Đặt Vấn Đề Hiện nay với những thay đổi bất lợi của môi trường sống, số người mắc ung thư đang tăng lên nhanh chóng. Theo thống kê của tổ chức Globocan 2012, ngày 09/07/2014, số người mắc ung thư trên toàn thế giới đã lên đến 14. Tại Việt Nam số nguời mắc ung thư đã lên đến 125.036 người, trong đó số người mắc ung thư phổi lến đến 21.865 người chiếm 17,5%. Ung thư phổi là loại ung thư ác tính, tỷ lệ số người còn sống khi mắc bệnh sau 5 năm là 19,4 %.
Điều này có nghĩa mắc ung thư phổi là coi như nắm chắc cái chết và các phương pháp chữa trị ung thư hiện tại chỉ nhằm kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Hiện nay bằng các kỹ thuật hiện đại, chúng ta có thể phát hiện ung thư từ rất sớm do vậy khả năng điều trị ung thư thành công có thể tăng lên. Tuy nhiên dù có được phát hiện sớm, nếu sử dụng các phương pháp điều trị truyền thống bệnh nhân vẫn phải vật lộn với những biến chứng của quá trình điều trị. Với sự phát triển của khoa học công nghệ, đã có những phương pháp mới trong điều trị ung thư đã ra đời.
Một trong những phương pháp này là điều trị trúng đích sử dụng thuốc phân tử nhỏ. Phương pháp này vô cùng hữu ích đối với những bệnh nhân có thể trạng không tốt để phẫu thuật hay xạ trị, hoặc những bệnh nhân ung thư ở giai đoạn cuối. Hơn thế nữa bệnh nhân có thể điều trị tại nhà, điều này giúp bệnh nhân giảm bớt đau đớn, có tâm lý thoải mái và có cuộc sống tốt hơn trong quá trình điều trị. Tuy nhiên không phải lúc nào điều trị đích cũng thành công trên tất cả các bệnh nhân mà còn tùy thuộc vào kiểu gen của mỗi người.
Trong điều trị ở bệnh nhân ung thư phổi mà đặc biệt là ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) sử dụng Erlotinib và Gefitinib, bệnh nhân có đột biến gen EGFR tại vị trí L858R và đột biến mất đoạn exon 19 thì cho đáp ứng với thuốc rất cao và ngược lại những bệnh nhân có đột biến T790M tại exon 20 lại đáp ứng kém với thuốc. Các đột biến còn lại trên gen này lại cho kết quả đáp ứng với thuốc ở mức độ trung bình. Điều HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 1 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học này chứng tỏ kiểu gen EGFR có mối quan hệ mật thiết với hiệu quả điều trị UTPKTBN dùng liệu pháp điều trị trúng đích bằng thuốc phân tử nhỏ. Có nhiều phương pháp dùng phát hiện đột biến gen EGFR: sequencing, realtime-PCR, RFLP, pyrosequencing… Pyrosequencing là kỹ thuật giải trình tự trực tiếp DNA từ sản phẩm PCR được phát triển bởi Pal Nyren.
Đây là kỹ thuật vô cùng hữu dụng, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hoàn toàn có khả năng đáp ứng các chỉ tiêu khắc khe của một bộ thuốc thử thương mại áp dụng trong điều trị ung thư. Hiện nay trên thế giới đã có một số bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến gen đã được tổ chức FDA (Food And Drug Abministration) của Mỹ cấp chứng nhận IVD (In Vitro Dianogstics). Các bộ thuốc thử này là công cụ hữu ích trong tiên đoán mức độ thành công của liệu pháp điều trị đích trong ung thư, tuy nhiên giá thành của mỗi lần xét nghiệm này rất cao. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột gen EGFR” có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và giá thành phù hợp với điều kiện áp dụng tại Việt Nam.
Từ đó sử dụng bộ thuốc thử này phát hiện đột biến gen EGFR ở 100 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Mục Tiêu Nghiên Cứu Của Đề Tài Mục Tiêu Tổng Quát: Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến EGFR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Từ đó sử dụng bộ thuốc thử này phát hiện đột biến gen EGFR từ mẫu bệnh phẩm của 100 bệnh nhân UTPKTBN. Mục Tiêu Cụ Thể: - Thiết kế mồi đặc hiệu dùng khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 trên gen EGFR của người.
Thiết kế mồi giải trình tự cho các vị trí 719, deletions, 768, 790, 858 và 861 trên gen EGFR. - Cài đặt các thử nghiệm (assay) trên máy PyroMark Q24, các thử nghiệm này phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 2 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Xác định tỷ lệ các kiểu đột biến trên gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Xác định các kiểu đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN.
Phạm vi nghiên cứu: Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing xác định các kiểu đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN. Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu đề ra, đề tài cần đạt được các nội dung như sau: - Nội dung 1: Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR. Thiết kế mồi giải trình tự cho các vị trí 719, deletions, 768, 790, 858 và 861 trên gen EGFR. - Nội dung 2: Xây dựng các thử nghiệm trên máy PyroMark Q24.
- Nội dung 3: Xác định ngưỡng phát hiện LOD (limit of detection) tại mỗi vị trí đột biến. - Nội dung 4: Xác định kiểu đột biến và tỷ lệ đột biến trên mẫu chuẩn nhận từ EMQN, đồng thời so sánh song song với kết quả của những mẫu này khi thực hiện với bộ thuốc thử EGFR Pyro® kit (Q24). - Nội dung 5: Xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen EGFR trên 100 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân UTPKTBN. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài a/ Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được bộ thuốc thử phát hiện đột biến gen EGFR có độ tin cậy cao trong chẩn đoán, nhằm đáp ứng các yêu cầu xét nghiệm lâm sàng.
- Cung cấp thông tin ban đầu về các đột biến trên gen EGFR tại Việt Nam. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 3 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học b/ Ý nghĩa thực tiễn - Bộ thuốc thử ra đời sẽ đáp ứng nhu cầu xét nghiệm của các bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam. - Cung cấp công cụ hữu ích trong tiên đoán mức độ thành công của liệu pháp điều trị đích ở bệnh nhân UTPKTBN bằng thuốc phân tử nhỏ. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 4 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học II.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài nét về ung thư và ung thư phổi 2. Ung thư Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan tới việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng việc phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn). Nguyên nhân gây ra ung thư là do sai hỏng trên DNA, tạo ra các đột biến trên các gene. Hai nhóm gen liên quan tới ung thư là: gen sinh ung, hay còn gọi là nhóm gen truyền tin, chúng mã hóa các tín hiệu và truyền tín hiệu cho tế bào phân chia.
Khi các gen này bị đột biến (bị hỏng) sẽ gây ra hiện tượng truyền tin quá mức, vì vậy tế bào sẽ phân chia quá mức (một cách không kiểm soát) dẫn tới hình thành khối u (ung thư). Một số gen thuộc nhóm này như: EGFR, K-ras, B-raf … Nhóm thứ 2 là gen ức chế hình thành khối u, các gen này mã hóa các enzyme bảo vệ. Các enzyme này sẽ nhận biết các đột biến trên DNA và sửa chữa chúng. Các gen thuộc nhóm gen ức chế hình thanh khối u như: BRCA1, BRCA2, P50, FAP … Như vậy khối u chỉ hình thành và phát triển thành ung thư khi cả 2 nhóm gen truyền tin và gen ức chế hình thành khối u cùng bị hư hại và lúc này ung thư có khả năng hình thành và phát triển.
Dấu hiệu của ung thư: ban đầu bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng rõ ràng, khi có triệu chứng rõ ràng thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng. Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh (Tức là thời gian từ một tế bào bị đột biến tiến triển thành ung thư với những triệu chứng rõ ràng) khá dài, khoảng 10 năm hoặc hơn nữa tùy thuộc từng loại ung thư. Do đó cách tốt nhất phòng ung thư là khám sức khỏe định kỳ 6 tháng một lần. Hiện nay có khoảng 200 loại ung thư và ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới.
Bệnh ung thư ảnh hưởng tới mọi người bất kể thuộc quốc gia, dân tộc nào trên thế giới. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 5 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học 2. Ung thư phổi 80% bệnh nhân bị ung thư phổi là do hút thuốc lá, có khoảng 2000 tác nhân sinh ung thư được biết trong khói thuốc lá. Chất sinh ung thư phổi bao gồm: radon, asbestos, bischolomethylether, nickel, chromates, bột than, những chất đồng có hoạt tính phóng xạ và arsenic.
Một số nghề nghiệp làm gia tăng nguy cơ ung thư phổi, chẳng hạn như nghề đập đá làm tăng nguy cơ ung thư phổi lên 92 lần so với người bình thường và công nhân đúc tăng 3-8 lần… Nguy cơ ung thư phổi cũng tăng với nhóm người thường xuyên tiếp xúc với chất sinh ung. Ví dụ như nguy cơ ung thư phổi cũng tăng tỷ lệ thuận với số điếu thuốc được hút và người hút thuốc thì nguy cơ ung thư phổi cũng tăng 8-20 lần so với người bình thường. Ung thư phổi được chia làm 2 loại, ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không tế bào nhỏ. 15-25% là ung thư phổi tế bào nhỏ và 75-85% ung thư phổi là ung thư phổi không tế bào nhỏ.
UTPKTBN được chia làm 4 loại: ung thư tế bào tuyến, ung thư phế quản phổi, ung thư tế bào gai và ung thư tế bào lớn. Ung thư tế bào tuyến là loại UTPKTBN phổ biến nhất, phần lớn ung thư này thường phát triển ở ngoại vi của phổi và thường có xu hướng di căn đến các phần khác của cơ thể như: xương, hệ thần kinh trung ương, tuyến thượng thận, gan và phổi đối diện. Vì loại này thường phát triển ngoại vi nên cho đến khi cùng được phát hiện trên flim X quang ngực. Ung thư phế quản phổi và phế quản là ung thư phổi không tế bào nhỏ được tìm thấy trên khắp đường hô hấp.
Khi phát hiện trên flim X quang, nếu là khối đơn độc thì tiên lượng tốt và tỉ lệ sống sau 5 năm phẫu thuật là 75-90%, nếu nó xuất hiện dưới dạng lan tỏa thì tiên lượng xấu. Ung thư tế bào gai chiếm tỷ lệ khoảng 30-40% của UTPKTBN. Loại này có xu hướng ở trung tâm của phổi, thường trong khí quản.
