MỞ ĐẦU Bạch đàn là loài cây được trồng rừng với diện tích lớn và phổ biến nhất trên thế giới, ước tính khoảng 20 triệu ha (GIT Forestry, 2008). Gỗ Bạch đàn đang được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho các nhà máy sản xuất giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Ngoài ra, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng để sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, làm đồ mộc, cột chống, lá của một số loài được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Do đó, cây Bạch đàn được xếp vào danh mục giống cây trồng lâm nghiệp chính của Việt Nam (Thông tư số 44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT).
Với giá trị to lớn của cây bạch đàn trong trồng rừng sản xuất, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây bạch đàn chuyển gen sinh trưởng nhanh đang rất được quan tâm. Để cải thiện giống cây trồng lâm nghiệp sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen, có hai hướng chính là chuyển các gen liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng dạng hoạt động và các gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho, v.v, trong đó chuyển gen liên quan đến quá trình đồng hóa nitơ được đánh giá là có triển vọng nhất. Bởi vì, nitơ là một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp.
Gen GS1 mã hóa cho glutamine synthetase (GS, EC 6.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hoá glutamic acid thành glutamine, dùng amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Enzyme GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Dubois và cs, 1996; Cren và Hirel, 1999; Stéphanie và cs, 2009). Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng; gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh c 2 (Stéphanie và cs, 2009). Đã có một số nghiên cứu về chuyển gen GS1 vào cây trồng, cây dương lai chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn nhiều so với cây không chuyển gen ở giai đoạn cây con và trồng rừng (Gallardo và cs, 1999; Zhong và cs, 2004); cây thuốc lá chuyển gen GS1 cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp glutamine synthetase tăng cao, cây sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng (Fuentes và cs, 2001; Nguyễn Thị Hồng Gấm và cs, 2016).
Trong khuôn khổ thực hiện đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” do Trường Đại học Lâm nghiệp chủ trì, gen GS1 đã được phân lập và thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật, gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter cơ định 35S và đoạn kết thúc NOS-terminator; gen chọn lọc là nptII đã được chuyển vào bạch đàn Urô; bước đầu đã tạo được một số dòng bạch đàn Urô tái sinh từ thể nhận gen trên môi trường chọn lọc. Với mục tiêu sàng lọc được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và bước đầu đánh giá sinh trưởng của các dòng chuyển gen ở giai đoạn vườn ươm, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GS1” phục vụ cho việc chọn lọc dòng bạch đàn Urô chuyển gen có sức sinh trưởng nhanh triển vọng làm giống. Mục tiêu của đề tài - Xác định được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 thông qua sàng lọc kháng sinh và phân tích sự có mặt của gen, số bản copy, mức độ biểu hiện phiên mã bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. - Đánh giá được sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm.
Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Phân tích, đánh giá và chọn tạo được dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 liên quan đến quá trình đồng hóa và tái sự dụng nitơ giúp cây c 3 sinh trưởng nhanh sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học trong việc tạo giống cây lâm nghiệp chuyển gen sinh trưởng nhanh. - Ý nghĩa thực tiễn: Phân tích, đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển qua các thế hệ nhân giống sinh dưỡng in vitro và đánh giá được sự sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm sẽ làm cơ sở cho việc chọn tạo dòng bạch đàn Urô chuyển gen sinh trưởng nhanh có triển vọng làm giống. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm (Dicotyledone).
Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 900 loài, phân loài và các biến chủng bạch đàn lai trên toàn thế giới (Boland và cs, 2006). Theo Eldridge và cs (1993) chi bạch đàn được chia làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng vào trồng rừng đại trà, như: Loài E.
grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2 loài bạch đàn phân bố ngoài Australia là loài E. deglupta Blume và E. Cho đến nay, bạch đàn đã được gây trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các quốc gia vùng nhiệt đới, ôn đới, như: Brazil, Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam,. Bạch đàn là loài cây thân gỗ lâu năm, cây trồng 5 - 6 năm tuổi thường có chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9 – 10 cm.
Cây bạch đàn có cơ chế tự bảo vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất được gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển nhanh nhờ chồi bất định và búp phụ, do đó cây có khả năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu. Bạch đàn có thể sinh trưởng phát triển ở vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới (Grupo Empresarial ENCE, 2009). Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất. Do đó, bạch đàn được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và rừng trồng bạch đàn chiếm 0,5% diện tích rừng trên toàn thế giới (Grupo Empresarial ENCE, 2009).
Gỗ bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp sản xuất giấy vì gỗ bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản c 5 xuất từ gỗ bạch đàn. Bên cạnh đó, gỗ bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, lá của một số loài bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Trên thế giới, bạch đàn đang là một trong các loài cây trồng rừng có triển vọng nhất đối với các ngành Lâm nghiệp, công nghiệp sản xuất gỗ và bột giấy (Wu et al.
2006, Clarke et al. 2009, Ishiguri et al. 2013, Hung et al. 2015, Wessels et al.
2016), với diện tích trồng ngày càng được mở rộng. Bên cạnh vùng sinh thái tự nhiên, rừng trồng bạch đàn được mở rộng từ 0,7 triệu ha năm 1955 lên hơn 20 triệu ha năm 2009 và có mặt ở hơn 100 quốc gia trên thế giới (Iglesias và cs, 2008; Shi và cs, 2012). Trong đó, phân bố ở châu Á 40,78%, châu Mỹ 36,41%, châu Phi 11,65%, châu Âu 6,31% và châu Đại Dương 4,85% (Global, 2009). Brazil là nước có diện tích rừng trồng bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2012 ước tính có khoảng 6,5 triệu hecta chủ yếu phục vụ cho sản xuất giấy và bột giấy (Anuário Estatístico Da Abraf, 2012).
Ở Việt Nam, cây bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945, song việc gây trồng bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt đầu từ năm 1960. Trong một thời gian ngắn, cây bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước ta hiện nay. Ở Việt Nam, bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng, có mặt tại 6/9 vùng sinh thái chính trong cả nước. Tuy nhiên, thực tế trồng rừng ở Việt Nam cho thấy, hầu hết các vùng được quy hoạch để trồng rừng là các vùng đất trống bạc màu và đồi trọc nghèo dinh dưỡng vì vậy mà năng suất cây trồng giảm mạnh do cây sinh trưởng chậm, kéo dài luân kỳ khai thác.
Do đó, hiện nay việc nghiên cứu cải thiện giống cây lâm nghiệp với đặc tính sinh trưởng nhanh trên các nền đất bạc màu rất được chú trọng. Việc nghiên cứu chọn tạo được giống bạch đàn sinh trưởng nhanh trên các vùng đất nghèo dinh c 6 dưỡng sẽ quyết định đến việc nâng cao được năng suất rừng trồng bạch đàn, mang lại giá trị kinh tế ổn định và bền vững cho người dân trồng rừng. Giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) Bạch đàn Urô (E. urophylla) có nguyên sản ở Indonesia (tập trung ở một số đảo là Flores, Adona, Pantar và Timor), phân bố từ 7030 - 100 vĩ Nam và 1220 - 1270 kinh Đông trên các dốc núi và trong các thung lũng, trên các loại đất bazan, diệp thạch và phiến thạch, đôi khi mọc ở núi đá vôi.
Bạch đàn Urô phân bố ở độ cao 300 - 2960m so với mặt nước biển, nơi có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 24-280C. Nơi nguyên sản, bạch đàn Urô có thể cao 25 - 45m, dưới điều kiện thuận lợi có thể đạt đến chiều cao 55m và đường kính trên 2m ( Eldridge và cs, 1993). Lần đầu tiên bạch đàn Urô có mặt ở Việt Nam trong chương trình khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ. Các vườn giống cây trồng bằng hạt (Seedling Seed Orchard - SSO) của loài hiện đã được xây dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Nội.