Luận Văn Thạc Sĩ Công Nghệ Sinh Học: Xây Dựng Bộ Thuốc Thử Pyrosequencing Xác Định Đột Biến Gen EGFR

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng bộ thuốc thử Pyrosequencing nhằm xác định đột biến gen EGFR, ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi.

• Tác giả: Huỳnh Viết Lộc
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Hùng Vân
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc Gia TP.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing xác định đột biến gen EGFR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Mục Tiêu Nghiên Cứu Của Đề Tài
• 1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vài nét về ung thư và ung thư phổi
• 2.1.1. Ung thư phổi
• 2.2. Tình hình ung thư phổi trên thế giới và Việt Nam
• 2.2.1. Ung thư phổi trên thế giới
• 2.2.2. Ung thư phổi tại Việt Nam
• 2.3. Một số phương pháp điều trị ung thư phổi
• 2.3.1. Ung thư phổi tế bào nhỏ
• 2.3.2. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
• 2.4. Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR
• 2.4.1. EGFR và điều trị đích ung thư phổi không tế bào nhỏ
• 2.5. Các phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR
• 2.5.1. Các phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và dụng cụ
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Thiết kế mồi
• 3.3.2. Kiểm tra primer sau khi thiết kế ở điều kiện thực tế
• 3.3.3. PCR khuếch đại các exon 18, 19, 20 và exon 21 trên gen EGFR
• 3.3.4. Thực hiện pyrosequencing
• 3.3.5. So sánh 2 bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến gen EGFR, NamKhoa-EGFRpyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
• 3.3.6. Ly trích DNA từ mẫu bệnh đóng trong paraffin bằng bộ FFPE
• 3.3.7. Xác định đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm chuẩn bằng 2 bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
• 3.3.8. Phân tích, so sánh kết quả giữa 2 bộ thuốc thử và trình lên EMQM
• 3.3.9. Xác định đột biến gen EGFR trên 100 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả thiết kế mồi
• 4.1.1. Kết quả thiết kế mồi sử dụng phần mềm primer premier 5
• 4.1.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi trên trang mạng NCBI
• 4.1.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi trên điều kiện thực tế
• 4.2. Kết quả xác định chỉ số LOD cho các vị trí đột biến 719, 768, 790, 858, 861 và deletions
• 4.3. Kết quả xác định đột biến EGFR của bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
• 4.4. Kết quả xác định đột biến gen EGFR trên 100 bệnh nhân UTPKTBN
• 4.4.1. Đột biến EGFR theo giới tính
• 4.4.2. Đột biến EGFR xét theo độ tuổi
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• Tài Liệu Tham Khảo
• Tài Liệu Tham Khảo internet

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Luận Văn Thạc Sĩ

Luận văn thạc sĩ với tiêu đề 'Xây dựng bộ thuốc thử Pyrosequencing để xác định đột biến gen EGFR' được thực hiện bởi Huỳnh Viết Lộc tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc Gia TP.HCM. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển một bộ thuốc thử sử dụng kỹ thuật Pyrosequencing để phát hiện các đột biến gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ. Mục tiêu chính là tạo ra một công cụ chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với điều kiện y tế tại Việt Nam.

1.1. Bối cảnh nghiên cứu

Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến và nguy hiểm nhất, với tỷ lệ tử vong cao. Đột biến gen EGFR đóng vai trò quan trọng trong việc xác định phương pháp điều trị đích bằng thuốc phân tử nhỏ. Tuy nhiên, các phương pháp hiện tại như giải trình tự trực tiếp có độ nhạy thấp. Pyrosequencing được chọn vì ưu điểm về độ nhạy, tốc độ và tính tự động hóa.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm xây dựng bộ thuốc thử Pyrosequencing để phát hiện các đột biến trên gen EGFR, bao gồm các vị trí 719, deletions, 768, 790, 858 và 861. Bộ thuốc thử này sẽ được áp dụng trên 100 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Pyrosequencing để phân tích các mẫu FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) từ bệnh nhân ung thư phổi. Các mẫu được xác định là ung thư phổi không tế bào nhỏ thông qua phân tích hình thái tế bào. Quy trình bao gồm thiết kế mồi, khuếch đại PCR, và thực hiện Pyrosequencing trên máy PyroMark Q24.

2.1. Thiết kế mồi và khuếch đại PCR

Các mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR. Mồi giải trình tự được thiết kế cho các vị trí đột biến cụ thể. Quá trình khuếch đại PCR được thực hiện để tạo ra sản phẩm DNA phù hợp cho Pyrosequencing.

2.2. Thực hiện Pyrosequencing

Pyrosequencing được thực hiện trên máy PyroMark Q24 để xác định các đột biến gen EGFR. Kết quả được so sánh với bộ thuốc thử thương mại EGFR Pyro® kit (Q24) để đánh giá độ chính xác và độ tin cậy.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR là 67% trong 100 mẫu bệnh phẩm. Trong đó, đột biến deletions chiếm tỷ lệ cao nhất (76%), tiếp theo là đột biến L858R (25%). Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỷ lệ đột biến cao hơn ở nữ giới (84%) so với nam giới (57%). Độ tuổi càng cao, tỷ lệ đột biến càng tăng.

3.1. Phân tích đột biến gen EGFR

Các đột biến được phát hiện chủ yếu là deletions và L858R, hai đột biến có liên quan đến hiệu quả điều trị bằng thuốc ức chế EGFR-TKI. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về đột biến gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ.

3.2. So sánh với bộ thuốc thử thương mại

Bộ thuốc thử Pyrosequencing được xây dựng trong nghiên cứu cho kết quả tương đồng với bộ thuốc thử thương mại EGFR Pyro® kit (Q24), chứng tỏ độ tin cậy và khả năng ứng dụng trong thực tiễn.

IV. Ý nghĩa và ứng dụng

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp một công cụ chẩn đoán đột biến gen EGFR hiệu quả và chi phí thấp. Bộ thuốc thử Pyrosequencing có thể được sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện tại Việt Nam, giúp cải thiện hiệu quả điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ.

4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đóng góp vào việc hiểu biết về các đột biến gen EGFR tại Việt Nam, đồng thời cung cấp dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực phân tích di truyền và công nghệ sinh học.

4.2. Ứng dụng thực tiễn

Bộ thuốc thử có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị phù hợp dựa trên kiểu gen của bệnh nhân. Điều này góp phần nâng cao chất lượng điều trị và giảm chi phí y tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo dịch tễ học ung thư toàn cầu Globocan, ung thư phổi là một trong những bệnh lý ác tính hàng đầu về tỷ lệ mắc mới và tử vong, với tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ đạt khoảng 19,4%. Tại Việt Nam, thống kê ghi nhận có 21.865 ca mắc mới ung thư phổi trong tổng số 125.036 ca ung thư các loại (chiếm 17,5%) và cướp đi sinh mạng của 19.559 người mỗi năm (chiếm 20,6% tổng số ca tử vong do ung thư). Đáng chú ý, có tới 62,5% bệnh nhân nhập viện khi bệnh đã tiến triển sang giai đoạn muộn, mất hoàn toàn khả năng can thiệp ngoại khoa triệt căn.

Trước thực trạng đó, liệu pháp điều trị trúng đích sử dụng các thuốc ức chế Tyrosine Kinase phân tử nhỏ (EGFR-TKI) như Gefitinib và Erlotinib đã mang lại bước ngoặt lớn với tỷ lệ đáp ứng vượt trên 75% ở những bệnh nhân mang đột biến hoạt hóa thụ thể EGFR. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự trực tiếp Sanger truyền thống bộc lộ nhược điểm lớn với độ nhạy thấp khi giới hạn phát hiện (LOD) đòi hỏi mẫu phải chứa ít nhất 25% tế bào đột biến. Điều này dẫn đến nguy cơ bỏ sót cơ hội điều trị của người bệnh khi mẫu mô sinh thiết nhỏ không đủ mật độ tế bào ung thư.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học do học viên Huỳnh Viết Lộc thực hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Bác sĩ Phạm Hùng Vân tại Trường Đại học Bách khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM (hoàn thành tháng 08/2014) tập trung giải quyết bài toán cấp thiết trên. Đề tài đặt mục tiêu xây dựng thành công bộ thuốc thử "NamKhoa_EGFR Pyro Q24" ứng dụng kỹ thuật Pyrosequencing có độ nhạy cao từ 1% đến 2%, đồng thời tiến hành khảo sát dịch tễ đột biến gen EGFR trên 100 mẫu bệnh phẩm ung thư phổi không tế bào nhỏ thu thập tại các bệnh viện ở TP.HCM. Công trình không chỉ tối ưu hóa chi phí xét nghiệm cho người bệnh trong nước mà còn mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi xác định tỷ lệ đột biến EGFR đạt 67%, chuẩn hóa quy trình phân tích đạt chuẩn kiểm định chất lượng châu Âu EMQN.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên các nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và dược lý học ung thư hiện đại:

Thứ nhất, lý thuyết truyền tín hiệu nội bào qua thụ thể Tyrosine Kinase: Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR/HER1) được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 gồm 237.600 cặp base, tạo ra chuỗi protein 1.210 acid amin. Khi liên kết với phối tử, vùng tyrosine kinase nội màng tự phosphoryl hóa, kích hoạt các con đường tín hiệu PI3K/Akt và Ras/MAPK nhằm thúc đẩy tế bào phân chia vô tổ chức, tăng sinh mạch máu và ức chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis).

Thứ hai, cơ chế tác động cạnh tranh ATP của thuốc trúng đích phân tử nhỏ (TKI): Các đột biến xảy ra tại 4 exon mã hóa vùng tyrosine kinase (exon 18 đến exon 21) quyết định trực tiếp độ nhạy cảm hoặc kháng thuốc. Trong khi đột biến mất đoạn tại exon 19 và đột biến điểm L858R tại exon 21 là các đột biến hoạt hóa có lợi giúp tăng nhạy cảm với thuốc TKI, thì đột biến điểm T790M tại exon 20 lại làm thay đổi cấu trúc không gian vùng gắn kết ATP dẫn đến hiện tượng kháng thuốc thứ phát.

Thứ ba, nguyên lý giải trình tự không điện di Pyrosequencing: Kỹ thuật dựa trên phản ứng phát quang sinh học 4 bước khép kín. Mỗi khi một nucleotide bổ sung gắn vào chuỗi DNA đang kéo dài nhờ DNA polymerase, một phân tử pyrophosphate (PPi) được giải phóng. Enzyme ATP sulfurylase chuyển đổi PPi thành ATP, cung cấp năng lượng cho luciferase oxy hóa luciferin phát ra ánh sáng. Cường độ tín hiệu ánh sáng được ghi nhận bởi cảm biến CCD chuyển thành chiều cao đỉnh (peak) trên biểu đồ Pyrogram, cho phép định lượng chính xác tỷ lệ allele đột biến.

Các khái niệm chuyên ngành cốt lõi trong nghiên cứu bao gồm: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN), giới hạn phát hiện đột biến (Limit of Detection - LOD), mẫu mô đúc khối sáp cố định formalin (FFPE), và kiểm chuẩn ngoại kiểm di truyền phân tử (EMQN).

Phương pháp nghiên cứu

Về nguồn dữ liệu và chọn mẫu: Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 100 mẫu mô sinh thiết đúc sáp (FFPE) từ các bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc UTPKTBN tại các bệnh viện lớn trên địa bàn TP.HCM. Phương pháp chọn mẫu áp dụng tiêu chuẩn mô bệnh học nghiêm ngặt thông qua kỹ thuật nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) trên lame kính hiển vi để định vị và đánh giá hình thái tế bào ác tính. Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng 10 mẫu kiểm chuẩn phòng xét nghiệm mù được cung cấp trực tiếp từ Mạng lưới Ngoại kiểm Di truyền Phân tử Châu Âu (EMQN) cùng 1 mẫu tế bào niêm mạc má người khỏe mạnh mang gen EGFR kiểu dại làm chứng âm.

Về phương pháp phân tích và quy trình thực nghiệm:

• Thiết kế hệ thống mồi đặc hiệu: Sử dụng phần mềm Primer Premier 5 dựa trên trình tự chuẩn nhiễm sắc thể số 7 người (NCBI Accession: NC_000007), kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ Primer-BLAST. Các cặp mồi PCR được thiết kế khuếch đại 4 đoạn exon riêng biệt: exon 18 (171 bp), exon 19 (163 bp), exon 20 (291 bp), và exon 21 (97 bp). Mồi ngược của mỗi phản ứng PCR được gắn nhãn Biotin ở đầu 5' nhằm phục vụ cho quá trình cố định và tách sợi đơn.
• Tinh sạch và biến tính DNA: Mẫu FFPE được khử sáp bằng xylene và ethanol 100%, ly trích DNA bằng cột silica (FFPE extraction kit) và đo nồng độ quang phổ OD ở bước sóng 260/280 nm để hiệu chỉnh nồng độ DNA đạt chuẩn từ 5 đến 10 ng/µl. Sản phẩm PCR gắn biotin được cố định vào hạt từ Streptavidin Sepharose High Performance, biến tính tách sợi đơn trên trạm làm việc chân không chuyên dụng (Vacuum Workstation).
• Phân tích Pyrosequencing trên hệ thống PyroMark Q24: Thiết lập các chương trình thử nghiệm (Assay) phân tích định lượng allele (AQ) cho 6 vị trí đột biến mục tiêu: G719X (exon 18), mất đoạn deletions (exon 19), S768I và T790M (exon 20), L858R và L861Q (exon 21). Ngưỡng phát hiện LOD được thiết lập qua 6 lần chạy lặp lại độc lập trên mẫu chứng âm.

Lý do lựa chọn phương pháp: Pyrosequencing sở hữu giới hạn phát hiện cực nhạy từ 1% đến 2%, thời gian phân tích nhanh, tự động hóa cao, khắc phục hoàn toàn nhược điểm độ nhạy kém của giải trình tự Sanger (LOD 25%) và tránh được sự phụ thuộc phức tạp vào kỹ năng cắt enzyme của phương pháp PCR-RFLP (LOD 5%).

Timeline nghiên cứu: Toàn bộ quá trình từ thiết kế mồi, tối ưu hóa điều kiện PCR, thiết lập assay trên máy PyroMark Q24, đánh giá 10 mẫu kiểm chuẩn EMQN đến phân tích thực nghiệm trên 100 mẫu bệnh phẩm lâm sàng được tiến hành hoàn tất từ tháng 01/2014 đến tháng 08/2014.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học mang tính đột phá:

Thứ nhất, thiết kế thành công bộ mồi và quy trình xét nghiệm "NamKhoa_EGFR Pyro Q24" với độ nhạy vượt trội. Kỹ thuật đã xác định chính xác giới hạn phát hiện LOD cho các vị trí đột biến dao động từ 1% đến 2%. Sản phẩm PCR khuếch đại đơn băng rõ nét trên gel agarose 2% với kích thước chuẩn: exon 18 đạt 171 bp, exon 19 đạt 163 bp, exon 20 đạt 291 bp và exon 21 đạt 97 bp, không xuất hiện các đỉnh phụ quá ngưỡng 10% trên biểu đồ tín hiệu Pyrogram.

Thứ hai, kết quả đánh giá đối chuẩn mù trên 10 mẫu ngoại kiểm từ tổ chức EMQN cho thấy bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR Pyro Q24 đạt độ tương thích hoàn toàn 100% khi so sánh song song với bộ kít thương mại EGFR Pyro kit của hãng Qiagen (Đức) – sản phẩm đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp chứng nhận IVD.

Thứ ba, tỷ lệ đột biến gen EGFR tổng thể trên 100 bệnh nhân UTPKTBN tại TP.HCM đạt mức rất cao là 67% (67/100 mẫu). Trong số 67 ca dương tính, kiểu đột biến mất đoạn trên exon 19 (Exon 19 Deletions) chiếm tỷ lệ vượt trội với 76% (51/67 ca) và đột biến điểm thay thế L858R tại exon 21 chiếm 25% (17/67 ca). Hai dạng đột biến hoạt hóa này chiếm trên 90% tổng số các biến đổi di truyền được ghi nhận.

Thứ tư, nghiên cứu phát hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ đột biến theo đặc điểm nhân khẩu học: Tỷ lệ đột biến EGFR ở bệnh nhân nữ đạt tới 84%, cao hơn đáng kể so với bệnh nhân nam chỉ đạt 57% (chênh lệch 27%). Đồng thời, phân tích dữ liệu theo nhóm tuổi chỉ ra xu hướng tỷ lệ mang đột biến EGFR tăng dần tỷ lệ thuận theo độ tuổi của người bệnh.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ đột biến gen EGFR đạt 67% trong nghiên cứu này phản ánh đặc trưng dịch tễ học phân tử của quần thể bệnh nhân Việt Nam, tương đồng với các dữ liệu ghi nhận tại khu vực Đông Á (dao động từ 50% đến 65%), đồng thời cao hơn gấp nhiều lần so với các quần thể người da trắng ở Châu Âu và Bắc Mỹ (thường chỉ dao động từ 10% đến 15%). Sự chiếm ưu thế tuyệt đối của hai kiểu đột biến mất đoạn exon 19 (76%) và L858R (25%) khẳng định phần lớn bệnh nhân ung thư phổi tại nước ta sở hữu các biến đổi di truyền có lợi, mang lại khả năng đáp ứng lâm sàng vượt trội (trên 75%) với các liệu pháp điều trị trúng đích bằng thuốc ức chế EGFR-TKI phân tử nhỏ.

Hiện tượng bệnh nhân nữ có tần suất mang đột biến cao hơn nam giới (84% so với 57%) củng cố giả thuyết khoa học về mối liên quan giữa yếu tố nội tiết tố nữ, cơ chế chuyển hóa sinh học và tỷ lệ mắc ung thư phổi ở đối tượng không hút thuốc lá.

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua các phương tiện biểu diễn khoa học: Biểu đồ hình tròn (pie chart) minh họa cơ cấu phân bố các dạng đột biến với lát cắt nổi bật của mất đoạn exon 19 (76%) và L858R (25%); biểu đồ cột ghép nhóm (grouped bar chart) so sánh đối chiếu tỷ lệ đột biến giữa hai giới tính theo từng phân tầng độ tuổi; kết hợp bảng ma trận phân tích hiệu năng kỹ thuật làm nổi bật sự khác biệt về giới hạn phát hiện giữa Pyrosequencing (LOD 1-2%) so với giải trình tự Sanger truyền thống (LOD 25%) và PCR-RFLP (LOD 5%).

Việc phát hiện chính xác các đột biến nhạy thuốc giúp định hướng can thiệp y khoa kịp thời, giảm thiểu tối đa các tác dụng phụ độc hại của hóa trị liệu thông thường (như suy tủy, thiếu máu, rụng tóc), đồng thời kéo dài thời gian sống không tiến triển bệnh cho người mắc UTPKTBN.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm và tính ưu việt của công nghệ, luận văn đưa ra bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể:

1. Đưa xét nghiệm Pyrosequencing vào danh mục kỹ thuật tiêu chuẩn thường quy: Đề xuất các bệnh viện chuyên khoa Ung bướu, bệnh viện Phổi và trung tâm chẩn đoán y sinh học phân tử trên cả nước áp dụng thường quy bộ quy trình giải trình tự Pyrosequencing để tầm soát đột biến EGFR cho 100% bệnh nhân UTPKTBN trước khi quyết định phác đồ điều trị. Mục tiêu rút ngắn thời gian trả kết quả xét nghiệm xuống dưới 48 đến 72 giờ, giúp người bệnh tiếp cận thuốc đích TKI ngay từ giai đoạn đầu.

2. Thương mại hóa và nội địa hóa bộ thuốc thử chẩn đoán: Doanh nghiệp công nghệ sinh học trong nước phối hợp với nhóm tác giả hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành trang thiết bị y tế chẩn đoán in vitro (IVD) cho bộ sinh phẩm "NamKhoa_EGFR Pyro Q24" tại Bộ Y tế trong lộ trình từ 12 đến 24 tháng. Việc tự chủ sản xuất bộ kít nội địa sẽ cắt giảm từ 50% đến 60% giá thành xét nghiệm so với việc nhập khẩu kit thương mại nước ngoài.

3. Chuẩn hóa quy trình thu thập và xử lý mẫu mô sinh thiết đúc sáp (FFPE): Các khoa Giải phẫu bệnh tại các bệnh viện tuyến tỉnh cần thiết lập quy trình kiểm soát chất lượng mẫu chặt chẽ, tối ưu hóa kỹ thuật cố định bằng dung dịch formalin trung tính 10% và nhuộm HE kiểm tra vi thể để đảm bảo tỷ lệ tế bào u trong lát cắt đạt tối thiểu từ 10% đến 20%, nồng độ DNA sau ly trích đạt mức chuẩn từ 5 đến 10 ng/µl.

4. Mở rộng mạng lưới nghiên cứu đa trung tâm và giám sát đột biến kháng thuốc: Các trường đại học y dược và viện nghiên cứu cần chủ trì các đề tài mở rộng trên quy mô từ 500 đến 1.000 bệnh nhân trên phạm vi toàn quốc trong giai đoạn 3 năm tiếp theo. Cần tích hợp thêm các assay phát hiện các đột biến kháng thuốc thứ phát như T790M, C797S cũng như khuếch đại gen MET nhằm phục vụ cho việc chỉ định các thế hệ thuốc TKI kế tiếp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị chuyên môn sâu rộng, là tài liệu tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

1. Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Giải phẫu bệnh: Cung cấp bức tranh toàn cảnh về cơ sở dữ liệu dịch tễ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân Việt Nam (tỷ lệ 67%), hỗ trợ xây dựng phác đồ điều trị cá thể hóa chính xác bằng thuốc TKI phân tử nhỏ nhằm tối ưu hóa hiệu quả sống còn cho bệnh nhân UTPKTBN.

2. Cử nhân Xét nghiệm Y sinh và Kỹ thuật viên Sinh học phân tử: Nắm bắt chi tiết quy trình kỹ thuật chuẩn từ khâu thiết kế mồi PCR, tối ưu hóa phản ứng luân nhiệt 42 chu kỳ, kỹ thuật cố định hạt từ Streptavidin đến thao tác vận hành và phân tích biểu đồ Pyrogram trên hệ thống máy PyroMark Q24.

3. Học viên cao học và Nhà nghiên cứu Công nghệ Sinh học: Cung cấp phương pháp luận mẫu mực về quy trình xây dựng, tối ưu hóa và đánh giá một bộ sinh phẩm chẩn đoán phân tử đạt tiêu chuẩn ngoại kiểm quốc tế EMQN, làm tài liệu tham khảo để phát triển các kit chẩn đoán đột biến soma khác trong ung thư.

4. Nhà quản lý y tế và Các công ty Dược phẩm - Thiết bị Y tế: Cung cấp căn cứ thực tiễn để xây dựng chính sách bảo hiểm y tế chi trả cho xét nghiệm gen, đồng thời mở ra định hướng hợp tác đầu tư sản xuất các dòng sinh phẩm chẩn đoán IVD chất lượng cao với chi phí hợp lý.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao kỹ thuật Pyrosequencing lại vượt trội hơn phương pháp giải trình tự Sanger trong phát hiện đột biến EGFR? Pyrosequencing đạt độ nhạy phân tích cao với giới hạn phát hiện (LOD) từ 1% đến 2%, trong khi phương pháp Sanger đòi hỏi tỷ lệ tế bào đột biến phải đạt tối thiểu 25%. Do đó, Pyrosequencing giúp phát hiện chính xác các đột biến trong mẫu mô sinh thiết đúc sáp FFPE có mật độ tế bào u thấp, triệt tiêu nguy cơ âm tính giả.

Những dạng đột biến gen EGFR nào chiếm tỷ lệ cao nhất ở bệnh nhân ung thư phổi Việt Nam? Trong 67% bệnh nhân mang đột biến EGFR được phát hiện, đột biến mất đoạn tại exon 19 chiếm tỷ lệ cao nhất với 76% (51/67 ca), tiếp theo là đột biến điểm L858R tại exon 21 chiếm 25% (17/67 ca). Đây đều là các đột biến hoạt hóa nhạy cảm giúp nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc TKI.

Độ tin cậy của bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR Pyro Q24 được kiểm chứng như thế nào? Bộ sinh phẩm nội địa đã được thử nghiệm song song trên 10 mẫu kiểm chuẩn mù từ Mạng lưới Ngoại kiểm Di truyền Phân tử Châu Âu (EMQN). Kết quả cho thấy độ chính xác và độ tương đồng đạt 100% khi đối chiếu trực tiếp với bộ kit thương mại đạt chuẩn IVD của hãng Qiagen.

Đặc điểm dịch tễ nào có mối liên hệ mật thiết với tỷ lệ đột biến gen EGFR? Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân nữ đạt tới 84%, cao hơn rõ rệt so với bệnh nhân nam là 57%. Bên cạnh đó, tần suất xuất hiện đột biến gen EGFR có xu hướng gia tăng tỷ lệ thuận theo độ tuổi của người bệnh.

Yêu cầu kỹ thuật đối với mẫu mô sáp FFPE để thực hiện xét nghiệm này là gì? Lát cắt mô sáp cần được xác định hình thái ung thư qua nhuộm HE, loại bỏ sáp hoàn toàn bằng dung dịch xylene và ethanol, sau đó ly trích DNA bằng cột silica để thu được nồng độ DNA từ 5 đến 10 ng/µl với tỷ số OD 260/280 nm đạt chuẩn tinh sạch cho phản ứng PCR.

Kết luận

• Xây dựng thành công bộ thuốc thử "NamKhoa_EGFR Pyro Q24" xác định chính xác các đột biến trên 4 exon (18 đến 21) của gen EGFR với giới hạn phát hiện LOD tối ưu từ 1% đến 2%.
• Bộ thuốc thử đạt độ tương đồng 100% với kit ngoại nhập đạt chuẩn IVD của FDA thông qua chương trình đánh giá ngoại kiểm chất lượng quốc tế EMQN.
• Xác lập tỷ lệ đột biến EGFR đạt 67% trên 100 bệnh nhân UTPKTBN tại TP.HCM, trong đó đột biến mất đoạn exon 19 (76%) và L858R (25%) chiếm đa số, khẳng định tiềm năng to lớn của liệu pháp điều trị trúng đích TKI.
• Lộ trình 12 đến 24 tháng tới cần đẩy mạnh việc cấp phép lưu hành IVD và chuyển giao kỹ thuật rộng rãi đến các cơ sở y tế chuyên khoa trên toàn quốc.
• Công trình là tài liệu học thuật và cẩm nang ứng dụng vô giá; hãy tham khảo toàn văn luận văn thạc sĩ để nắm bắt toàn diện quy trình công nghệ sinh học phân tử tiên tiến này trong chẩn đoán y khoa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt Vấn Đề Hiện nay với những thay đổi bất lợi của môi trường sống, số người mắc ung thư đang tăng lên nhanh chóng. Theo thống kê của tổ chức Globocan 2012, ngày 09/07/2014, số người mắc ung thư trên toàn thế giới đã lên đến 14. Tại Việt Nam số nguời mắc ung thư đã lên đến 125.036 người, trong đó số người mắc ung thư phổi lến đến 21.865 người chiếm 17,5%. Ung thư phổi là loại ung thư ác tính, tỷ lệ số người còn sống khi mắc bệnh sau 5 năm là 19,4 %.

Điều này có nghĩa mắc ung thư phổi là coi như nắm chắc cái chết và các phương pháp chữa trị ung thư hiện tại chỉ nhằm kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Hiện nay bằng các kỹ thuật hiện đại, chúng ta có thể phát hiện ung thư từ rất sớm do vậy khả năng điều trị ung thư thành công có thể tăng lên. Tuy nhiên dù có được phát hiện sớm, nếu sử dụng các phương pháp điều trị truyền thống bệnh nhân vẫn phải vật lộn với những biến chứng của quá trình điều trị. Với sự phát triển của khoa học công nghệ, đã có những phương pháp mới trong điều trị ung thư đã ra đời.

Một trong những phương pháp này là điều trị trúng đích sử dụng thuốc phân tử nhỏ. Phương pháp này vô cùng hữu ích đối với những bệnh nhân có thể trạng không tốt để phẫu thuật hay xạ trị, hoặc những bệnh nhân ung thư ở giai đoạn cuối. Hơn thế nữa bệnh nhân có thể điều trị tại nhà, điều này giúp bệnh nhân giảm bớt đau đớn, có tâm lý thoải mái và có cuộc sống tốt hơn trong quá trình điều trị. Tuy nhiên không phải lúc nào điều trị đích cũng thành công trên tất cả các bệnh nhân mà còn tùy thuộc vào kiểu gen của mỗi người.

Trong điều trị ở bệnh nhân ung thư phổi mà đặc biệt là ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) sử dụng Erlotinib và Gefitinib, bệnh nhân có đột biến gen EGFR tại vị trí L858R và đột biến mất đoạn exon 19 thì cho đáp ứng với thuốc rất cao và ngược lại những bệnh nhân có đột biến T790M tại exon 20 lại đáp ứng kém với thuốc. Các đột biến còn lại trên gen này lại cho kết quả đáp ứng với thuốc ở mức độ trung bình. Điều HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 1 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học này chứng tỏ kiểu gen EGFR có mối quan hệ mật thiết với hiệu quả điều trị UTPKTBN dùng liệu pháp điều trị trúng đích bằng thuốc phân tử nhỏ. Có nhiều phương pháp dùng phát hiện đột biến gen EGFR: sequencing, realtime-PCR, RFLP, pyrosequencing… Pyrosequencing là kỹ thuật giải trình tự trực tiếp DNA từ sản phẩm PCR được phát triển bởi Pal Nyren.

Đây là kỹ thuật vô cùng hữu dụng, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hoàn toàn có khả năng đáp ứng các chỉ tiêu khắc khe của một bộ thuốc thử thương mại áp dụng trong điều trị ung thư. Hiện nay trên thế giới đã có một số bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến gen đã được tổ chức FDA (Food And Drug Abministration) của Mỹ cấp chứng nhận IVD (In Vitro Dianogstics). Các bộ thuốc thử này là công cụ hữu ích trong tiên đoán mức độ thành công của liệu pháp điều trị đích trong ung thư, tuy nhiên giá thành của mỗi lần xét nghiệm này rất cao. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột gen EGFR” có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và giá thành phù hợp với điều kiện áp dụng tại Việt Nam.

Từ đó sử dụng bộ thuốc thử này phát hiện đột biến gen EGFR ở 100 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Mục Tiêu Nghiên Cứu Của Đề Tài Mục Tiêu Tổng Quát: Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến EGFR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Từ đó sử dụng bộ thuốc thử này phát hiện đột biến gen EGFR từ mẫu bệnh phẩm của 100 bệnh nhân UTPKTBN. Mục Tiêu Cụ Thể: - Thiết kế mồi đặc hiệu dùng khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 trên gen EGFR của người.

Thiết kế mồi giải trình tự cho các vị trí 719, deletions, 768, 790, 858 và 861 trên gen EGFR. - Cài đặt các thử nghiệm (assay) trên máy PyroMark Q24, các thử nghiệm này phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 2 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Xác định tỷ lệ các kiểu đột biến trên gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Xác định các kiểu đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN.

Phạm vi nghiên cứu: Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing xác định các kiểu đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN. Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu đề ra, đề tài cần đạt được các nội dung như sau: - Nội dung 1: Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR. Thiết kế mồi giải trình tự cho các vị trí 719, deletions, 768, 790, 858 và 861 trên gen EGFR. - Nội dung 2: Xây dựng các thử nghiệm trên máy PyroMark Q24.

- Nội dung 3: Xác định ngưỡng phát hiện LOD (limit of detection) tại mỗi vị trí đột biến. - Nội dung 4: Xác định kiểu đột biến và tỷ lệ đột biến trên mẫu chuẩn nhận từ EMQN, đồng thời so sánh song song với kết quả của những mẫu này khi thực hiện với bộ thuốc thử EGFR Pyro® kit (Q24). - Nội dung 5: Xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen EGFR trên 100 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân UTPKTBN. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài a/ Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được bộ thuốc thử phát hiện đột biến gen EGFR có độ tin cậy cao trong chẩn đoán, nhằm đáp ứng các yêu cầu xét nghiệm lâm sàng.

- Cung cấp thông tin ban đầu về các đột biến trên gen EGFR tại Việt Nam. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 3 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học b/ Ý nghĩa thực tiễn - Bộ thuốc thử ra đời sẽ đáp ứng nhu cầu xét nghiệm của các bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam. - Cung cấp công cụ hữu ích trong tiên đoán mức độ thành công của liệu pháp điều trị đích ở bệnh nhân UTPKTBN bằng thuốc phân tử nhỏ. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 4 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học II.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài nét về ung thư và ung thư phổi 2. Ung thư Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan tới việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng việc phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn). Nguyên nhân gây ra ung thư là do sai hỏng trên DNA, tạo ra các đột biến trên các gene. Hai nhóm gen liên quan tới ung thư là: gen sinh ung, hay còn gọi là nhóm gen truyền tin, chúng mã hóa các tín hiệu và truyền tín hiệu cho tế bào phân chia.

Khi các gen này bị đột biến (bị hỏng) sẽ gây ra hiện tượng truyền tin quá mức, vì vậy tế bào sẽ phân chia quá mức (một cách không kiểm soát) dẫn tới hình thành khối u (ung thư). Một số gen thuộc nhóm này như: EGFR, K-ras, B-raf … Nhóm thứ 2 là gen ức chế hình thành khối u, các gen này mã hóa các enzyme bảo vệ. Các enzyme này sẽ nhận biết các đột biến trên DNA và sửa chữa chúng. Các gen thuộc nhóm gen ức chế hình thanh khối u như: BRCA1, BRCA2, P50, FAP … Như vậy khối u chỉ hình thành và phát triển thành ung thư khi cả 2 nhóm gen truyền tin và gen ức chế hình thành khối u cùng bị hư hại và lúc này ung thư có khả năng hình thành và phát triển.

Dấu hiệu của ung thư: ban đầu bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng rõ ràng, khi có triệu chứng rõ ràng thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng. Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh (Tức là thời gian từ một tế bào bị đột biến tiến triển thành ung thư với những triệu chứng rõ ràng) khá dài, khoảng 10 năm hoặc hơn nữa tùy thuộc từng loại ung thư. Do đó cách tốt nhất phòng ung thư là khám sức khỏe định kỳ 6 tháng một lần. Hiện nay có khoảng 200 loại ung thư và ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới.

Bệnh ung thư ảnh hưởng tới mọi người bất kể thuộc quốc gia, dân tộc nào trên thế giới. HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 5 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học 2. Ung thư phổi 80% bệnh nhân bị ung thư phổi là do hút thuốc lá, có khoảng 2000 tác nhân sinh ung thư được biết trong khói thuốc lá. Chất sinh ung thư phổi bao gồm: radon, asbestos, bischolomethylether, nickel, chromates, bột than, những chất đồng có hoạt tính phóng xạ và arsenic.

Một số nghề nghiệp làm gia tăng nguy cơ ung thư phổi, chẳng hạn như nghề đập đá làm tăng nguy cơ ung thư phổi lên 92 lần so với người bình thường và công nhân đúc tăng 3-8 lần… Nguy cơ ung thư phổi cũng tăng với nhóm người thường xuyên tiếp xúc với chất sinh ung. Ví dụ như nguy cơ ung thư phổi cũng tăng tỷ lệ thuận với số điếu thuốc được hút và người hút thuốc thì nguy cơ ung thư phổi cũng tăng 8-20 lần so với người bình thường. Ung thư phổi được chia làm 2 loại, ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không tế bào nhỏ. 15-25% là ung thư phổi tế bào nhỏ và 75-85% ung thư phổi là ung thư phổi không tế bào nhỏ.

UTPKTBN được chia làm 4 loại: ung thư tế bào tuyến, ung thư phế quản phổi, ung thư tế bào gai và ung thư tế bào lớn. Ung thư tế bào tuyến là loại UTPKTBN phổ biến nhất, phần lớn ung thư này thường phát triển ở ngoại vi của phổi và thường có xu hướng di căn đến các phần khác của cơ thể như: xương, hệ thần kinh trung ương, tuyến thượng thận, gan và phổi đối diện. Vì loại này thường phát triển ngoại vi nên cho đến khi cùng được phát hiện trên flim X quang ngực. Ung thư phế quản phổi và phế quản là ung thư phổi không tế bào nhỏ được tìm thấy trên khắp đường hô hấp.

Khi phát hiện trên flim X quang, nếu là khối đơn độc thì tiên lượng tốt và tỉ lệ sống sau 5 năm phẫu thuật là 75-90%, nếu nó xuất hiện dưới dạng lan tỏa thì tiên lượng xấu. Ung thư tế bào gai chiếm tỷ lệ khoảng 30-40% của UTPKTBN. Loại này có xu hướng ở trung tâm của phổi, thường trong khí quản.