Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nước mắm là gia vị truyền thống mang giá trị dinh dưỡng cao của Việt Nam, được sản xuất thông qua quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease nội tại trong điều kiện ướp muối dài ngày. Tuy nhiên, sự phát triển của một số vi sinh vật sinh enzyme histidine decarboxylase trong quá trình chế biến và bảo quản cá nguyên liệu dẫn đến sự tích lũy amin sinh học, đặc biệt là histamine. Theo báo cáo của Hiệp hội Nước mắm Phan Thiết (2013), hàm lượng histamine trong nước mắm truyền thống dao động từ 1.000 đến 3.000 mg/L, vượt xa ngưỡng giới hạn tối đa cho phép là 400 mg/L theo Tiêu chuẩn Codex 302:2011. Việc hấp thụ thực phẩm có nồng độ histamine cao gây ra các triệu chứng dị ứng, co thắt phế quản, phát ban, tiêu chảy, giãn mạch và co thắt tim.

Các phương pháp vật lý và hóa học nhằm giảm thiểu histamine thường tốn kém chi phí, có thể sinh gốc tự do độc hại hoặc làm biến đổi chất lượng cảm quan của nước mắm. Hướng tiếp cận sinh học sử dụng vi khuẩn có hoạt tính enzyme histamine dehydrogenase phân giải histamine đang được đánh giá cao. Dù vậy, việc bổ sung tế bào vi sinh vật tự do trực tiếp vào chượp mắm hoặc nước mắm thành phẩm bộc lộ nhược điểm: khó kiểm soát công nghệ, tốn chi phí nuôi cấy và tế bào vi khuẩn có thể lẫn vào sản phẩm. Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật lên chất mang rắn cho phép tái sử dụng nhiều lần, duy trì hoạt tính enzyme ổn định và ngăn ngừa tế bào vi sinh vật tồn dư trong sản phẩm cuối cùng.

Đề tài được xây dựng nhằm giải quyết bài toán tối ưu hóa điều kiện cố định tế bào chủng vi khuẩn ưa mặn Exiguobacterium profundum CH2.1 (đã được phân lập từ chượp mắm trước đó) lên các loại chất mang khác nhau.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Mục tiêu tổng quát: Xác định ảnh hưởng của tốc độ khuấy và nồng độ muối trong dung dịch đệm đến hiệu suất cố định tế bào và khả năng phân giải histamine của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1, góp phần hoàn thiện quy trình cố định tế bào.
  2. Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
    • Đánh giá ảnh hưởng của tốc độ khuấy (50, 100, 300, 500 vòng/phút) trong quá trình cố định đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng E. profundum CH2.1 trên 4 loại chất mang (celite, bột xương lợn - pigbone, mảnh chitosan và vỏ trứng - eggshell).
    • Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl (5%, 10%, 15%, 25%) trong dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng trên 4 loại chất mang tương ứng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Sinh khối chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 và 4 loại chất mang gồm celite, bột xương lợn (pigbone), mảnh chitosan (chitosan flakes) và vỏ trứng (eggshell).
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 03/2021 đến tháng 09/2021.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Cơ chế hình thành và phân giải histamine: Histamine ($C_5H_9N_3$) hình thành do phản ứng khử carboxyl của amino acid histidine dưới sự xúc tác của enzyme histidine decarboxylase từ vi sinh vật nhiễm tạp. Chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum phân giải histamine nhờ enzyme nội bào histamine dehydrogenase, xúc tác quá trình oxy hóa tách nhóm amine để chuyển hóa histamine thành imidazole acetaldehyde và giải phóng ammonia ($NH_3$).
  • Đặc điểm vi sinh vật: Exiguobacterium profundum là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, ưa mặn, không tạo bào tử, phát triển trong dải nhiệt độ 12–49°C (tối ưu 37°C) và pH 5,5–9,5 (tối ưu pH 7,0).
  • Phương pháp và chất mang cố định:
    • Hấp phụ vật lý (Adsorption): Dựa trên tương tác vật lý yếu giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt xốp của chất mang, áp dụng cho celite (khoáng silica tảo cát chứa 89% $SiO_2$), mảnh chitosan (biopolymer deacetyl từ chitin) và bột xương lợn pigbone (chứa 60% chất hữu cơ chủ yếu là collagen và 40% chất vô cơ giàu hydroxyapatite $Ca_5(PO_4)_3(OH)$).
    • Liên kết chéo (Cross-linking): Dựa trên liên kết cộng hóa trị giữa tế bào vi khuẩn và cấu trúc protein-vô cơ của vỏ trứng eggshell thông qua tác nhân liên kết glutaraldehyde 6%.
  • Tiêu chuẩn chất lượng: Tiêu chuẩn Codex 302:2011 về nước mắm; Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5107:2013 (Nước mắm) và TCVN 8336:2010 (Chượp chín).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Nuôi cấy và thu nhận sinh khối: Hoạt hóa chủng CH2.1 trong môi trường lỏng Halophilic (HA) bổ sung 21% NaCl ở 37°C, lắc 200 vòng/phút. Thu hồi sinh khối bằng ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút, sau đó rửa sạch tế bào bằng đệm Tris-HCl 50 mM (pH 7,0).
  • Bố trí thí nghiệm:
    • Thí nghiệm 1 (Tốc độ khuấy): Cố định ở 4°C trong 1 giờ, tỷ lệ sinh khối/chất mang là 1/10 (g/g), đệm Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) chứa 25% NaCl; khảo sát ở 4 mức tốc độ: 50, 100, 300 và 500 vòng/phút.
    • Thí nghiệm 2 (Nồng độ muối): Cố định ở 4°C trong 1 giờ, tỷ lệ 1/10 (g/g), tốc độ khuấy cố định 100 vòng/phút; khảo sát nồng độ NaCl ở các mức 5%, 10%, 15% và 25%.
  • Phương pháp xác định hoạt tính và định lượng histamine bằng HPLC:
    • Phản ứng phân giải thực hiện với 0,1 g mẫu trong 1 mL đệm Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) chứa $500,\mu\text{M}$ 1-methoxy PMS và 5 mM histamine dihydrochloride, ủ ở 37°C trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng HCl 0,1 N.
    • Tạo dẫn xuất huỳnh quang tự động với O-phthalaldehyde (OPA) kết hợp $\beta$-mercaptoethanol (BME) trong đệm borat (pH 10).
    • Phân tích trên hệ thống HPLC với cột Agilent Eclipse XDB-C18 ($5,\mu\text{m},,4{,}6 \times 250\text{ mm}$), detector huỳnh quang ($\lambda_{\text{kích thích}} = 230\text{ nm}$, $\lambda_{\text{phát xạ}} = 450\text{ nm}$), nhiệt độ cột 40°C, tốc độ dòng 1 mL/phút. Pha động gồm kênh A: $CH_3COONH_4$ 20 mM (pH 5) và kênh B: Acetonitrile (pH 3) theo tỷ lệ 80:20.
    • Đường chuẩn histamine xây dựng trong khoảng nồng độ 0,5–5 mM đạt phương trình: $y = 925{,}24x - 0{,}7344$ ($R^2 = 0{,}9997$).
  • Xử lý số liệu: Thí nghiệm lặp lại 2 lần ($n=2$), xử lý số liệu thống kê qua phần mềm Excel 2010 và phân tích phương sai One-way ANOVA kèm kiểm định Tukey qua phần mềm Minitab 16.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả nêu bật vai trò thiết yếu của nước mắm trong văn hóa ẩm thực và kinh tế thủy sản Việt Nam, đồng thời chỉ ra thực trạng mức thôi nhiễm histamine trong nước mắm truyền thống vượt ngưỡng an toàn Codex quốc tế. Đặt ra yêu cầu cấp thiết phải ứng dụng giải pháp cố định tế bào chủng vi khuẩn phân giải histamine E. profundum CH2.1 lên chất mang để xử lý amin sinh học mà không gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan và an toàn thực phẩm. Xác lập mục đích, yêu cầu và phạm vi nghiên cứu của khóa luận.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các kiến thức nền tảng gồm:

  • Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống (nguyên liệu cá, muối loại 2, quá trình gài nén, đánh khuấy và lên men chượp) và tiêu chuẩn chất lượng theo TCVN 5107:2013.
  • Cấu trúc hóa học, cơ chế hình thành, độc tính của histamine đối với hệ hô hấp, tiêu hóa, tim mạch và thần kinh.
  • Phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp làm giảm histamine (vật lý, hóa học, vi sinh vật).
  • Cơ chế của các kỹ thuật cố định tế bào (hấp phụ vật lý, liên kết chéo); cấu trúc, đặc tính hóa lý của 4 chất mang (celite, chitosan, bột xương lợn, vỏ trứng).
  • Đặc điểm sinh học của chi Exiguobacterium và cơ chế phân giải histamine qua enzyme histamine dehydrogenase của chủng E. profundum.
  • Phân tích ảnh hưởng của động học khuấy trộn và nồng độ thẩm thấu của muối đến quá trình khuếch tán, liên kết tế bào lên chất mang.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất tinh khiết, trang thiết bị phân tích (máy HPLC, máy đo pH Thermo Scientific, máy khuấy từ IKA RH basic 2, tủ nuôi lắc JSR...). Mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị và xử lý 4 loại chất mang:

  • Xương lợn: loại bỏ mỡ, hấp vô trùng 120°C trong 20 phút, nghiền và sàng lấy kích thước hạt $37\text{--}105,\mu\text{m}$, rửa bằng ethanol và nước cất.
  • Vỏ trứng: đun sôi 20 phút, rửa acetone, sấy 60°C trong 12 giờ, xay mịn, sàng qua rây 100 mesh và tạo liên kết chéo với glutaraldehyde 6%.
  • Mảnh chitosan: ngâm trong hexane và rửa đệm.
  • Celite: sấy đông khô sau hấp phụ ở -50°C trong 48 giờ.

Quy định công thức tính hiệu suất cố định (HSCĐ) và khả năng phân giải histamine (KNPG) sau 2 giờ phản ứng.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày và thảo luận số liệu thực nghiệm thu được từ 2 nội dung nghiên cứu chính:

1. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine

Tốc độ khuấy ảnh hưởng trực tiếp đến sự tiếp xúc và khuếch tán của tế bào vào các lỗ xốp trên chất mang:

  • Chất mang celite và bột xương lợn (pigbone): Đạt giá trị cực đại tại tốc độ 100 vòng/phút.
    • Celite đạt HSCĐ $36{,}20 \pm 1{,}00%$ và KNPG $37{,}13 \pm 0{,}11%$. Khi tăng lên 500 vòng/phút, HSCĐ và KNPG giảm mạnh xuống lần lượt còn $19{,}29 \pm 0{,}99%$ và $19{,}62 \pm 1{,}01%$.
    • Bột xương lợn pigbone đạt HSCĐ $44{,}60 \pm 1{,}24%$ và KNPG $43{,}89 \pm 0{,}85%$. Tại 500 vòng/phút, HSCĐ chỉ còn $27{,}05 \pm 0{,}47%$ và KNPG đạt $24{,}85 \pm 2{,}60%$.
  • Chất mang mảnh chitosan và vỏ trứng (eggshell): Đạt giá trị tối ưu tại tốc độ 300 vòng/phút.
    • Chitosan đạt HSCĐ $29{,}93 \pm 0{,}46%$ và KNPG $31{,}28 \pm 1{,}46%$ (cao hơn đáng kể so với mức 50 vòng/phút có HSCĐ $14{,}32 \pm 0{,}53%$).
    • Vỏ trứng đạt HSCĐ $21{,}99 \pm 0{,}58%$ và KNPG $18{,}92 \pm 0{,}21%$.
  • Giải thích cơ chế: Tốc độ khuấy quá thấp làm hạn chế sự khuếch tán tế bào vào bề mặt chất mang; ngược lại, tốc độ quá cao (500 vòng/phút) tạo lực cắt thủy động lớn gây rửa trôi tế bào đã hấp phụ hoặc phá vỡ liên kết gắn kết.

2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine

Khảo sát nồng độ NaCl (5%, 10%, 15%, 25%) trong đệm Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) ở tốc độ khuấy 100 vòng/phút:

  • Cả 4 loại chất mang đều cho hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine đạt đỉnh ở nồng độ muối 15%:
    • Celite: HSCĐ đạt $34{,}93 \pm 0{,}39%$, KNPG đạt $36{,}36 \pm 1{,}41%$.
    • Bột xương lợn: HSCĐ đạt $41{,}65 \pm 0{,}72%$, KNPG đạt $41{,}68 \pm 0{,}23%$.
    • Chitosan: HSCĐ đạt $29{,}87 \pm 0{,}23%$, KNPG đạt $30{,}58 \pm 0{,}36%$.
    • Vỏ trứng: HSCĐ đạt $22{,}48 \pm 0{,}66%$, KNPG đạt $21{,}82 \pm 1{,}70%$.
  • Ở nồng độ muối thấp (5%), hoạt tính enzyme và khả năng bám dính của chủng vi khuẩn ưa mặn E. profundum CH2.1 bị hạn chế (HSCĐ trên pigbone chỉ đạt $27{,}41 \pm 0{,}46%$). Khi nồng độ muối tăng quá cao lên 25%, áp suất thẩm thấu lớn làm giảm nhẹ hiệu suất cố định và khả năng phân giải do ức chế một phần hoạt tính trao đổi chất.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu cho từng loại chất mang; khẳng định bột xương lợn (pigbone) là chất mang hiệu quả nhất; đề xuất các hướng thử nghiệm tiếp theo trên nước mắm cốt thực tế.

Kết quả và đóng góp

Tổng hợp số liệu thực nghiệm tối ưu

Loại chất mang Cơ chế cố định Tốc độ khuấy tối ưu (v/p) Nồng độ muối tối ưu (%) Hiệu suất cố định cực đại (%) Khả năng phân giải histamine cực đại sau 2h (%)
Bột xương lợn (Pigbone) Hấp phụ vật lý 100 15 $44{,}60 \pm 1{,}24$ $43{,}89 \pm 0{,}85$
Celite Hấp phụ vật lý 100 15 $36{,}20 \pm 1{,}00$ $37{,}13 \pm 0{,}11$
Mảnh Chitosan Hấp phụ vật lý 300 15 $29{,}93 \pm 0{,}46$ $31{,}28 \pm 1{,}46$
Vỏ trứng (Eggshell) Liên kết chéo 300 15 $21{,}99 \pm 0{,}58$ $18{,}92 \pm 0{,}21$

Ghi chú: Giá trị tổng hoạt tính của tế bào ban đầu đạt $36{,}68 \pm 3{,}83\text{ unit/g}$. Phân tích phương sai One-way ANOVA cho thấy sự khác biệt giữa các mức tốc độ khuấy và nồng độ muối đều có ý nghĩa thống kê ($P < 0{,}05$, hệ số $R^2 > 97%$).

Đóng góp khoa học và thực tiễn của tác giả

  • Đóng góp mới: Xác định được thông số động học khuấy và nồng độ muối tối ưu để cố định chủng vi khuẩn ưa mặn Exiguobacterium profundum CH2.1; chứng minh tiềm năng vượt trội của phụ phẩm bột xương lợn (pigbone) làm chất mang sinh học rẻ tiền, sẵn có, cho hiệu suất cố định và phân giải histamine cao nhất trong số 4 chất mang khảo sát.
  • Giải pháp đề xuất: Ứng dụng chế phẩm tế bào cố định trên bột xương lợn vào công đoạn xử lý histamine trong quy trình chế biến nước mắm, giúp sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm theo quy định Codex 302:2011.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

Do ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19 và những hạn chế về thời gian cũng như trang thiết bị phân tích trong giai đoạn thực hiện, khóa luận chưa triển khai được các thử nghiệm đánh giá độ bền hoạt tính qua nhiều chu kỳ tái sử dụng và chưa tiến hành thử nghiệm trực tiếp trên nền mẫu nước mắm cốt thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  1. Tiếp tục khảo sát kết hợp các yếu tố công nghệ khác (nhiệt độ, thời gian cố định, tỷ lệ sinh khối/chất mang) để hoàn thiện quy trình công nghệ cố định tối ưu toàn diện.
  2. Đánh giá khả năng và động học phân giải histamine của chế phẩm tế bào cố định trực tiếp trong môi trường nước mắm cốt thương phẩm.
  3. Nghiên cứu độ bền cơ lý, khả năng tái sử dụng và thời gian bảo quản khả thi của chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Hóa sinh thực phẩm và Chế biến thủy hải sản.
    • Các kỹ sư công nghệ và nhà nghiên cứu tại các doanh nghiệp chế biến nước mắm truyền thống đang tìm kiếm giải pháp kiểm soát amin sinh học.
  • Nội dung giá trị chuyên sâu:
    • Quy trình phân tích định lượng histamine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng dẫn xuất OPA với độ nhạy cao.
    • Phương pháp xử lý và chuẩn bị các nguồn chất mang giá rẻ từ phế phụ phẩm nông nghiệp (vỏ trứng, xương lợn) và vật liệu tự nhiên (chitosan, celite) phục vụ kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao bột xương lợn (pigbone) lại cho hiệu suất cố định và phân giải histamine cao nhất?

Bột xương lợn có cấu trúc xốp với diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, chứa 60% chất hữu cơ (phần lớn là mạng lưới collagen cung cấp nhiều vị trí liên kết ái lực với protein vi khuẩn) và 40% chất vô cơ giàu hydroxyapatite có độ tương thích sinh học cao. Sự kết hợp này tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào E. profundum CH2.1 bám dính vững chắc mà không làm mất hoạt tính enzyme.

2. Vì sao nồng độ muối tối ưu cho quá trình cố định của cả 4 chất mang đều là 15% NaCl?

Chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 là vi khuẩn ưa mặn (halophilic) được phân lập từ chượp mắm. Nồng độ muối 15% NaCl tạo điều kiện áp suất thẩm thấu phù hợp nhất để duy trì cấu trúc màng tế bào, kích thích hoạt tính của enzyme nội bào histamine dehydrogenase và hỗ trợ tương tác bề mặt tế bào - chất mang. Nồng độ 5% quá thấp đối với vi khuẩn ưa mặn, trong khi nồng độ 25% gây ức chế một phần hoạt động sinh lý.

3. Tốc độ khuấy 500 vòng/phút ảnh hưởng tiêu cực như thế nào đến quá trình cố định?

Ở tốc độ khuấy cao 500 vòng/phút, lực cắt thủy động trong môi trường lỏng tăng mạnh. Lực này cản trở sự bám dính của vi khuẩn, đồng thời làm bong tróc, rửa trôi các tế bào đã được hấp phụ vật lý trên bề mặt chất mang celite, pigbone và chitosan, dẫn đến hiệu suất cố định suy giảm nghiêm trọng.

4. Hệ thống HPLC phân tích histamine trong nghiên cứu sử dụng điều kiện vận hành nào?

Nghiên cứu sử dụng cột Agilent Eclipse XDB-C18 ($5,\mu\text{m},,4{,}6 \times 250\text{ mm}$), detector huỳnh quang ở bước sóng kích thích 230 nm và phát xạ 450 nm, nhiệt độ cột 40°C. Pha động gồm dung dịch $CH_3COONH_4$ 20 mM (pH 5) và acetonitrile (pH 3) theo tỷ lệ 80:20, tốc độ dòng 1 mL/phút, dẫn xuất hóa tự động với thuốc thử O-phthalaldehyde (OPA).

5. Khác biệt cơ bản về cơ chế cố định giữa vỏ trứng (eggshell) và 3 chất mang còn lại là gì?

Celite, chitosan và pigbone cố định tế bào theo cơ chế hấp phụ vật lý (adsorption) dựa trên tương tác bề mặt không cộng hóa trị. Ngược lại, vỏ trứng (eggshell) sử dụng phương pháp liên kết chéo (cross-linking) nhờ bổ sung tác nhân glutaraldehyde 6% để tạo liên kết cộng hóa trị bền vững giữa các nhóm chức ($-NH_2$, $-OH$, $-COOH$) trên màng protein vỏ trứng với thành tế bào vi khuẩn.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Văn Tú đã giải quyết thành công bài toán xác định các thông số công nghệ khuấy trộn và nồng độ muối tối ưu cho quá trình cố định chủng vi khuẩn ưa mặn Exiguobacterium profundum CH2.1 trên 4 loại chất mang rắn. Kết quả thực nghiệm chứng minh chất mang bột xương lợn (pigbone) đạt hiệu quả cao nhất ở tốc độ khuấy 100 vòng/phút và nồng độ muối 15% NaCl với hiệu suất cố định đạt $44{,}60%$ và khả năng phân giải histamine đạt $43{,}89%$ sau 2 giờ. Công trình cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng, mở ra hướng ứng dụng công nghệ sinh học xử lý amin sinh học nhằm nâng cao độ an toàn cho ngành sản xuất nước mắm truyền thống Việt Nam.