignocellulose và quản lý phụ phẩm nông nghiệp.
• Các kỹ sư công nghệ và nhà quản lý môi trường tại các nhà máy, doanh nghiệp chế biến cà phê nhân tìm kiếm giải pháp kỹ thuật xử lý triệt để vỏ quả cà phê tươi và khô.
• Các nhà hoạch định chính sách và doanh nghiệp năng lượng sinh học trong việc xây dựng chuỗi cung ứng nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai (E5, E10) từ nguồn sinh khối phi thực phẩm tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phải khử caffeine và polyphenol trước khi tiến hành tiền xử lý và lên men vỏ quả cà phê? Trả lời: Caffeine (chiếm 0,74% - 1,8%) và polyphenol/tannin (chiếm 1,8% - 2%) trong vỏ quả cà phê là các chất có tính kháng khuẩn mạnh. Chúng gây ức chế phân chia tế bào, ức chế tổng hợp protein và làm biến tính hệ enzyme màng của vi sinh vật, gây ngộ độc hoặc ức chế nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men và cản trở sự phát triển của nấm mốc sinh cellulase.
2. Phương pháp tiền xử lý nào cho hiệu quả phá vỡ cấu trúc lignocellulose cao nhất trong luận án? Trả lời: Phương pháp kết hợp Acid - Kiềm - Vi sóng mang lại hiệu quả cao nhất với điều kiện: H₂SO₄ 2% (140°C, 45 phút), NaOH 0,2 g/g (120°C, 20 phút) và vi sóng 327 W (20 phút). Chế độ này loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% hàm lượng cellulose ban đầu.
3. Chủng nấm mốc nào được chọn để thu nhận enzyme cellulase và hoạt tính đạt được là bao nhiêu? Trả lời: Chủng nấm mốc Trichoderma asperellum QT5 phân lập từ quả cà phê hư hỏng tại Đắk Lắk được lựa chọn. Chủng này đạt hoạt tính CMCase 1,17 U/mL sau 48 giờ nuôi cấy lỏng cơ bản, và sau khi kết tủa tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ 1:3,5), hoạt tính CMCase tăng lên 21,72 U/mL.
4. Hiệu quả tạo ethanol của enzyme tự thu nhận so với enzyme thương mại Viscozyme như thế nào? Trả lời: Dịch thủy phân bằng enzyme cellulase tự thu nhận từ T. asperellum QT5 tạo ra 26,02 g/L đường khử (thấp hơn so với 43,26 g/L của Viscozyme), nhưng hàm lượng ethanol thu được sau lên men chỉ thấp hơn 13,8% so với khi sử dụng enzyme thương mại, mang lại lợi thế lớn về giảm thiểu chi phí nhập khẩu enzyme.
5. So sánh hai phương pháp lên men SHF và SSF trên dịch thủy phân vỏ quả cà phê cho kết quả ra sao? Trả lời: Phương pháp lên men riêng rẽ (SHF) cho hiệu quả thủy phân và hàm lượng ethanol cao hơn phương pháp lên men đồng thời (SSF) nếu không tính đến yếu tố thời gian; tuy nhiên, nếu xét trong cùng một khoảng thời gian nuôi cấy cố định, phương pháp SSF lại cho hiệu quả thủy phân và năng suất sinh ethanol cao hơn.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS Đỗ Viết Phương đã giải quyết thành công các rào cản công nghệ trong việc chuyển hóa phụ phẩm vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) thành ethanol sinh học thông qua việc kết hợp tối ưu các phương pháp tiền xử lý hóa - lý (Acid - Kiềm - Vi sóng) và tuyển chọn chủng nấm mốc bản địa Trichoderma asperellum QT5 để tự sản xuất enzyme cellulase. Quy trình công nghệ được thiết lập hoàn chỉnh từ khâu loại bỏ chất kháng khuẩn, thủy phân cellulose, khử độc dịch đường bằng vôi đến lên men nấm men, cho hiệu suất sinh ethanol tiệm cận với việc sử dụng enzyme thương mại. Công trình cung cấp hệ thống số liệu khoa học thực nghiệm có độ tin cậy cao, đóng góp giải pháp thiết thực cho công tác bảo vệ môi trường và định hướng phát triển ngành năng lượng tái tạo bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam hiện nay là nước xuất khẩu cà phê vối đứng thứ nhất trên thế giới, cũng như có tổng sản lượng cà phê nhân xuất khẩu đứng thứ hai trên thế giới chỉ sau Brazil. Tổng sản lượng trong năm 2018 là 1.000 tấn cà phê nhân (USDA, 2018) và hàng năm thải ra môi trường khoảng 460.000 tấn vỏ cà phê khô. Lượng phế thải này chủ yếu là làm chất đốt để sấy quả và hạt cà phê. Tuy nhiên việc dùng vỏ cà phê để làm chất đốt hiện nay gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng.

Ngoài ra, một phần vỏ cà phê người dân ủ đống và bón lại cho các gốc cây cà phê nhưng cũng không có hiệu quả cao vì vỏ cà phê chưa qua xử lý để chuyển thành phân bón. Cho đến thời điểm hiện tại, cũng chỉ một phần nhỏ được sản xuất làm phân bón và làm thức ăn gia súc. Trên thế giới cũng có các công trình nghiên cứu tận dụng phế thải từ cà phê như: Sử dụng vỏ cà phê, lá cà phê làm giá thể để trồng nấm (Leifa et al., 2001), sử dụng vỏ quả cà phê, vỏ trấu cà phê làm nguồn carbon để lên men tạo acid gibberellic từ đó sản xuất acid citric (Shankaran and Lonsane, 1994). Vỏ cà phê còn được sử dụng để sản xuất than hoạt tính trong công nghiệp xử lý nước thải (Franca et al.

Đáng quan tâm nhất, vỏ quả cà phê cũng được nghiên cứu sản xuất ra ethanol bằng phương pháp hóa học (Shenoy et al. Tuy nhiên nghiên cứu này có hạn chế lớn khi dùng acid và kiềm mạnh để thủy phân vỏ quả sẽ gây ô nhiễm môi trường ở mức nghiêm trọng cũng như trang thiết bị cơ giới hóa tốn kém, khó chế tạo. Trong vài thập niên gần đây, đứng trước nhu cầu năng lượng ngày càng tăng và vấn đề ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã thúc đẩy các nước phải quan tâm nhiều hơn trong việc theo đuổi và thay thế bằng các nguồn năng lượng tái tạo và đặc biệt là sản xuất ethanol. Một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào nhất đến thời điểm hiện tại để sản xuất ethanol đó là sinh khối lignocellulose.

Các nhà khoa học ước tính rằng sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần sản lượng hiện tại (Saha and Cotta, 2008). Nghiên cứu gần đây chỉ ra tiềm năng tuyệt vời của phế thải vỏ cà phê trong việc sản xuất ethanol (Kwon et al. Nếu đốt ethanol thay vì xăng sẽ giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường (Mussatto et al. Tuy nhiên rào cản lớn nhất trong việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu này đó chính là trong nguyên liệu có chứa nhiều hemicellulose và lignin.

Các chất này liên kết chặt chẽ với cellulose và tạo rào chắn bảo vệ sự tấn công của các loại hóa chất cũng như các loại enzyme tới phân tử cellulose (Ragauskas et al., 2006; Hahn-Hägerdal et al. Hàm lượng lignin trong vỏ quả cà phê 1 luan an chiếm khoảng 17,5÷20,07% là tương đối cao. Điều này như là một cản trở lớn cho quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê trước khi thủy phân và lên men tạo ethanol. Do đó, cần thiết phải có những khảo sát về các phương pháp tiền xử lý để loại bỏ thành phần lignin này đồng thời phải giữ lại lượng cellulose có trong nguyên liệu trước khi tiến hành quá trình thủy phân và lên men tạo ethanol.

Để có thể sản xuất ethanol, các polymer sinh học mà chủ yếu là cellulose phải được phân giải thành các đường đơn. Có hai hướng tiếp cận vấn đề này, đó là thông qua thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme. Công nghệ thủy phân bằng acid cho đến hiện nay không còn nghiên cứu nhiều mà các nghiên cứu tập trung vào thủy phân bằng enzyme hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đột phá về mặt công nghệ. Tuy nhiên, thủy phân bằng enzyme gặp phải vấn đề lớn đó là giá thành enzyme còn khá cao.

Các chế phẩm enzyme cellulase thương mại đến từ các nhà sản xuất lớn trên thế giới như Mỹ, Đan Mạch, Ấn Độ giá thành dao động tùy thuộc vào hoạt lực chẳng hạn như: Cellulase từ A. niger giá 4,5 triệu đồng cho 25g (hoạt tính 0,8 U/mg), hay cellulase từ T. reesei giá 3,5 triệu đồng cho 50 mL (hoạt tính 700 U/g). Cho đến hiện nay, các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme cellulase chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen mã hoá cellulase, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của cellulase, tối ưu những điều kiện nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme từ các loài nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn.

Trái lại, việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiều hạn chế do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động nguồn enzyme, khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt độ và pH, khả năng hoạt động trong những điều kiện nồng độ cao chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ. Do đó, rất cần có những nghiên cứu về việc ứng dụng cellulase có nguồn gốc tự nhiên mà đặc biệt là từ các chủng nấm mốc hiện diện ngay trên cơ chất thủy phân của enzyme cellulase. Trên thực tế, việc sản xuất cà phê ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên cho nên sẽ giảm thiểu được chi phí thu gom nguyên liệu. Ngoài ra, có thể nhận thấy được tiềm năng về trữ lượng vỏ cà phê ở Việt Nam rất lớn, cùng với vấn đề mang tính thời sự đó là bài toán giải quyết ô nhiễm trường, tìm và thay thế nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt.

Chính vì vậy, vỏ cà phê vối được chọn lựa làm nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol”.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.1 Mục tiêu tổng quát Sử dụng các tác nhân acid, kiềm, vi sóng hay nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều nhất hemicellulose và lignin ra khỏi nguyên liệu. Đồng thời là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và ứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà phê. Dịch thủy phân được đem đi lên men để so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được với enzyme thương mại.2 Mục tiêu cụ thể (1) Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê đồng thời tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine, khử polyphenol. (2) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ.

(3) So sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được và enzyme thương mại. Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu được hàm lượng đường khử là cao nhất. (4) Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân. (5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu: Vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta): Quả cà phê vối tươi được thu nhận tại xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk.

Sau đó tách lấy vỏ quả rồi sấy khô ở 60oC trong 12 giờ. Nguồn phân lập nấm mốc: Quả cà phê mốc, cành, thân, lá cây cà phê, đất trồng được thu nhận tại vườn trồng cà phê (xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk).2 Phạm vi nghiên cứu: Phạm vi không gian: Đề tài chi tập trung các khâu chính như: tiền xử lý, nuôi cấy nấm mốc, thu nhận enzyme thô, thủy phân và lên men. Một số nội dung khác đề tài không khảo sát như: tinh sạch enzyme, chưng cất. 3 luan an Phạm vi thời gian: Khó khăn của đề tài là ở công đoạn tiền xử lý bằng vi sinh vật có thể kéo dài vài tháng, cho nên đề tài chỉ tập trung nghiên cứu, khảo sát thời gian tối đa là 60 ngày.4 Ý nghĩa của luận án 1.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu và đưa ra các giải pháp hữu ích nhằm giải quyết vấn đề phụ phẩm trong công nghiệp chế biến là khuynh hướng nghiên cứu đang được quan tâm ở trong và ngoài nước.

Việc sử dụng vỏ quả cà phê vối là lựa chọn có ý nghĩa thực tiễn khi Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê nhân lớn thứ 2 thế giới (đặc biệt, xuất khẩu cà phê Robusta lớn nhất thế giới). Kết quả nghiên cứu từ luận án đã cung cấp số liệu về thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối, cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn phụ phẩm này như nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng để sản xuất ethanol. Nghiên cứu đã chú trọng sử dụng các giải pháp hạn chế sử dụng hóa chất độc hại nồng độ cao bằng việc kết hợp các phương thức tiền xử lý.2 Ý nghĩa thực tiễn Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê quy mô công nghiệp. Đồng thời, góp phần khai thác triệt để và có hiệu quả nguồn phụ phẩm từ ngành công nghiệp cà phê ở Việt Nam.5 Điểm mới của luận án Đề xuất được giải pháp tiền xử lý có sự hỗ trợ của vi sóng để giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm loãng, acid loãng), giúp giảm ảnh hưởng đến môi trường và tăng hiệu suất; sự cần thiết của việc điều chỉnh thứ tự của các bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu.

Đánh giá được sự hình thành và tác động của một số chất hóa học nguy hại cho quá trình lên men và đề xuất được giải pháp loại trừ. Thu nhận được enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichoderma asperellum (QT5) được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, ứng dụng có hiệu quả trong thủy phân vỏ quả cà phê vối. Thông tin từ kết quả nghiên cứu là tư liệu khoa học cho việc nghiên cứu về ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao, sử dụng trong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất thực phẩm. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu cà phê 2.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối Vỏ cà phê là phụ phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà phê nhân ướt (Hình 2.

Vỏ quả chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi hoặc 28,7% trọng lượng chất khô của toàn bộ quả cà phê (Bảng 2.