Mô phỏng liên kết và tách rời của phức hợp sinh học sử dụng động lực học phân tử song song

Luận án tiến sĩ nghiên cứu association and dissociation simulations of biomolecular complex using parallel cascade selection, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Tran Phuoc Duy
• Trường học: The University of Tokyo
• Chuyên ngành: Computational Biology and Medical Sciences
• Đề tài: Mô Phỏng Liên Kết Và Tách Rời Của Phức Hợp Sinh Học Bằng Động Lực Học Phân Tử Song Song
• Loại tài liệu: doctoral thesis
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Tokyo

Mục lục chi tiết

• Tóm tắt
• Danh mục công trình công bố
• Danh mục từ viết tắt
• 1. Chương 1: Tầm quan trọng của việc hiểu các quá trình liên kết và phân ly của phức hợp phân tử sinh học
• 1.1. Phân loại các phương pháp tính năng lượng tự do liên kết và hạn chế của các phương pháp hiện tại
• 1.2. Tính toán năng lượng tự do không sử dụng lực định hướng
• 2. Chương 2: Các phương pháp mô phỏng để tính toán năng lượng tự do liên kết
• 2.1. Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử chọn lọc tầng song song
• 2.2. Mô hình trạng thái Markov kết hợp với PaCS-MD như một công cụ ước tính năng lượng tự do tiên tiến
• 2.3. Động lực học phân tử có hướng kết hợp với đẳng thức Jarzynski
• 2.4. Phương pháp phân tích biểu đồ tần số có trọng số kết hợp với lấy mẫu Umbrella
• 3. Chương 3: Sự phân ly của phối tử nhỏ khỏi phức hợp với protein
• 3.1. Kết quả và thảo luận
• 3.1.1. Tương tác giữa LYZ và triNAG ở trạng thái liên kết và độ ổn định của phức hợp
• 3.1.2. Sự phân ly LYZ-triNAG bằng PaCS-MD
• 3.1.3. Ảnh hưởng của việc tái ngẫu nhiên hóa vận tốc và chọn lọc lên sự phân ly triNAG trong PaCS-MD
• 3.1.4. Sự phân ly LYZ-triNAG bằng SMD
• 3.1.5. Các con đường phân ly trong PaCS-MD và SMD
• 3.1.6. Năng lượng tự do phân ly
• 3.1.7. Sự phá vỡ các tương tác LYZ-triNAG trong quá trình phân ly
• 4. Chương 4: Sự phân ly của peptit khỏi phức hợp với protein
• 4.1. Kết quả và thảo luận
• 4.1.1. Cân bằng hệ thống tái cấu trúc MDM2/TAD-p53
• 4.1.2. Độ chênh lệch năng lượng tự do phân ly giữa MDM2/TAD-p53
• 4.1.3. Những thay đổi cấu trúc trong quá trình phân ly
• 5. Chương 5: Ghép nối phân tử linh hoạt của phức hợp protein/peptit
• 5.1. Kết quả và thảo luận
• 5.1.1. Độ linh hoạt của TAD-p53
• 5.1.2. Tạo các cấu hình liên kết
• 5.1.3. Dự đoán cấu trúc phức hợp tốt nhất thông qua MSM
• 6. Chương 6: Kết luận
• Tài liệu tham khảo
• Lời cảm ơn

Tóm tắt

I. Tầm quan trọng của việc hiểu các sự kiện liên kết và tách rời của phức hợp sinh học

Sự liên kết và tách rời của các phức hợp sinh học đóng vai trò quan trọng trong các hiện tượng sinh học. Ví dụ, gia đình thụ thể G Protein Coupled Receptor (GPCR) là kênh giao tiếp giữa môi trường nội bào và ngoại bào. Khi một ligand gắn vào thụ thể Adenosine A2A, GPCR chuyển sang trạng thái hoạt động, dẫn đến các sự kiện tiếp theo giúp cơ thể thích ứng với tín hiệu bên ngoài. Việc hiểu rõ các quá trình này là cần thiết để nắm bắt các hiện tượng sinh học. Để mô tả sức mạnh của sự liên kết, cần xác định "năng lượng tự do liên kết". Các phương pháp thực nghiệm như Calorimetry Titration Isothermal (ITC) và Surface Plasmon Resonance (SPR) thường được sử dụng để xác định năng lượng tự do liên kết, nhưng chúng có hạn chế về số lượng mẫu và độ phức tạp trong thiết lập thí nghiệm. Do đó, các phương pháp tính toán trở nên cần thiết trong giai đoạn đầu của nghiên cứu thiết kế tương tác sinh học.

II. Phân loại tính toán năng lượng tự do liên kết và hạn chế của các phương pháp hiện tại

Tính toán năng lượng tự do liên kết có thể được phân loại thành bốn nhóm: tích hợp nhiệt động, phương pháp dựa trên mẫu, động lực học không cân bằng và kỹ thuật điều chỉnh thích ứng. Tích hợp nhiệt động là phương pháp phổ biến, sử dụng sự tiến hóa adiabatic của trung bình thống kê để tính toán năng lượng tự do. Tuy nhiên, các phương pháp này thường gặp khó khăn trong việc mô phỏng quá trình liên kết do sự bẫy trong các cực tiểu địa phương của cảnh năng lượng tự do. Các phương pháp như Steered Molecular Dynamics (SMD) kết hợp với Umbrella Sampling (US) thường dẫn đến sự biến dạng cấu trúc protein, gây ra các ước lượng không chính xác về năng lượng tự do liên kết. Do đó, cần có các phương pháp thay thế để cải thiện độ chính xác của tính toán năng lượng tự do.

III. Tính toán năng lượng tự do mà không sử dụng lực thiên lệch

Để cải thiện tính toán năng lượng tự do liên kết, cần có các phương pháp mô phỏng không thiên lệch. Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics (PaCS-MD) đã được giới thiệu như một phương pháp đáp ứng nhu cầu này. PaCS-MD cho phép thu thập các con đường tự nhiên hơn trong quá trình liên kết và tách rời, giúp ước lượng năng lượng tự do gần với giá trị chính xác hơn. Phương pháp này đã chứng minh hiệu quả trong việc mô phỏng các sự kiện hiếm gặp, như sự gập lại của protein chignolin và chuyển đổi cấu hình của lysozyme T4. Việc lựa chọn trong PaCS-MD là yếu tố chính để tăng tốc độ lấy mẫu, từ đó xây dựng ma trận chuyển tiếp trong mô hình trạng thái Markov (MSM). Từ MSM, có thể trực tiếp trích xuất sự khác biệt năng lượng tự do cân bằng mà không cần thêm lấy mẫu như US.

IV. Mô phỏng sự tách rời của ligand nhỏ khỏi phức hợp với protein

Mô phỏng tách rời ligand tri-N-acetyl-D-glucosamine (triNAG) khỏi lysozyme lòng trắng trứng gà (LYZ) bằng PaCS-MD cho thấy hiệu quả cao. Các thử nghiệm PaCS-MD được thực hiện với ba cài đặt mô phỏng khác nhau, cho thấy PaCS-MD nhanh hơn SMD gấp năm lần. Kết quả cho thấy năng lượng tự do liên kết được tính toán từ các quỹ đạo PaCS-MD phù hợp tốt với kết quả thực nghiệm. Việc tăng số lượng bản sao trong mô phỏng giúp giảm số chu kỳ cần thiết cho quá trình tách rời, nhờ vào khả năng quan sát các sự kiện hiếm gặp. Điều này chứng tỏ rằng PaCS-MD là một công cụ mạnh mẽ cho việc mô phỏng các phức hợp sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sự liên kết (association) và tách rời (dissociation) của các phức hợp sinh học là các quá trình giữ vai trò trung tâm trong các hiện tượng sinh học, chẳng hạn như cơ chế truyền tín hiệu qua thụ thể bắt cặp protein G (GPCR). Tuy nhiên, việc mô phỏng các biến cố này bằng phương pháp Động lực học Phân tử cổ điển (Classical Molecular Dynamics - MD) gặp trở ngại lớn về quy mô thời gian (time scale), do các quá trình phân tách thường diễn ra ở thang thời gian từ mili-giây đến giây, vượt quá giới hạn tính toán thông thường. Để giải quyết rào cản này, các kỹ thuật lấy mẫu tăng cường (enhanced sampling) có sử dụng lực định hướng (biased MD) như Steered Molecular Dynamics (SMD) kết hợp Umbrella Sampling (US) thường được áp dụng. Mặc dù vậy, việc tác động ngoại lực vào khối tâm phân tử dễ gây biến dạng cấu trúc protein, khiến hệ rơi vào các trạng thái giả bền (metastable states) và dẫn đến hiện tượng ước tính quá mức năng lượng tự do liên kết (binding free energy).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là sự thiếu vắng một phương pháp lấy mẫu tăng cường hoàn toàn không sử dụng lực định hướng (unbiased), có khả năng mô phỏng quá trình phân tách và liên kết tự nhiên, đồng thời cho phép tính toán trực tiếp năng lượng tự do liên kết với chi phí tính toán tối ưu.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án bao gồm:

1. Đánh giá tính khả thi và hiệu năng của thuật toán Động lực học Phân tử Lựa chọn Xếp tầng Song song (Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics - PaCS-MD) trong việc mô phỏng quá trình phân tách phức hợp protein - phối tử nhỏ (Hen Egg White Lysozyme - triNAG) mà không áp dụng ngoại lực.
2. Xây dựng quy trình kết hợp quỹ đạo PaCS-MD với Mô hình Trạng thái Markov (Markov State Model - MSM) để trích xuất trực tiếp năng lượng tự do liên kết ($\Delta G$) mà không cần bổ sung các bước lấy mẫu như Umbrella Sampling.
3. Mở rộng ứng dụng của PaCS-MD/MSM sang hệ phức hợp protein - peptide có độ linh động cao (MDM2 - TAD-p53).
4. Phát triển quy trình mô phỏng docking linh động (flexible-body docking) cho phức hợp protein/peptide dựa trên thuật toán chuyển đổi linh hoạt giữa trạng thái liên kết và phân tách của PaCS-MD.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cấu trúc phức hợp protein - phối tử nhỏ Lysozyme/tri-N-acetyl-D-glucosamine (LYZ/triNAG, mã PDB: 1HEW) và phức hợp protein - peptide MDM2/TAD-p53.
• Phạm vi phương pháp: Phương pháp tính toán mô phỏng động lực học phân tử trên máy tính (in silico) trong hệ điều kiện mô phỏng dung môi nước tường minh (TIP3P), nồng độ muối NaCl 0.15 M, áp suất 1.0 atm và nhiệt độ 300 K.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong thực nghiệm, năng lượng tự do liên kết thường được xác định gián tiếp qua hằng số cân bằng hoặc đo trực tiếp bằng các kỹ thuật nhiệt lượng như Isothermal Titration Calorimetry (ITC - Wiseman et al., 1989), Surface Plasmon Resonance (SPR - Schasfoort et al., 2008), dập tắt huỳnh quang (fluorescence quenching), và các thử nghiệm gắn kết (binding assay). Trong đó, ITC đo lường trực tiếp nhiệt lượng tỏa ra hoặc hấp thụ nhưng đòi hỏi lượng mẫu lớn, gây khó khăn cho các protein khó biểu hiện sinh học quy mô cao.

Về mặt tính toán lý thuyết, các phương pháp xác định năng lượng tự do liên kết được phân chia thành bốn nhóm chính:

• Tích phân nhiệt động học (Thermodynamic Integration - Kirkwood, 1935).
• Phương pháp dựa trên lấy mẫu: Nhiễu loạn năng lượng tự do (Free Energy Perturbation - Zwanzig, 1954) và Lấy mẫu Ô dù (Umbrella Sampling - Kumar et al., 1992).
• Động lực học phi cân bằng: Dựa trên Đẳng thức Jarzynski (Jarzynski, 1997) kết hợp SMD (Isralewitz et al., 2001; Grubmüller et al., 1996).
• Kỹ thuật định hướng thích ứng (Adaptive Biasing): Metadynamics (Laio & Parrinello, 2002) và thuật toán Wang-Landau (Wang & Landau, 2001).

Nhiều nghiên cứu kết hợp SMD với US (Ramirez et al., 2016), Replica Exchange Umbrella Sampling (REUS - Sugita et al., 2000), hay Targeted MD với US (TMD/US - Schlitter et al., 1994; Yamashita & Fujitani, 2014) đã được triển khai. Tuy nhiên, Yamashita và Fujitani (2014) đã chỉ ra rằng khi mô phỏng sự phân tách của phức hợp Lysozyme và kháng thể HyHEL-10 bằng SMD, ngoại lực tác dụng lên khối tâm gây biến dạng cấu trúc bậc ba, dẫn đến việc tính toán thế lực trung bình (Potential of Mean Force - PMF) trong US bị sai lệch lớn.

Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp định hướng, Harada và Kitao (2011, 2013) đã phát triển thuật toán PaCS-MD nhằm lấy mẫu các biến cố hiếm như quá trình cuộn gập chignolin hoặc chuyển đổi cấu hình mở - đóng của T4 lysozyme trong thang thời gian nanosecond mà không cần ngoại lực. Tiếp đó, các biến thể như non-targeted PaCS-MD (nt-PaCS-MD) và PaCS-Fit (phù hợp với dữ liệu tán xạ tia X góc nhỏ SAXS và kính hiển vi điện tử cryo-EM) đã được mở rộng.

Vị trí của luận án: Luận án chọn giải quyết bài toán tính toán năng lượng tự do phân tách/liên kết hoàn toàn không định hướng bằng cách kết hợp PaCS-MD với MSM. Luận án đặt ra giải pháp khắc phục các sai số cấu trúc (artifacts) của SMD, đồng thời giảm tổng thời gian tính toán so với các phương pháp kết hợp Umbrella Sampling truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Quá trình phản ứng liên kết và phân tách giữa hai phân tử sinh học $A$ và $B$ được biểu diễn theo phương trình động học: $$A + B \underset{k_{off}}{\overset{k_{on}}{\rightleftharpoons}} AB$$

Hằng số phân tách cân bằng $K_d$ và hằng số liên kết $K_a$ được xác định qua tỉ lệ giữa tốc độ liên kết $k_{on}$ và tốc độ phân tách $k_{off}$: $$K_d = \frac{k_{off}}{k_{on}} = \frac{[A][B]}{[AB]} = \frac{1}{K_a}$$

Năng lượng tự do liên kết tiêu chuẩn $\Delta G^\circ$ liên hệ trực tiếp với hằng số cân bằng qua phương trình: $$\Delta G^\circ = - \frac{1}{\beta} \ln (C^\circ K_a) = - \frac{1}{\beta} \ln \left(\frac{C^\circ}{K_d}\right)$$ Trong đó $\beta = 1/(k_B T)$ và $C^\circ = 1\text{ M}$ là nồng độ tiêu chuẩn.

Trong phương pháp phi cân bằng SMD, công thực hiện $W$ lên hệ thông qua lò xo ảo có hằng số lực $k$ kéo phối tử với vận tốc không đổi $v$ được liên hệ với $\Delta G$ qua Đẳng thức Jarzynski: $$\langle e^{-\beta W_{0 \to t}} \rangle = e^{-\beta \Delta G}$$ $$W_{0 \to t} = -kv \int_0^t dt' [\xi(t') - \lambda(t')]$$

Trong phương pháp Mô hình Trạng thái Markov (MSM), động học hệ được mô tả qua ma trận chuyển tiếp xác suất $T = {T_{ij}}$ với thời gian trễ (lag time) $\tau$: $$T_{ij} = P(x(t+\tau) \in S_j \mid x(t) \in S_i)$$ Phân bố dừng (stationary distribution) $p = {p_i}$ tương ứng với vector riêng của $T$, từ đó năng lượng tự do cân bằng của trạng thái vi mô $i$ được xác định theo: $$\Delta G_i = -\frac{1}{\beta} \ln p_i$$

Phương pháp và công cụ nghiên cứu

1. Thuật toán PaCS-MD: Mô phỏng gồm nhiều chu kỳ (cycles), mỗi chu kỳ thực hiện $n_{rep}$ bản sao mô phỏng MD độc lập song song với độ dài mỗi bản sao là $t_{red}$. Tiêu chí lựa chọn cấu hình đầu vào cho chu kỳ tiếp theo là khoảng cách giữa các khối tâm (inter-COM distance) được sắp xếp theo thứ tự giảm dần. Tại đầu mỗi chu kỳ, vận tốc của các hạt được tái tạo ngẫu nhiên theo phân bố Maxwell-Boltzmann. Các cấu hình được trích xuất với tần suất 0.5 ps/snapshot.

2. Xây dựng Mô hình Trạng thái Markov (MSM): Sử dụng phần mềm MSMBuilder 3. Không gian tọa độ khoảng cách inter-COM được phân cụm thành các trạng thái vi mô bằng thuật toán k-means (Lloyd's algorithm). Ma trận chuyển tiếp được ước lượng bằng phương pháp hợp lý cực đại (maximum likelihood estimation) với thời gian trễ $\tau$ được lựa chọn dựa trên sự hội tụ của thang thời gian nội tại (implied time scale). Toàn bộ các quỹ đạo MD (cả cấu hình được chọn và không được chọn) đều được sử dụng để xây dựng MSM.

3. Thiết lập mô phỏng động lực học phân tử:

• Phần mềm: GROMACS 5.
• Trường lực: AMBER99SB cho phần protein (LYZ, MDM2), GLYCAM06 cho phối tử triNAG.
• Mô hình nước: Nước tường minh TIP3P, bổ sung ion NaCl để đạt nồng độ 0.15 M và trung hòa điện tích.
• Tích phân phương trình chuyển động: Bước thời gian 1 fs; thuật toán leap-frog và velocity Verlet; ràng buộc độ dài liên kết bằng LINCS.
• Ổn định nhiệt độ và áp suất: Bộ điều nhiệt velocity rescaling / Nosé-Hoover; bộ điều áp Berendsen / Parrinello-Rahman / MTTK. Ràng buộc vị trí yếu được đặt lên các nguyên tử lưu huỳnh của các liên kết disulfide trên LYZ.
• Công cụ hiển thị và phân tích tương tác: VMD và LigPlot+.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tầm quan trọng của việc tìm hiểu các biến cố liên kết và tách rời của phức hợp sinh học (Chapter 1)

Chương này trình bày cơ sở lý luận về vai trò của các phức hợp phân tử sinh học trong tự nhiên, lấy ví dụ từ cơ chế hoạt động của họ thụ thể GPCR Adenosine A2A khi liên kết với caffeine làm giảm phản ứng căng thẳng. Tác giả tổng quan các phương pháp thực nghiệm đo năng lượng tự do liên kết (ITC, SPR, huỳnh quang) cùng các giới hạn về lượng mẫu và quy trình kỹ thuật. Tiếp đó, chương phân loại bốn nhánh phương pháp tính toán in silico, đồng thời phân tích chi tiết khiếm khuyết của các phương pháp định hướng như SMD/US: việc áp dụng lực kéo đơn hướng làm méo mó cấu trúc protein, giam giữ hệ trong các trạng thái giả bền và dẫn đến việc ước tính sai lệch năng lượng tự do. Từ đó, chương nêu bật sự cần thiết của kỹ thuật lấy mẫu tăng cường không định hướng PaCS-MD kết hợp MSM để mô phỏng tự nhiên và tính toán chính xác năng lượng tự do liên kết.

Chương 2. Các phương pháp mô phỏng tính toán năng lượng tự do liên kết (Chapter 2)

Chương 2 thiết lập cơ sở toán học và quy trình tính toán cho bốn phương pháp được so sánh trong luận án:

• Thuật toán PaCS-MD: Định nghĩa số bản sao song song $n_{rep}$, thời gian mô phỏng mỗi bản sao $t_{red}$, cơ chế xếp hạng khoảng cách inter-COM và kỹ thuật tái tạo ngẫu nhiên vận tốc ban đầu.
• Lý thuyết MSM: Giải phương trình Master, các bước tiền xử lý dữ liệu, phân cụm k-means, ước lượng ma trận chuyển tiếp qua phương pháp xác suất cực đại và trích xuất phân bố dừng.
• Phương pháp SMD kết hợp Đẳng thức Jarzynski: Mô tả thế năng điều hòa của lò xo kéo ảo, phương trình tính công phi cân bằng $W$ và chuyển đổi sang năng lượng tự do cân bằng $\Delta G$.
• Phương pháp Weighted Histogram Analysis Method (WHAM) kết hợp Umbrella Sampling: Xây dựng hàm mật độ xác suất không định hướng từ các thế năng ô dù $V$ dọc theo tọa độ phản ứng.

Chương 3. Sự tách rời của phối tử nhỏ khỏi phức hợp với protein (Chapter 3)

Chương 3 tập trung giải quyết bài toán mô phỏng quá trình phân tách của phối tử triNAG khỏi protein Lysozyme (LYZ):

• Tính ổn định của phức hợp trong MD cổ điển: Mô phỏng MD truyền thống kéo dài 1 $\mu$s cho thấy triNAG hoàn toàn không thể phân tách khỏi khe liên kết của LYZ, khoảng cách inter-COM và giá trị RMSD duy trì ổn định nhờ mạng lưới liên kết hydro bền vững với các gốc ASN59, TRP62, TRP63, ASP101, ASN103 và ALA107.
• Hiệu năng phân tách bằng PaCS-MD: Luận án khảo sát ba thiết lập mô phỏng: $\text{PaCS-MD}{10, 0.1}$ (10 bản sao, 0.1 ns/chu kỳ), $\text{PaCS-MD}{100, 0.1}$ (100 bản sao, 0.1 ns/chu kỳ), và $\text{PaCS-MD}{10, 1.0}$ (10 bản sao, 1.0 ns/chu kỳ). Tốc độ dịch chuyển của phối tử trong PaCS-MD nhanh gấp 5 lần so với vận tốc kéo của mô phỏng SMD nhanh ($\text{SMD}{fast} = 1.25\text{ nm/ns}$). Việc tăng số lượng bản sao $n_{rep}$ từ 10 lên 100 giúp giảm 48.3% số chu kỳ cần thiết để phân tách hoàn toàn và loại bỏ hoàn toàn các chu kỳ bị bẫy (trapped cycles).

Thông số mô phỏng	$\text{PaCS-MD}_{10, 0.1}$	$\text{PaCS-MD}_{100, 0.1}$	$\text{PaCS-MD}_{10, 1.0}$
Số bản sao ($n_{rep}$)	10	100	10
Độ dài mỗi bản sao ($t_{red}$)	0.1 ns	0.1 ns	1.0 ns
Số chu kỳ trung bình đến khi tách rời ($d > 4\text{ nm}$)	34.6 chu kỳ	17.9 chu kỳ	17.9 chu kỳ
Số chu kỳ bị bẫy trung bình	4.9 chu kỳ	0 chu kỳ	4.9 chu kỳ
Hệ số tự khuếch tán trạng thái tự do ($D_{unbound}$)	$6.8 \times 10^{-5}\text{ cm}^2/\text{s}$	-	$2.3 \times 10^{-5}\text{ cm}^2/\text{s}$

• Ảnh hưởng của việc tái ngẫu nhiên hóa vận tốc: Phân tích hệ số tự khuếch tán $D$ theo phương trình Einstein cho thấy việc tái ngẫu nhiên hóa vận tốc đóng vai trò như một kích động nhiệt (perturbation), thúc đẩy hệ thoát khỏi các cực tiểu năng lượng cục bộ ở trạng thái liên kết ($D_{bound}$). Ở trạng thái tự do ($D_{unbound}$), chuyển động của phối tử bị chi phối bởi hiện tượng khuếch tán tự nhiên.
• Đặc trưng lực trong SMD: Lực cản cực đại trong SMD đạt trung bình $336.5\text{ kJ/(mol}\cdot\text{nm)}$, xuất hiện dưới dạng đỉnh đơn (single peak) hoặc đỉnh đôi (double peaks) trước khi phối tử bị kéo dứt điểm khỏi túi gắn.
• Tính toán năng lượng tự do phân tách ($\Delta G_d$):

Phương pháp	Năng lượng tự do $\Delta G_d$ hoặc $\Delta G_b$ (kJ/mol)
$\text{PaCS-MD}_{10, 1.0}\text{/MSM}$	$27.8 \pm 0.8$
$\text{PaCS-MD}_{100, 0.1}\text{/MSM}$	$27.8$
$\text{PaCS-MD}_{10, 0.1}\text{/US}$	$26.1$
$\text{PaCS-MD}_{10, 1.0}\text{/US}$	$37.1$
$\text{SMD}_{fast}\text{/US}$	$29.9$
$\text{SMD}_{med}\text{/US}$	$27.1$
$\text{SMD}_{slow}\text{/Jarzynski}$	$67.5$
$\text{SMD}_{med}\text{/Jarzynski}$	$97.0$
Thực nghiệm: ITC (pH 4.2)	$24.2$
Thực nghiệm: ITC (pH 7.5)	$25.2$
Thực nghiệm: SPR (pH 7.9)	$23.9$

Kết quả PaCS-MD/MSM đạt $27.8\text{ kJ/mol}$, phù hợp cao với giá trị thực nghiệm (23.9 - 25.2 kJ/mol). Ngược lại, phương pháp SMD/Jarzynski ước tính vượt mức nghiêm trọng (gấp 2 đến 4 lần giá trị thực nghiệm).

• Cơ chế phá vỡ tương tác: Trong PaCS-MD, quá trình phân tách diễn ra theo phương vuông góc với khe gắn kết, bắt đầu từ vòng đường NAG I, tiếp theo là NAG III và cuối cùng là NAG II. Ngược lại, lực kéo định hướng trong SMD làm thay đổi trật tự đứt gãy liên kết hydro tự nhiên, dẫn đến sai lệch năng lượng tự do.

Chương 4. Sự tách rời của peptide khỏi phức hợp với protein (Chapter 4)

Chương 4 mở rộng phạm vi nghiên cứu sang hệ phức hợp protein - peptide giữa protein MDM2 và miền hoạt hóa phiên mã của p53 (TAD-p53):

• Hệ được cân bằng và mô phỏng phân tách bằng PaCS-MD/MSM. Năng lượng tự do phân tách tính toán được là $40.7\text{ kJ/mol}$, bám sát giá trị thực nghiệm ($37\text{ kJ/mol}$). Kết quả này vượt trội về độ chính xác so với phương pháp trường thế gần đúng MM/GBSA ($68.2\text{ kJ/mol}$ theo công bố của Dastidar et al.).
• Phân tích động học chỉ ra rằng năng lượng phân tách phụ thuộc chặt chẽ vào con đường phân tách cấu hình của TAD-p53, đặc biệt là quá trình bẻ gãy tương tác xếp chồng $\pi$-$\pi$ (pi-pi stacking) của hai gốc amino acid then chốt PHE19 và TRP23 tại giao diện gắn kết với MDM2.

Chương 5. Mô phỏng docking linh động của phức hợp protein/peptide (Chapter 5)

Chương 5 ứng dụng PaCS-MD để mô phỏng đồng thời quá trình liên kết và phân tách, đóng vai trò như một thuật toán docking linh động (flexible-body docking) giữa MDM2 và TAD-p53:

• Điều kiện chuyển đổi chu kỳ: Thiết lập điều kiện tự động: nếu mô phỏng liên kết không ghi nhận sự tiến triển khoảng cách trong 20 ps liên tục, hệ tự động chuyển sang mô phỏng phân tách; khi khoảng cách inter-COM giữa MDM2 và TAD-p53 tăng thêm 2.0 nm so với điểm chuyển đổi gần nhất, hệ chuyển ngược lại sang mô phỏng liên kết.
• Kết quả docking: Qua 274 chu kỳ PaCS-MD, TAD-p53 tự tìm về đúng giao diện gắn kết tự nhiên mà không cần bất kỳ ngoại lực dẫn đường nào. Cấu trúc phức hợp tạo ra đạt giá trị RMSD giao diện liên kết thấp nhất là 0.42 nm so với cấu trúc tinh thể thực nghiệm.
• Dự đoán cấu trúc tối ưu qua MSM: Bằng cách xây dựng mô hình MSM dựa trên tọa độ khoảng cách dRMSD từ trạng thái chưa gắn kết, thế lực trung bình (PMF) được xác định. Cực tiểu năng lượng tự do trên đường cong PMF xuất hiện tại giá trị dRMSD = 4.21 nm, tương ứng chính xác với cấu trúc có sai lệch RMSD giao diện thấp nhất so với cấu trúc tinh thể PDB.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý thuyết và phương pháp

1. Chứng minh thuật toán PaCS-MD kết hợp với Mô hình Trạng thái Markov (MSM) là một phương pháp lấy mẫu tăng cường không định hướng, cho phép xác định trực tiếp năng lượng tự do liên kết/phân tách sinh học mà không cần áp dụng lực định hướng hay thực hiện thêm các bước lấy mẫu phụ trợ như Umbrella Sampling.
2. Làm sáng tỏ cơ chế gia tốc lấy mẫu của PaCS-MD: việc tăng số lượng bản sao song song ($n_{rep}$) mang lại hiệu quả vượt trội trong việc bắt giữ các biến cố hiếm so với việc kéo dài thời gian mô phỏng ($t_{red}$). Việc tái tạo ngẫu nhiên vận tốc ban đầu tạo ra kích động nhiệt cần thiết giúp hệ vượt rào thế năng ở trạng thái liên kết.
3. Cung cấp bằng chứng định lượng về nguyên nhân gây sai số của phương pháp SMD/Jarzynski: ngoại lực cưỡng bức làm thay đổi trật tự phá vỡ liên kết liên phân tử tự nhiên, tạo ra các trạng thái cấu hình không cân bằng và khiến năng lượng tự do bị ước tính quá mức.

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Tính toán thành công năng lượng tự do liên kết của hệ LYZ/triNAG ($27.8\text{ kJ/mol}$) và MDM2/TAD-p53 ($40.7\text{ kJ/mol}$), đạt độ tương đồng cao với dữ liệu thực nghiệm nhiệt lượng ITC/SPR và khắc phục sai số lớn của phương pháp MM/GBSA.
2. Hiện thực hóa quy trình docking linh động không định hướng cho phức hợp protein - peptide, cho phép dự đoán cấu trúc gắn kết chính xác dựa trên cực tiểu thế năng của mô hình Markov.
3. Thuật toán PaCS-MD có cấu trúc độc lập giữa các bản sao trong từng chu kỳ, phù hợp cho việc triển khai trên các hệ thống tính toán phân tán (distributed computing) và siêu máy tính song song quy mô lớn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Việc xây dựng mô hình Markov từ quỹ đạo PaCS-MD đòi hỏi kiểm tra cẩn thận việc lựa chọn thời gian trễ $\tau$ và số lượng trạng thái vi mô phân cụm; các thử nghiệm PaCS-MD có số bản sao nhỏ ($n_{rep} = 10$) chưa cung cấp đủ dữ liệu thống kê để xây dựng MSM độc lập cho từng thử nghiệm đơn lẻ.
• Quá trình docking linh động cho hệ phức hợp protein - peptide đòi hỏi số lượng chu kỳ mô phỏng tương đối lớn (274 chu kỳ trong nghiên cứu), cần tiếp tục tối ưu hóa các điều kiện chuyển đổi trạng thái để giảm thiểu tổng thời gian tính toán mô phỏng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Sinh học Tính toán, Hóa tin học, Lý sinh học phân tử: Cung cấp khung lý thuyết và quy trình chi tiết để triển khai các mô phỏng lấy mẫu tăng cường (PaCS-MD, MSM, SMD, WHAM/US).
• Các nhóm nghiên cứu thiết kế thuốc in silico và kỹ thuật protein: Cung cấp phương pháp tính toán năng lượng tự do liên kết và docking linh động có độ chính xác cao để sàng lọc các phân tử phối tử và peptide ức chế.
• Nội dung đáng tham khảo chuyên sâu: Phần phân tích động học khuếch tán và ảnh hưởng của tái ngẫu nhiên hóa vận tốc tại Chương 3; quy trình thiết lập điều kiện chuyển đổi trạng thái docking linh động tại Chương 5.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao cấu hình $\text{PaCS-MD}{100, 0.1}$ có hiệu năng lấy mẫu cao hơn $\text{PaCS-MD}{10, 1.0}$ dù tiêu tốn cùng tổng thời gian tính toán mỗi chu kỳ?
Xác suất bắt gặp các biến cố hiếm (như sự phân tách phối tử) tỷ lệ thuận với số lượng bản sao độc lập được khởi tạo ($n_{rep}$). Cấu hình 100 bản sao giúp quét không gian cấu hình dày đặc hơn tại mỗi chu kỳ, giảm 48.3% tổng số chu kỳ cần thiết để phân tách hoàn toàn và loại bỏ hoàn toàn hiện tượng hệ bị rơi vào các chu kỳ bẫy (trapped cycles).

2. Tại sao phương pháp SMD kết hợp Đẳng thức Jarzynski lại ước tính năng lượng tự do phân tách cao hơn nhiều so với thực nghiệm?
Trong SMD, ngoại lực tác dụng đơn hướng lên khối tâm phối tử cưỡng ép phân tử phân tách theo một lộ trình nhân tạo, làm thay đổi trật tự đứt gãy tự nhiên của các liên kết hydro và gây biến dạng cấu trúc cục bộ. Do thang thời gian mô phỏng nhanh hơn thực nghiệm nhiều bậc độ lớn, công phi cân bằng tác dụng lên hệ rất lớn, dẫn đến việc chuyển đổi qua Đẳng thức Jarzynski bị tích lũy sai số và ước tính quá cao năng lượng tự do.

3. Tái ngẫu nhiên hóa vận tốc theo phân bố Maxwell-Boltzmann có tác dụng gì trong thuật toán PaCS-MD?
Ở trạng thái liên kết sâu trong túi gắn, tái ngẫu nhiên hóa vận tốc tạo ra các xung động vi mô (perturbation), giúp hệ vượt qua các rào cản năng lượng cục bộ để kích hoạt dao động phân tách. Ở trạng thái tự do ngoài dung môi, chuyển động của phân tử chủ yếu tuân theo quy luật tự khuếch tán, nên việc tái tạo vận tốc ít ảnh hưởng đến hệ số khuếch tán chung.

4. Năng lượng tự do tách rời của phức hợp MDM2/TAD-p53 tính bằng PaCS-MD/MSM đạt độ chính xác như thế nào so với thực nghiệm và phương pháp MM/GBSA?
Giá trị tính toán từ PaCS-MD/MSM đạt $40.7\text{ kJ/mol}$, rất sát với kết quả thực nghiệm là $37\text{ kJ/mol}$. Trong khi đó, phương pháp xấp xỉ trường thế MM/GBSA cho kết quả lên tới $68.2\text{ kJ/mol}$, cho thấy PaCS-MD/MSM mô tả chính xác hơn các đóng góp nhiệt động học và tương tác dung môi.

Kết luận

Luận án của tác giả Tran Phuoc Duy tại Đại học Tokyo đã phát triển và kiểm chứng thành công phương pháp tính toán năng lượng tự do liên kết và phân tách của các phức hợp sinh học dựa trên thuật toán lấy mẫu tăng cường không định hướng PaCS-MD kết hợp Mô hình Trạng thái Markov (MSM). Phương pháp đã giải quyết triệt để vấn đề sai lệch cấu trúc do ngoại lực gây ra trong các kỹ thuật kéo cưỡng bức truyền thống, mang lại kết quả năng lượng tự do cho các hệ protein - phối tử nhỏ (LYZ/triNAG) và protein - peptide (MDM2/TAD-p53) hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm nhiệt lượng ITC. Đồng thời, nghiên cứu mở ra hướng tiếp cận mới trong mô phỏng docking linh động hoàn toàn tự nhiên, tạo nền tảng ứng dụng quan trọng trong lĩnh vực mô phỏng sinh học phân tử và thiết kế thuốc tính toán.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Doctoral Thesis Association and dissociation simulations of bio-molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics The University of Tokyo Greduate Shool of Frontier Sciences Department of Computational Biology and Medical Sciences Tran Phuoc Duy Doctoral Thesis 学位論文 Association and dissociation simulations of bio-molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics 並列カスケード選択分子動力学法による生体分子の会合・解離シミュレーション 東京大学大学院新領域創成科学研究科 メディカル情報生命専攻 チャン フ ズイ In memory of my father To my mother and my sister With eternal love and appreciation i Abstract Sampling conformations of protein complexes during association and dissociation processes is a crucial step to estimate the binding free energy and other kinetic properties from association/dissociation pathways. This is a challenging problem for the classical Molecular Dynamics (MD) simulation because the time scale of these processes exceeds the limit of current computation. Therefore, enhanced sampling techniques play an important role to generate sufficient data for the free energy analysis. For example, Steered Molecular Dynamics (SMD) with Umbrella Sampling (US) [Ramirez et al.

(2016)], Replica Exchange Umbrella Sampling (REUS) [Sugita et al. Phys (2000)], Targeted MD (TMD) [Schlitter et al. (1994)], Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics (PaCS-MD) [Harada and Kitao, J. (2011)] and other methods not listed here are used for this purpose.

Recently, Yamashita and Fujitani showed that protein structures were distorted when dissociation of lysozyme (enzyme) and HyHEL-10 (inhibitor) was simulated by SMD using a steering force applied to the center of mass (COM) of the protein, which led overestimation of the potential of mean force (PMF) with the following US. This can be considered as the artifact caused by SMD. In contrast to SMD, PaCS-MD performs conformational sampling by cycles of distinct multiple Molecular Dynamics (MD) simulations without applying any bias force to the system. It enhances the sampling by selecting the MD snapshots closest to the destination state and by restarting the MD simulations from the selected snapshots with the velocity re- randomization.

PaCS-MD was shown to be very successful in efficient sampling of protein domain motions. Here in this thesis, we describe unbiased association and dissociation simulations by PaCS-MD. We first show that PaCS-MD dissociated a small ligand, tri-N-acetyl-D- glucosamine (triNAG), from hen egg white lysozyme (LYZ) very efficiently. We performed PaCS-MD trials with 3 different simulation settings: PaCS-MD10,0.1 ns MDs per cycle), PaCS-MD100,0.1 ns MDs) and PaCS-MD10,1 (ten 1.

We found that PaCS-MD is 5 times faster than SMD. In combination with Markov State Model (MSM), we calculated the binding free energy directly from the ii PaCS-MD trajectories. In comparison, binding free energy was also calculated by the analysis of SMD trajectories using the Jarzynski equality [Jarzynski. Although SMD/Jarzynski overestimated the binding free energy, PaCS- MD/MSM yielded the results in good agreement with experimental results.

We also examined the effects of the number of replicas, the length of each MD, the velocity re- randomization, and the selection of snapshots on PaCS-MD sampling. We found that the increase of the number of replicas reduced the number of cycles required for dissociation because the probability of observing rare events is proportional to the number of replicas. The velocity re-randomization enhances the sampling in the bound state as it acts as a perturbation to raise the occurrence of rare events (dissociation). We next applied PaCS-MD to the dissociation of MDM2 protein and trans- activation domain of p53 (TAD-p53).

Binding free energy of MDM2/TAD-p53 calculated by PaCS-MD/MSM was 40.7 kJ/mol , which almost agrees with experimental value 37. Our result is more accurate than the value calculated by the MMGBSA method, 68.2 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 [Dastidar et al. We found the calculated binding free energy for each trial is strongly dependent on the dissociation pathway of TAD-p53, which is related to the dissociation of the key residues PHE19 and TRP23 of TAD-p53 involved in π-π stacking interactions between TAD-p53 and MDM2. We also employed PaCS-MD for simulating association and dissociation process of MDM2/TAD-p53, which can be considered as a flexible-body docking simulation.

We used the switching condition between the dissociation and association simulations as follows: if the association simulation does not make any progress for continuous 20 ps, it will switch to the dissociation simulation. When the inter COM distance between MDM2 and TAD-p53 reaches 2.