Luận Văn Thạc Sĩ: Khả Năng Kháng Nấm Men Saccharomyces Cerevisiae Và Pichia Của Nano Bạc

Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc, cung cấp thông tin hữu ích cho lĩnh vực sinh học và y học.

• Tác giả: Ma Trần Thu Hường
• Người hướng dẫn: Th.S Lương Hùng Tiến
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Yêu cầu nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về nano bạc
• 2.2. Giới thiệu về công nghệ nano
• 2.2.1. Công nghệ nano
• 2.2.2. Vật liệu nano và phân loại
• 2.2.3. Cơ sở khoa học của công nghệ nano
• 2.3. Giới thiệu về bạc kim loại
• 2.4. Giới thiệu về hạt nano bạc
• 2.4.1. Giới thiệu chung
• 2.4.2. Tính chất lý học của hạt nano bạc
• 2.4.3. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
• 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng kháng khuẩn của nano bạc
• 2.6. Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc

Tóm tắt

I. Tổng quan về nano bạc

Nano bạc là một vật liệu được nghiên cứu rộng rãi nhờ tính chất kháng khuẩn và kháng nấm vượt trội. Ở kích thước nano, bạc thể hiện các tính chất vật lý, hóa học và sinh học đặc biệt, đặc biệt là khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc có thể tăng hiệu quả kháng khuẩn lên gấp 50.000 lần so với bạc dạng khối. Các yếu tố như kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố đều ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của nano bạc. Các phương pháp chế tạo nano bạc bao gồm phương pháp từ dưới lên và từ trên xuống, trong đó phương pháp từ dưới lên được ưa chuộng hơn do tạo ra hạt có kích thước nhỏ và đồng đều.

1.1. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc

Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc dựa trên khả năng liên kết của ion Ag+ với peptidoglican trong thành tế bào vi khuẩn, ức chế quá trình vận chuyển oxy và gây tê liệt tế bào. Các hạt nano bạc cũng có thể xâm nhập vào tế bào, tương tác với enzyme và DNA, dẫn đến bất hoạt và tiêu diệt tế bào. Hiệu ứng bề mặt của nano bạc cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng kháng khuẩn.

1.2. Ứng dụng của nano bạc

Nano bạc được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như y tế, thực phẩm và môi trường. Trong y tế, nano bạc được sử dụng để sản xuất vật liệu kháng khuẩn, băng gạc và thiết bị y tế. Trong thực phẩm, nano bạc giúp bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm men. Ngoài ra, nano bạc còn được sử dụng trong xử lý nước và khử trùng môi trường.

II. Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của nano bạc

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng nấm men của nano bạc đối với hai chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia. Hai chủng nấm men này thường xuất hiện trong thực phẩm và có thể gây hư hỏng nếu không được kiểm soát. Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc và đánh giá hiệu quả kháng nấm men theo thời gian. Kết quả cho thấy nano bạc có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của cả hai chủng nấm men, đặc biệt ở nồng độ thấp.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc xác định đặc điểm của vi sinh vật, sử dụng các phương pháp như đếm khuẩn lạc (CFU) và đo độ đục để đánh giá khả năng kháng nấm men của nano bạc. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng cách sử dụng các dung dịch nano bạc với nồng độ khác nhau. Khả năng kháng nấm men theo thời gian được theo dõi bằng cách đo sự phát triển của nấm men trong các khoảng thời gian cụ thể.

2.2. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy nano bạc có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae và Pichia. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với hai chủng nấm men này được xác định ở mức thấp, chứng tỏ khả năng kháng nấm men mạnh mẽ của nano bạc. Ngoài ra, nano bạc cũng duy trì hiệu quả kháng nấm men trong thời gian dài, mở ra tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và chế tạo vật liệu kháng khuẩn.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học quan trọng trong việc bổ sung cơ sở dữ liệu về khả năng kháng nấm men của nano bạc. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin về nồng độ ức chế tối thiểu và hiệu quả kháng nấm men theo thời gian, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của nano bạc đối với nấm men. Về mặt thực tiễn, nano bạc có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong việc bảo quản thực phẩm, chế tạo vật liệu kháng khuẩn và kiểm soát vi sinh vật trong các quy trình sản xuất.

3.1. Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Nano bạc có thể được sử dụng để ức chế sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae và Pichia trong thực phẩm, giúp kéo dài thời gian bảo quản và giảm thiểu hư hỏng. Điều này đặc biệt hữu ích trong các ngành công nghiệp thực phẩm như sản xuất nước ép trái cây, rượu vang và các sản phẩm từ sữa.

3.2. Ứng dụng trong y tế

Nhờ tính chất kháng khuẩn và kháng nấm men, nano bạc có thể được ứng dụng trong sản xuất vật liệu y tế như băng gạc, thiết bị y tế và các sản phẩm khử trùng. Điều này giúp giảm nguy cơ nhiễm trùng và nâng cao hiệu quả điều trị trong y tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kim loại bạc từ lâu đã được ứng dụng trong đời sống nhờ đặc tính kháng vi sinh vật tự nhiên mà không gây độc hại cho cơ thể người và động vật ở các liều lượng thích hợp. Khi khoa học phát triển, công nghệ nano cho phép chế tạo các hạt bạc ở quy mô nanomet (từ 1 đến 100 nm), làm gia tăng đột biến tỷ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc so với thể tích. Sự thu nhỏ kích thước này giúp hoạt tính sát khuẩn của bạc nano tăng lên khoảng 50.000 lần so với bạc ở dạng khối thông thường. Ở nồng độ dưới 100 ppm, nano bạc được ghi nhận là an toàn, không gây phản ứng phụ và không độc hại cho người cũng như vật nuôi.

Bên cạnh hoạt tính diệt khuẩn đã được kiểm chứng rộng rãi, nano bạc còn được biết đến là một tác nhân có khả năng kháng nấm phổ rộng, tác động lên nhiều chi nấm men và nấm mốc như Candida, Aspergillus, Saccharomyces và Pichia. Trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm, Saccharomyces cerevisiae và Pichia là hai chủng nấm men thường gặp. Mặc dù đóng vai trò quan trọng trong các quy trình lên men truyền thống, chúng lại là tác nhân gây hư hỏng nghiêm trọng trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. S. cerevisiae có thể làm chua dịch đường, hỏng nước ép trái cây, mứt, siro và kem. Trong khi đó, nấm men tạo váng Pichia phát triển trên bề mặt rượu vang và bia, tạo màng mỏng, làm đục sản phẩm, đồng thời sinh các acid bay hơi làm biến đổi sâu sắc hương vị và giảm giá trị cảm quan. Đáng chú ý, hai chủng vi sinh vật được thu thập trong nghiên cứu này (Saccharomyces cerevisiae BM và Pichia sp.) là các chủng nấm men dại được phân lập trực tiếp từ lá cây men rượu bản địa, chưa từng trải qua các đánh giá thực nghiệm về mức độ nhạy cảm đối với dung dịch nano bạc.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ sản xuất chế phẩm kháng vi sinh vật ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, đề tài "Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc" đã được thực hiện.

Mục tiêu chung của đề tài: Xác định khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc.

Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu cụ thể (được đánh số theo văn bản):

1. Lựa chọn được phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc.
2. Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia.
3. Đánh giá được khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc theo thời gian.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Dung dịch nano bạc nồng độ gốc 100 ppm và hai chủng nấm men dại gồm Saccharomyces cerevisiae BM và Pichia sp. được phân lập từ lá cây men rượu bản địa.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Từ ngày 01/01/2013 đến ngày 01/06/2014.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết của đề tài xây dựng trên các nguyên lý vật lý, hóa học của vật liệu nano và sinh học vi sinh vật:

• Cơ sở vật liệu nano: Vật liệu có kích thước nanomet mang ba đặc trưng khoa học cốt lõi gồm sự chuyển tiếp từ tính chất cổ điển sang tính chất lượng tử, hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước tới hạn. Khi kích thước hạt giảm xuống dưới bước sóng ánh sáng, hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt xuất hiện, làm thay đổi phổ hấp thụ quang học.
• Cơ chế tác động kháng vi sinh vật của nano bạc: Các ion Ag⁺ giải phóng từ bề mặt nano bạc liên kết mạnh với peptidoglycan và các thành phần mang điện tích âm trên màng tế bào, ức chế enzyme vận chuyển oxy. Đồng thời, các hạt nano bạc kích thước nhỏ xâm nhập qua màng tế bào, tương tác với các nhóm sulfhydryl (-SH) và phosphate của protein, enzyme nội bào cũng như phân tử DNA, dẫn đến bất hoạt enzyme, phá vỡ cấu trúc di truyền và làm chết tế bào.
• Đặc tính sinh học của nấm men: Khóa luận hệ thống hóa phân loại khoa học, đặc điểm hình thái học, cấu tạo tế bào nhân thực, nhu cầu dinh dưỡng và phương thức sinh sản của hai chi Saccharomyces và Pichia, đồng thời đối chiếu với các tác nhân ức chế nấm men truyền thống (như SO₂, 5-NFA, acid axetic, acid propionic, H₂O₂, allicin, tinh dầu trầu không và chitosan).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Hoạt hóa và định lượng vi sinh vật: Nấm men được hoạt hóa 2 lần liên tiếp trong môi trường dinh dưỡng Hansen lỏng ở 30°C trong 24 giờ. Mật độ tế bào được định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc cấy gạt trên đĩa thạch Hansen rắn, tính toán theo công thức: $$N = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 \cdot n_2) \cdot d \cdot V} \text{ (CFU/ml)}$$ Trong đó $\sum C$ là tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa, $n_1$ và $n_2$ là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất và thứ hai, $d$ là hệ số pha loãng ban đầu, và $V$ là thể tích dịch cấy (0,1 ml).
• So sánh các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng nấm: Đánh giá đồng thời 4 kỹ thuật vi sinh gồm:
  1. Phương pháp đục lỗ thạch (lỗ đường kính 5 mm, nhỏ 100 µl nano bạc ở các dải nồng độ, ủ lạnh 8 giờ để khuếch tán trước khi ủ ấm ở 30°C trong 24–48 giờ).
  2. Phương pháp nhỏ dịch kháng khuẩn lên bề mặt thạch (nhỏ 0,05 ml nano bạc lên vết cấy 0,01 ml vi sinh vật).
  3. Phương pháp khuếch tán đĩa giấy (sử dụng đĩa giấy thấm đường kính 5 mm tẩm dung dịch thử nghiệm).
  4. Phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng.
• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): MIC được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của $10^4$ CFU/ml vi sinh vật so với mẫu kiểm chứng. Thử nghiệm tiến hành trong ống eppendorf với thể tích phản ứng gồm 0,4 ml dung dịch nano bạc ở các nồng độ pha loãng, 0,1 ml huyền phù nấm men ($10^5$ CFU/ml) và 0,5 ml môi trường Hansen lỏng. Mẫu đối chứng sử dụng 0,4 ml nước khử ion (DI). Sau 24 giờ nuôi ở 30°C, hút 15 µl dịch hỗn hợp nhỏ lên mặt thạch Hansen rắn, ủ ở 30°C trong 24–48 giờ để quan sát sự xuất hiện của khuẩn lạc.
• Theo dõi động học kháng nấm theo thời gian: Huyền phù nấm men được tiếp xúc với nano bạc ở các nồng độ $1 \times \text{MIC}$, $2 \times \text{MIC}$, $4 \times \text{MIC}$ trong môi trường Hansen lỏng. Tại các mốc thời gian 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36 và 48 giờ kể từ lúc bắt đầu tiếp xúc, tiến hành lấy mẫu và đếm khuẩn lạc sống sót để xác định động học ức chế và thời điểm tiêu diệt hoàn toàn.
• Nguồn gốc vật liệu và hóa chất:
  • Dung dịch keo nano bạc gốc nồng độ 100 ppm do Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tổng hợp và cung cấp.
  • Hai chủng nấm men dại do Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên phân lập từ lá cây men rượu.
  • Môi trường nuôi cấy Hansen (gồm Glucose 50g, Pepton 10g, KH₂PO₄ 3g, MgSO₄·7H₂O 2g, nước cất vừa đủ 1000 ml, pH 5–6; môi trường rắn bổ sung 15g Agar).
• Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần độc lập, số liệu được phân tích thống kê trên phần mềm Microsoft Excel, kết quả biểu diễn dưới dạng mật độ trung bình kèm sai số toàn phương: $A = \bar{A} \pm \delta$ (log CFU/ml).

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Bố cục khóa luận được cấu trúc thành 5 phần chính theo đúng quy chuẩn học thuật của cơ sở đào tạo:

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm các giải pháp kháng vi sinh vật an toàn thay thế hóa chất bảo quản tổng hợp. Nội dung nhấn mạnh tiềm năng của vật liệu nano bạc nhờ diện tích bề mặt riêng lớn và độc tính thấp đối với cơ thể bậc cao. Phần mở đầu cũng xác định rõ ràng mục đích, 3 yêu cầu nghiên cứu cụ thể, cùng ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp dữ liệu định lượng về độ nhạy cảm của các chủng nấm men hoang dại, làm tiền đề thực tiễn cho việc phát triển vật liệu bảo quản thực phẩm.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp hệ thống lý luận bao quát gồm ba mảng kiến thức:

• Tổng quan về công nghệ nano và vật liệu nano bạc: Lịch sử sử dụng bạc, phân loại vật liệu nano (không chiều, một chiều, hai chiều), các tính chất lý học (quang, điện, nhiệt, hiệu ứng bề mặt), các yếu tố chi phối hoạt tính (kích thước, hình thái học, nồng độ phân tán) và các phương pháp chế tạo (tiếp cận từ dưới lên "bottom-up" và từ trên xuống "top-down", khử hóa học, khử vật lý, ăn mòn laser, khử hóa lý và khử sinh học).
• Đặc điểm sinh học của nấm men: Hình thái tế bào, thành phần hóa học sinh khối khô (protein chiếm 42–46%, carbohydrate 30–37%), cơ chế sinh sản vô tính qua nảy chồi và hữu tính qua bào tử túi. Đi sâu phân tích tác hại của S. cerevisiae làm chua thực phẩm lỏng và Pichia tạo màng nhầy làm biến chất vang và bia. Đồng thời liệt kê các hợp chất kháng nấm men đã được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Điểm lại các công trình quốc tế về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc (Kim JS và cs., 2007; Lok CN và cs., 2006; Sotiriou GA và cs., 2010) và các hướng nghiên cứu ứng dụng nano bạc tại Việt Nam (xử lý nước, màng lọc kháng khuẩn, băng gạc điều trị bỏng tại Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Bỏng Quốc gia và Viện Công nghệ Môi trường).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục chủng giống nấm men dại bản địa, thông số kỹ thuật của dung dịch nano bạc (100 ppm), thành phần công thức môi trường Hansen lỏng và rắn. Mô tả chi tiết các trang thiết bị sử dụng (tủ cấy AIRTECH, tủ ấm, máy Vortex, nồi hấp tiệt trùng ALP, cân phân tích). Quy định rõ ràng quy trình các bước tiến hành 4 nội dung nghiên cứu thực nghiệm: hoạt hóa và định lượng vi sinh vật, thử nghiệm so sánh 4 kỹ thuật xác định hoạt tính, quy trình xác định MIC qua thử nghiệm pha loãng đối kháng, và phương pháp lấy mẫu định kỳ theo thời gian để theo dõi tỷ lệ sống sót của tế bào.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu

Trình bày các phát hiện thực nghiệm thông qua các bảng số liệu và đồ thị sinh trưởng:

• Đặc điểm vi sinh vật: Sau hai lần hoạt hóa, cả hai chủng nấm men đều đạt mật độ tế bào ổn định ở mức $10^8$ CFU/ml. Khuẩn lạc S. cerevisiae có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi; khuẩn lạc Pichia có màu trắng đục, bề mặt bóng và nhẵn.
• Đánh giá phương pháp thử nghiệm: Phân tích nguyên nhân khiến phương pháp đục lỗ thạch và khuếch tán đĩa giấy không tối ưu (do nano bạc bị oxy hóa bởi ánh sáng, có xu hướng kết đám và khuếch tán kém trong khuôn gel thạch agar), từ đó lựa chọn phương pháp đối kháng dịch lỏng làm phương pháp chuẩn cho các bước định lượng tiếp theo.
• Xác định giá trị MIC: Thử nghiệm dải nồng độ đối kháng cho thấy nano bạc ức chế hoàn toàn $10^4$ CFU/ml nấm men ở nồng độ 6,25 ppm đối với S. cerevisiae và 3,125 ppm đối với Pichia.
• Động học ức chế theo thời gian: Phân tích đường cong sống sót của nấm men ở các mức nồng độ $1 \times \text{MIC}$, $2 \times \text{MIC}$ và $4 \times \text{MIC}$ trong suốt 48 giờ theo dõi, chỉ ra sự phụ thuộc của hiệu lực diệt nấm vào cả nồng độ xử lý và thời gian tiếp xúc.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra 3 kết luận cốt lõi về phương pháp luận và các thông số diệt nấm thực nghiệm đạt được. Nêu rõ các khuyến nghị tiếp tục mở rộng phổ khảo sát trên các chủng vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh khác và định hướng tối ưu hóa thời gian xử lý phục vụ ứng dụng sản xuất.

Kết quả và đóng góp khoa học

Kết quả định lượng chính trong văn bản

Khóa luận đã thu được các số liệu thực nghiệm cụ thể thông qua các bảng kiểm chứng vi sinh:

Chủng nấm men nghiên cứu	Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường Hansen	Mật độ sau hoạt hóa (CFU/ml)	Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (ppm)	Thời gian và nồng độ tiêu diệt hoàn toàn tế bào ($10^4$ CFU/ml)
Saccharomyces cerevisiae BM	Màu trắng nhạt, rìa tròn, bề mặt lồi	$10^8$	6,25	- Nồng độ 12,5 ppm ($2 \times \text{MIC}$): diệt sạch sau 20 giờ - Nồng độ 25,0 ppm ($4 \times \text{MIC}$): diệt sạch sau 8 giờ
Pichia sp.	Màu trắng đục, bề mặt nhẵn bóng	$10^8$	3,125	- Nồng độ 6,25 ppm ($2 \times \text{MIC}$): diệt sạch sau 16 giờ - Nồng độ 12,5 ppm ($4 \times \text{MIC}$): diệt sạch sau 12 giờ

Khảo sát động học ức chế theo thời gian chỉ ra rằng:

• Đối với S. cerevisiae: Ở nồng độ $1 \times \text{MIC}$ (6,25 ppm), nano bạc kìm hãm tế bào trong 16 giờ đầu, sau đó nấm men bắt đầu sinh trưởng trở lại. Khi nâng nồng độ lên $2 \times \text{MIC}$ (12,5 ppm), mật độ tế bào giảm dần và bị triệt tiêu hoàn toàn sau 20 giờ. Ở nồng độ $4 \times \text{MIC}$ (25 ppm), quần thể tế bào bị tiêu diệt hoàn toàn sau 8 giờ và không quan sát thấy sự tái phát triển trong ít nhất 48 giờ theo dõi.
• Đối với Pichia: Ở nồng độ $1 \times \text{MIC}$ (3,125 ppm), nấm men bị kìm hãm sinh trưởng trong 16 giờ đầu rồi phát triển trở lại nhưng với tốc độ rất chậm. Tại nồng độ $2 \times \text{MIC}$ (6,25 ppm), số lượng tế bào giảm mạnh và bị tiêu diệt hoàn toàn ở mốc 16 giờ (đây được xác định là nồng độ diệt khuẩn của nano bạc đối với Pichia). Khi nâng lên $4 \times \text{MIC}$ (12,5 ppm), nấm men bị ức chế ngay trong 4 giờ đầu và bị tiêu diệt hoàn toàn sau 12 giờ.

So sánh với các nghiên cứu trước

Kết quả xác định khoảng nồng độ ức chế tối thiểu MIC của nano bạc đối với nấm men trong khóa luận (từ 3,125 ppm đến 6,25 ppm) hoàn toàn tương đồng và nằm trọn trong dải nồng độ ức chế 3,125 mg/l đến 12,5 mg/l đối với nấm men mà nhóm tác giả Kim JS và cộng sự (2007) đã công bố trên thế giới.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Đề tài chứng minh phương pháp đối kháng trong môi trường dịch thể lỏng là phương pháp thích hợp nhất để đánh giá hoạt tính kháng nấm men của hạt nano bạc, khắc phục được nhược điểm hạt nano bị kết tụ, biến tính bởi quang hóa hoặc khó khuếch tán trong mạng lưới gel agar của các phương pháp đục lỗ hay đặt đĩa giấy truyền thống.
• Cung cấp các thông số định lượng chính xác (MIC và thời gian tiếp xúc diệt nấm) làm cơ sở dữ liệu khoa học cho việc tính toán liều lượng khi sử dụng nano bạc làm chất ức chế vi sinh vật gây hại, chống tạo váng và ngăn ngừa biến chất trong công nghệ bảo quản nước giải khát, rượu vang và bia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Hạn chế của đề tài (được tác giả nêu trong văn bản):

• Khóa luận gặp giới hạn về thời gian thực hiện (tiến hành trong thời gian thực tập tốt nghiệp) và điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm tại thời điểm nghiên cứu.
• Đối tượng thử nghiệm mới chỉ dừng lại ở hai chủng nấm men dại phân lập cục bộ (S. cerevisiae BM và Pichia sp.), chưa khảo sát mở rộng sang các chủng vi sinh vật hoại sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh khác.
• Nghiên cứu chưa đi sâu khảo sát các biến đổi vi cấu trúc của tế bào nấm men dưới tác động của nano bạc bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) dù danh mục viết tắt có đề cập thuật ngữ này.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

1. Mở rộng phạm vi nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của nano bạc đối với các đối tượng vi sinh vật khác, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh đường ruột và các loài nấm mốc gây hư hỏng nông sản, nhằm tìm ra dải nồng độ thích ứng cho từng nhóm sản phẩm thực phẩm.
2. Nghiên cứu sâu hơn về mối tương quan giữa thời gian xử lý và nhiệt độ tác động của nano bạc lên các hệ vi sinh vật khác nhau.
3. Tiến hành các thử nghiệm ứng dụng dung dịch nano bạc trực tiếp trên các mô hình bán công nghiệp hoặc quy trình sản xuất thực tế để kiểm tra khả năng kéo dài thời hạn bảo quản sản phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng và Công nghệ thực phẩm: Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về phương pháp hoạt hóa, kỹ thuật cấy gạt đếm khuẩn lạc và quy trình đối kháng dịch lỏng để xác định MIC của các vật liệu dạng keo/hạt nano.
• Nhóm nghiên cứu phát triển vật liệu kháng khuẩn: Phần tổng quan tài liệu hệ thống hóa rõ ràng cơ chế tác động của ion bạc và các yếu tố vật lý chi phối độ bền keo (kích thước, hiệu ứng bề mặt, nồng độ, hiện tượng kết đám).
• Kỹ sư công nghệ thực phẩm và đồ uống: Cung cấp thông số kỹ thuật định lượng (ngưỡng nồng độ từ 3,125 đến 25 ppm và thời gian tiếp xúc tương ứng từ 8 đến 20 giờ) để kiểm soát các sự cố lên men chua hoặc tạo màng váng do nấm men Pichia và Saccharomyces gây ra.

Câu hỏi thường gặp

1. Dung dịch nano bạc và các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu?

Dung dịch nano bạc nồng độ gốc 100 ppm được cung cấp bởi Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Hai chủng nấm men thử nghiệm (Saccharomyces cerevisiae BM và Pichia sp.) là các chủng nấm men dại được phân lập từ lá cây men rượu bản địa bởi Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2. Vì sao phương pháp đối kháng trong dịch lỏng lại được chọn thay vì phương pháp đục lỗ thạch hay đĩa giấy?

Các phương pháp khuếch tán trên thạch (đục lỗ, đĩa giấy) rất khó quan sát vòng kháng nấm do hạt nano bạc dễ bị oxy hóa một phần dưới tác động của ánh sáng, dễ kết đám lại với nhau và có kích thước phân tử lớn nên khó khuếch tán đồng đều qua mạng gel agar, đồng thời thao tác tốn nhiều thời gian. Trong khi đó, phương pháp đối kháng trong dịch lỏng cho phép hạt nano phân tán trực tiếp tiếp xúc với tế bào, dễ dàng quan sát độ đục, độ lắng cặn, giúp định lượng chính xác mật độ tế bào sống sót và xác định rõ giá trị MIC.

3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với từng chủng nấm men là bao nhiêu?

Nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae BM được xác định là 6,25 ppm, còn đối với nấm men Pichia sp. là 3,125 ppm. Nấm men Pichia có độ nhạy cảm cao hơn với nano bạc so với S. cerevisiae.

4. Cần nồng độ và thời gian bao nhiêu để dung dịch nano bạc tiêu diệt hoàn toàn các tế bào nấm men?

Để tiêu diệt hoàn toàn nấm men S. cerevisiae, dung dịch nano bạc cần nồng độ 12,5 ppm trong thời gian 20 giờ, hoặc nồng độ 25 ppm trong thời gian 8 giờ. Đối với nấm men Pichia, các tế bào bị tiêu diệt hoàn toàn ở nồng độ 6,25 ppm sau 16 giờ, hoặc ở nồng độ 12,5 ppm sau 12 giờ tiếp xúc.

5. Kết quả xác định MIC trong khóa luận có phù hợp với y văn quốc tế không?

Có. Kết quả giá trị MIC xác định được (3,125 ppm đối với Pichia và 6,25 ppm đối với S. cerevisiae) hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của tác giả Kim JS và cộng sự công bố năm 2007 về tác dụng kháng khuẩn của hạt nano bạc, trong đó ghi nhận nấm men bị ức chế ở dải nồng độ nano bạc thấp từ 3,125 mg/l đến 12,5 mg/l.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ma Trần Thu Hường đã thực hiện thành công việc đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng nấm men của nano bạc trên hai chủng hoang dại Saccharomyces cerevisiae BM và Pichia sp. phân lập từ lá cây men rượu. Nghiên cứu đã xác định phương pháp đối kháng trong dịch thể lỏng là giải pháp tối ưu để thử nghiệm hoạt tính của nano bạc, đồng thời đưa ra được các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu chính xác là 6,25 ppm đối với S. cerevisiae và 3,125 ppm đối với Pichia. Các mốc thời gian tiêu diệt hoàn toàn tế bào nấm men ở các mức nồng độ khác nhau được xác lập trong khóa luận là cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị, đóng góp dữ liệu định lượng cho việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc vào công nghệ bảo quản thực phẩm và kiểm soát hư hỏng đồ uống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bạc đã được biết đến là một chất kháng khuẩn, kháng nấm và các loài vi sinh vật có hại. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để tránh gây độc và trị bệnh. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Qua thời gian những đặc tính quý giá của bạc đã được con người khai thác và sử dụng để tạo ra nhiều sản phẩm hữu ích.

Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano, tạo ra các hạt nano bạc. Điều này làm tăng đáng kể ứng dụng của bạc đối với đời sống con người [7]. Những năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi những tính chất đặc biệt và lý thú của nó. Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano bạc đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội.

Ở kích thước nano, bạc thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt và vô cùng quý giá, đặc biệt là tính kháng vi sinh vật. Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn ( khoảng nồng độ < 100ppm) [30]. Đã có nhiều nghiên cứu xác nhận bạc dưới bất kỳ dạng nào, dù là dạng keo, dạng ion hoặc dạng hạt nano kim loại, đều thể hiện khả năng kháng khuẩn [23]. Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.

Ngoài các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng kháng vi khuẩn của nano bạc, nano bạc cũng được coi là một loại thuốc diệt nấm tác dụng nhanh chóng, hiệu quả chống lại một loạt các loại nấm thông thường bao gồm các chi như Aspergillus, Candida, Saccharomyces và Pichia. Các cơ chế chính xác về tác n 2 động của các hạt nano bạc đối với các loại nấm men vẫn không rõ ràng, nhưng có thể coi cơ chế tác động của chúng đối với nấm men tương tự như tác dụng của chất kháng sinh đã được nghiên cứu [15]. Saccharomyces cerevisiae và Pichia là hai loại nấm men thường gặp trong thực phẩm. Ngoài những lợi ích đã biết, hai chủng nấm men trên còn là một trong các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm, cần loại bỏ trong một số quy trình chế biến.

Nấm men Saccharomyces có thể làm hỏng nước ép trái cây, lên men chua các loại thực phẩm có nguồn gốc từ đường, sữa. Rượu vang thành phẩm có Pichia phát triển tạo màng trên bề mặt và làm vang bị đục, các thành phần trong vang sẽ bị biến đổi [10]. Mặt khác, hai chủng nấm men được sử dụng trong nghiên cứu là các chủng phân lập từ thực vật bản địa, chưa từng được nghiên cứu và đánh giá về sự tác động của nano bạc. Chính vì vậy, để bổ sung cơ sở dữ liệu về hạt nano bạc, phục vụ sản xuất chế phẩm kháng vi sinh vật từ nano bạc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia của nano bạc”.

Mục đích nghiên cứu Xác định được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc. Yêu cầu nghiên cứu - Lựa chọn được phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc.

- Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men S. cerevisiae và Pichia. - Đánh giá được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc theo thời gian.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Đánh giá khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc. - Đưa ra nồng độ tối thiểu của dung dịch nano bạc để ức chế S.

cerevisiae và Pichia. Ý nghĩa thực tiễn - Ứng dụng sử dụng nano bạc trong việc chế tạo vật liệu kháng khuẩn, bảo quản thực phẩm. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về nano bạc 2.

Giới thiệu về công nghệ nano 2. Công nghệ nano Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanomét (nm, 1 nm = 10-9 m) [13]. Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được - đó là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích bề mặt tiếp xúc. Trong công nghệ nano thì hạt nano là một vật liệu quan trọng.

Những năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi những tính chất đặc biệt và lý thú của nó. Vật liệu nano và phân loại Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước cỡ nanomét. Đây là đối tượng nghiên cứu của khoa học nano và công nghệ nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Tính chất của vật liệu nano bắt nguồn từ kích thước của chúng, vào cỡ nanômét, đạt tới kích thước tới hạn của nhiều tính chất hóa lý của vật liệu thông thường.

Kích thước của vật liệu nano trải một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính chất cần nghiên cứu. Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano. Sau đây là một cách phân loại dựa vào hình dáng vật liệu [6]: - Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví dụ: chấm lượng tử. n 5 - Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví dụ: dây nano,ống nano,… - Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví dụ: màng mỏng,…(Chiều ở đây có nghĩa là chiều chuyển động không bị hạn chế bởi kích thước của phần tử tải điện).

Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có các phần không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau. Cơ sở khoa học của công nghệ nano Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính [23]: - Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: Khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử được thể hiện rất rõ ràng. Vì vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần tính tới các thăng giáng ngẫu nhiên. Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn.

Ví dụ một chấm lượng tử có thể được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một nguyên tử. - Hiệu ứng bề mặt: Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối. Điều này, có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng tiếp xúc bề mặt của vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất diệt khuẩn. Đây là một tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu có kích thước nanomet so với vật liệu ở dạng khối [2].

- Kích thước tới hạn: Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ nguyên các tính chất về vật lý, hóa học khi ở dạng khối. Nếu kích thước vật liệu mà nhỏ hơn kích n 6 thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Nếu ta giảm kích thước của vật liệu đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được (400-700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và ánh sáng quan sát được sẽ thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra hiện tượng cộng hưởng. Hay như tính dẫn điện của vật liệu khi tới kích thước tới hạn thì không tuân theo định luật Ohm nữa.

Mà lúc này điện trở của chúng sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử. Mỗi vật liệu đều có những kích thước tới hạn khác nhau và bản thân trong một vật liệu cũng có nhiều kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng. Bởi vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì. Chính nhờ những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu.

Giới thiệu về bạc kim loại - Tính chất vật lý: + Bạc là kim loại chuyển tiếp, màu trắng, sáng, dễ dàng dát mỏng, có tính dẫn điện và dẫn nhiệt cao nhất và điện trở thấp nhất trong các kim loại. + Nhiệt độ nóng chảy là 961,93ºC [29]. - Tính chất hóa học: + Bạc có kí hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng tuần hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107,868 (đơn vị C). + Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1, có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1.

+ Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan trong một số axit mạnh như axit nitric, sunfuric đặc nóng,. Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano. Giới thiệu về hạt nano bạc 2. Giới thiệu chung Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano bạc đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội.

Ở kích thước nano, bạc thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt và vô cùng quý giá, đặc biệt là tính kháng khuẩn. Ở dạng phân tán với kích thước nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc được tăng lên gấp bội nhờ diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1g bạc nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm m2 chất nền [8]. Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau [7]: - Đầu tiên, bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động.