Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nước mắm truyền thống là gia vị đặc trưng và là mặt hàng thủy sản quan trọng của Việt Nam. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất khi xuất khẩu nước mắm sang thị trường quốc tế là hàm lượng histamine cao. Theo Báo cáo của Hiệp hội Nước mắm Phan Thiết (2013), hàm lượng histamine trong nước mắm Việt Nam dao động từ 1.000 đến 3.000 mg/l, trong khi Tiêu chuẩn Thực phẩm Quốc tế (Codex) quy định mức tối đa không được vượt quá 400 mg/l. Histamine vượt ngưỡng có thể gây ra nhiều triệu chứng ngộ độc và dị ứng như nổi mề đay, mẩn ngứa, đau đầu, tiêu chảy, co thắt khí quản, hạ huyết áp (Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, 2007).

Việc xử lý histamine bằng các phương pháp hóa lý thường tốn kém và có nguy cơ ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm cũng như sức khỏe người tiêu dùng. Ngược lại, phương pháp sinh học sử dụng vi khuẩn phân giải histamine mang lại độ an toàn cao. Việc bổ sung trực tiếp vi khuẩn tự do vào nước mắm thành phẩm gặp nhược điểm là khó kiểm soát quy trình công nghệ, màu sắc, độ lên men và tốn kém chi phí. Do đó, kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn lên chất mang là hướng tiếp cận giúp duy trì hoạt tính sinh học, cho phép tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách khỏi sản phẩm theo ý muốn.

Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.
  2. Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn chịu mặn Virgibacillus campisalis TT8.5 (phân lập từ chượp mắm, kế thừa từ nghiên cứu của TS. Trần Thị Thu Hằng và cộng sự, 2019); bốn loại chất mang cố định gồm Celite (Ấn Độ), bột xương lợn - pigbone (Việt Nam), mảnh chitosan - chitosan flakes (Đức) và vỏ trứng - eggshell (Việt Nam).
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm và Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 03/2021 đến tháng 09/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Histamine và sự hình thành trong nước mắm: Histamine ($C_5H_9N_3$, tên khoa học: 2-(3H-imidazol-4-yl) ethanamine) là amin sinh học dị vòng, nhiệt độ nóng chảy $83,5^\circ\text{C}$, nhiệt độ sôi $209,5^\circ\text{C}$. Histamine hình thành chủ yếu do phản ứng khử carboxyl của axit amin L-histidine dưới sự xúc tác của enzyme histidine decarboxylase do vi sinh vật tiết ra trong quá trình ủ chượp (đặc biệt tăng nhanh trong 6 tháng đầu và đạt đỉnh vào tháng thứ 6 theo Lee và cs, 2013).
  • Đặc điểm vi khuẩn Virgibacillus campisalis: Thuộc chi Virgibacillus, họ Bacillaceae; trực khuẩn Gram dương, kích thước $(0,52 - 0,67) \times (1,21 - 1,82),\mu\text{m}$, có khả năng tạo nội bào tử chịu nhiệt và sinh trưởng trong nồng độ muối $5 - 20%$ NaCl (tối ưu ở $37^\circ\text{C}$, pH $7,5 - 8,0$, muối $4 - 5%$).
  • Nguyên lý cố định tế bào:
    • Phương pháp hấp phụ vật lý (Adsorption): Áp dụng cho Celite (chứa $89%,\text{SiO}_2$, độ xốp cao), Pigbone ($60%$ chất hữu cơ, $40%$ vô cơ chứa hydroxyapatite $\text{Ca}_5(\text{PO}_4)_3(\text{OH})$, kích thước hạt $37 - 105,\mu\text{m}$) và Chitosan flakes (polysaccharide từ chitin).
    • Phương pháp liên kết chéo (Cross-linking): Áp dụng cho Eggshell (màng vỏ trứng chứa $80%$ protein, $20%$ vô cơ), sử dụng tác nhân tạo liên kết cộng hóa trị là glutaraldehyde $6%$.
  • Tiêu chuẩn tham chiếu: TCVN 8336:2010 về chượp chín; tiêu chuẩn Codex về giới hạn histamine trong nước mắm ($\le 400,\text{mg/l}$).

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

  • Nuôi cấy và thu sinh khối: Hoạt hóa chủng TT8.5 trên môi trường lỏng Halophilic (HA) bổ sung $21%,\text{NaCl}$ ở $37^\circ\text{C}$, lắc 200 vòng/phút trong 2 ngày; nuôi nhân sinh khối trong bình chứa $700,\text{ml}$ môi trường HA $21%$ bổ sung $70,\text{ml}$ histamine 500 ppm trong 3 ngày; ly tâm thu sinh khối ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
  • Bố trí thí nghiệm:
    • Thí nghiệm 1 (Ảnh hưởng của nhiệt độ): Khảo sát ở $4^\circ\text{C}$, nhiệt độ phòng và $37^\circ\text{C}$; cố định trong thời gian 1 giờ, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nồng độ muối $25%$.
    • Thí nghiệm 2 (Ảnh hưởng của thời gian): Khảo sát các mốc 0,5 giờ; 1,0 giờ; 1,5 giờ và 3,0 giờ; cố định ở nhiệt độ $4^\circ\text{C}$, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nồng độ muối $25%$.
  • Phương pháp phân tích HPLC: Xác định nồng độ histamine bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, cột C18 ($5,\mu\text{m}, 4,6 \times 250,\text{mm}$), nhiệt độ cột $40^\circ\text{C}$, detector huỳnh quang (bước sóng kích thích 230 nm, phát xạ 450 nm), tốc độ dòng $1,\text{ml/phút}$, thể tích tiêm $5,\mu\text{l}$, dẫn xuất hóa tự động trước cột bằng dung dịch OPA (o-Phthalaldehyde) và BME ($\beta$-mercaptoethanol). Pha động gồm Kênh A ($\text{CH}_3\text{COONH}_4,0,02,\text{M}$, pH 5) và Kênh B (Acetonitrile $100%$, pH 3) theo tỷ lệ A:B = 80:20.
  • Xử lý số liệu: Phần mềm MINITAB 16 (phân tích phương sai One-way ANOVA và so sánh cặp Tukey ở mức ý nghĩa $p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mục đích và yêu cầu

Trình bày tính cấp thiết của việc giảm thiểu histamine trong nước mắm truyền thống nhằm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm và rào cản kỹ thuật xuất khẩu. Xác định mục tiêu trọng tâm là khảo sát tác động của hai thông số kỹ thuật cốt lõi (nhiệt độ và thời gian) lên hiệu suất cố định tế bào Virgibacillus campisalis TT8.5 và khả năng phân giải histamine của chế phẩm trên bốn loại chất mang.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa các cơ sở lý luận về quy trình sản xuất nước mắm truyền thống (phương pháp gài nén, đánh khuấy, hỗn hợp); bản chất hóa sinh và độc tính của histamine; đặc tính phân loại và sinh học của vi khuẩn chịu mặn Virgibacillus campisalis; phân tích cấu trúc vi mô, cơ chế bám dính và tiêu chuẩn lựa chọn bốn vật liệu mang (Celite, Pigbone, Chitosan flakes, Eggshell); so sánh ưu nhược điểm giữa phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết chéo bằng glutaraldehyde.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật TT8.5; danh mục trang thiết bị, hóa chất và môi trường dinh dưỡng halophilic bổ sung $21%,\text{NaCl}$. Chi tiết hóa quy trình điều chế chất mang (xử lý xương lợn, nghiền sàng vỏ trứng qua lưới 100 mesh, xử lý chitosan bằng hexane), kỹ thuật cố định tế bào, quy trình sấy đông khô ở $-50^\circ\text{C}$ trong 48 giờ, chương trình dẫn xuất hóa tự động OPA 9 bước và điều kiện phân tích trên máy HPLC.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

  • Hình thái chế phẩm và đường chuẩn: Ghi nhận đặc điểm hình thái của chế phẩm trước và sau khi sấy đông khô. Xây dựng đường chuẩn định lượng histamine trên HPLC trong khoảng nồng độ $0,25 - 5,\text{mM}$ đạt độ tương quan cao: $y = 891,93x + 1,8453$ với hệ số $R^2 = 0,9991$.
  • Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Phân tích biến thiên hiệu suất cố định và hoạt tính phân giải histamine sau 2 giờ ở $4^\circ\text{C}$, nhiệt độ phòng và $37^\circ\text{C}$. Kết quả cho thấy nhiệt độ $4^\circ\text{C}$ đem lại hiệu quả cao nhất trên toàn bộ bốn chất mang.
  • Khảo sát ảnh hưởng của thời gian: Đánh giá các mốc thời gian từ 0,5 đến 3 giờ tại điều kiện tối ưu $4^\circ\text{C}$. Kết quả chứng minh thời gian cố định 1 giờ là điểm tối ưu cho cả bốn loại chất mang, trong khi kéo dài thời gian đến 3 giờ làm suy giảm hiệu suất do hiện tượng rửa trôi hoặc tổn thương tế bào.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các thông số tối ưu thu được từ thực nghiệm ($4^\circ\text{C}$ và 1 giờ); xếp hạng hiệu quả của các chất mang (Pigbone > Celite > Chitosan flakes > Eggshell); đồng thời nêu các kiến nghị mở rộng nghiên cứu về nồng độ muối, tốc độ khuấy và thử nghiệm trực tiếp trên nước mắm thành phẩm.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chi tiết

1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine (thời gian cố định 1 giờ, khuấy 100 v/p, muối 25%)

Chất mang Nhiệt độ Hiệu suất cố định (%) Khả năng phân giải histamine sau 2h (%)
Pigbone $4^\circ\text{C}$ $47,76 \pm 0,57$ $45,16 \pm 1,18$
Nhiệt độ phòng $32,07 \pm 0,20$ $31,34 \pm 1,34$
$37^\circ\text{C}$ $31,71 \pm 1,29$ $36,54 \pm 1,97$
Celite $4^\circ\text{C}$ $41,56 \pm 0,28$ $36,15 \pm 1,99$
Nhiệt độ phòng $26,69 \pm 0,60$ $24,71 \pm 2,23$
$37^\circ\text{C}$ $28,95 \pm 1,29$ $24,88 \pm 5,23$
Chitosan flakes $4^\circ\text{C}$ $31,83 \pm 1,10$ $34,24 \pm 0,21$
Nhiệt độ phòng $25,21 \pm 1,25$ $26,48 \pm 0,30$
$37^\circ\text{C}$ $27,70 \pm 2,81$ $29,69 \pm 1,85$
Eggshell $4^\circ\text{C}$ $21,37 \pm 0,16$ $18,95 \pm 2,05$
Nhiệt độ phòng $18,92 \pm 0,10$ $13,67 \pm 0,16$
$37^\circ\text{C}$ $11,37 \pm 0,68$ $8,38 \pm 0,46$

2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine (ở nhiệt độ tối ưu $4^\circ\text{C}$, khuấy 100 v/p, muối 25%)

Chất mang Thời gian Hiệu suất cố định (%) Khả năng phân giải histamine sau 2h (%)
Pigbone 0,5 giờ $39,13 \pm 0,23$ $34,95 \pm 0,02$
1,0 giờ $51,74 \pm 0,48$ $50,62 \pm 0,19$
1,5 giờ $45,78 \pm 1,05$ $42,52 \pm 0,40$
3,0 giờ $28,94 \pm 0,04$ $23,47 \pm 0,93$
Celite 0,5 giờ $37,32 \pm 0,52$ $34,03 \pm 0,96$
1,0 giờ $42,05 \pm 0,32$ $39,77 \pm 0,47$
1,5 giờ $32,71 \pm 0,19$ $29,44 \pm 0,51$
3,0 giờ $25,87 \pm 0,58$ $23,19 \pm 0,75$
Chitosan flakes 0,5 giờ $15,21 \pm 0,31$ $15,67 \pm 0,88$
1,0 giờ $34,69 \pm 0,17$ $34,68 \pm 1,25$
1,5 giờ $27,93 \pm 0,02$ $27,90 \pm 1,13$
3,0 giờ $21,71 \pm 1,75$ $22,83 \pm 0,18$
Eggshell 0,5 giờ $15,22 \pm 0,13$ $16,62 \pm 0,21$
1,0 giờ $21,25 \pm 0,02$ $21,26 \pm 0,13$
1,5 giờ $9,81 \pm 0,09$ $10,40 \pm 0,51$
3,0 giờ $4,50 \pm 1,74$ $5,21 \pm 1,97$

Đóng góp và giải pháp đề xuất

  • Đóng góp khoa học: Xác lập được bộ dữ liệu thực nghiệm chuẩn hóa về ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên quá trình cố định chủng Virgibacillus campisalis TT8.5. Chứng minh bột xương lợn (Pigbone) là chất mang tiềm năng nhất (đạt hiệu suất cố định $51,74%$ và phân giải histamine $50,62%$ ở điều kiện $4^\circ\text{C}$ trong 1 giờ), vượt trội hơn Celite, Chitosan và màng vỏ trứng.
  • Giải pháp kỹ thuật: Đề xuất điều kiện tối ưu để chế tạo chế phẩm vi khuẩn cố định phân giải histamine gồm: nhiệt độ cố định $4^\circ\text{C}$, thời gian cố định 1 giờ, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, môi trường đệm chứa muối $25%$, kết hợp kỹ thuật sấy đông khô ở $-50^\circ\text{C}$ trong 48 giờ để bảo quản chế phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Do ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19 làm hạn chế thời gian thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, khóa luận chưa khảo sát được đầy đủ các biến số công nghệ khác (như nồng độ muối, tốc độ khuấy, tỷ lệ khối lượng chất mang/sinh khối) và chưa tiến hành thử nghiệm ứng dụng trực tiếp chế phẩm trên nền mẫu nước mắm thành phẩm thực tế.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    1. Nghiên cứu sâu hơn ảnh hưởng của nồng độ muối, tốc độ khuấy và tỷ lệ chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng TT8.5.
    2. Đánh giá thực nghiệm khả năng phân giải histamine của các tế bào cố định trong môi trường nước mắm thành phẩm thực tế.
    3. Hoàn thiện quy trình công nghệ cố định chi tiết theo từng loại chất mang để nâng cao hiệu suất và khả năng tái sử dụng.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Hóa sinh thực phẩm và Chế biến Thủy hải sản.
  • Nội dung tham khảo giá trị:
    • Quy trình phân tích định lượng histamine bằng HPLC kết hợp dẫn xuất hóa tự động OPA trước cột.
    • Kỹ thuật xử lý vật liệu phế phụ phẩm (xương lợn, vỏ trứng, chitosan) làm chất mang sinh học.
    • Phương pháp cố định tế bào vi khuẩn chịu mặn bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nhiệt độ $4^\circ\text{C}$ lại cho hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine cao hơn so với $37^\circ\text{C}$ và nhiệt độ phòng?
Ở nhiệt độ thấp ($4^\circ\text{C}$), cấu trúc màng tế bào và hoạt tính enzyme ít bị biến tính nhiệt trong suốt quá trình thao tác khuấy trộn; đồng thời nhiệt độ lạnh giúp giảm thiểu sự tự phân hủy và hạn chế thất thoát hoạt tính xúc tác của tế bào vi khuẩn khi bám dính vào chất mang.

2. Trong bốn loại chất mang khảo sát, loại nào cho hiệu quả cố định và phân giải histamine tốt nhất?
Chất mang bột xương lợn (Pigbone) đạt hiệu quả cao nhất ở mọi điều kiện khảo sát (đạt hiệu suất cố định tối đa $51,74 \pm 0,48%$ và khả năng phân giải histamine $50,62 \pm 0,19%$ ở $4^\circ\text{C}$, 1 giờ).

3. Vì sao thời gian cố định kéo dài đến 3 giờ lại làm giảm hiệu suất trên tất cả các chất mang?
Khi kéo dài thời gian khuấy trộn lên 3 giờ, tác động cơ học liên tục làm tăng mức độ va đập và ma sát, dẫn đến hiện tượng rửa trôi các tế bào đã bám dính lỏng lẻo trên bề mặt chất mang hoặc gây tổn thương cấu trúc tế bào, làm giảm tổng hoạt tính xúc tác.

4. Phương pháp cố định vi khuẩn lên chất mang vỏ trứng (Eggshell) khác gì so với ba chất mang còn lại?
Chất mang Eggshell sử dụng phương pháp liên kết chéo (cross-linking) có bổ sung chất tạo liên kết cộng hóa trị là glutaraldehyde $6%$, trong khi Celite, Pigbone và Chitosan flakes sử dụng phương pháp hấp phụ vật lý (adsorption).

Kết luận

Khóa luận đã xác định được điều kiện công nghệ thích hợp nhất để cố định chủng vi khuẩn chịu mặn Virgibacillus campisalis TT8.5 là nhiệt độ $4^\circ\text{C}$ và thời gian 1 giờ. Trong bốn loại vật liệu mang thử nghiệm, bột xương lợn (Pigbone) cho hiệu suất cố định ($51,74%$) và khả năng phân giải histamine ($50,62%$) cao nhất. Kết quả này cung cấp cơ sở thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển chế phẩm sinh học cố định nhằm xử lý histamine, nâng cao chất lượng và độ an toàn cho nước mắm truyền thống Việt Nam.