Đặc điểm hình thái và sinh lý của các loài nấm chịu axit

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh lý của một số loài nấm chịu axit, cung cấp hiểu biết sâu về khả năng thích nghi của chúng.

• Tác giả: Le Phuong Thao
• Người hướng dẫn: Nguyen Thi Thuy Hanh, PhD
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Morphological and physiological characteristics of some acid-tolerant fungi species
• Loại tài liệu: Undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• 1. TABLE OF CONTENTS
• 2. LIST OF TABLES
• 3. LIST OF FIGURES
• 4. ABBREVIATIONS
• 5. ABSTRACT
• 6. INTRODUCTION
• 6.1. Introduction of acid-tolerant fungi
• 6.2. Origin and characteristics of acid-tolerant fungi
• 6.3. Some representative group of acid-tolerant fungi
• 6.4. Introduction of the genus Penicillium
• 6.5. Research on acid-tolerant fungi in the world and in Vietnam
• 6.5.1. Research on acid-tolerant fungi in the world
• 6.5.2. Research on acid-tolerant fungi in Vietnam
• 6.6. DNA barcoding for identification for phylogenetic species recognition
• 6.7. Methods to evaluate the biochemical and physiological characteristics of fungi
• 7. MATERIALS AND METHODS
• 7.1. Chemicals, equipment and media
• 7.2. Observation of colonies, cells
• 7.3. Purification and maintenance of strains
• 7.4. Method for biochemical and physiological test
• 7.5. DNA extraction and purification method for fungi cells
• 7.6. Method to classify based on DNA barcoding
• 7.7. Staining the gel and reading the result
• 8. RESULTS AND DISCUSSION
• 8.1. Observation of colonies and cells
• 8.2. Classification of strains based on rDNA sequence
• 8.3. Classification of strains based on β-tubulin and calmodulin sequence
• 8.4. The growth of strains on different environmental conditions
• 9. CONCLUSION AND PROPOSAL

Tóm tắt

I. Đặc điểm hình thái và sinh lý của nấm chịu axit

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm hình thái nấm và sinh lý nấm của các loài nấm có khả năng tồn tại trong môi trường axit. Các nấm chịu axit như Acidomyces acidophilus và Hortaea acidophila được phân tích chi tiết về cấu trúc tế bào, sắc tố melanin, và khả năng phát triển trong điều kiện pH thấp. Các đặc điểm hình thái bao gồm cấu trúc sợi nấm, bào tử, và sự hình thành khuẩn lạc. Sinh lý nấm được đánh giá qua khả năng chuyển hóa chất dinh dưỡng và sản xuất enzyme trong môi trường axit.

1.1. Đặc điểm hình thái của nấm chịu axit

Các loài nấm như Acidomyces acidophilus có cấu trúc sợi nấm dày, chứa melanin giúp bảo vệ tế bào khỏi môi trường axit. Khuẩn lạc phát triển chậm, có màu tối và cấu trúc dày đặc. Hortaea acidophila có tế bào nảy chồi, ban đầu trong suốt, sau chuyển sang màu tối và hình thành vách ngăn. Các đặc điểm này giúp nấm thích nghi với môi trường axit khắc nghiệt.

1.2. Sinh lý nấm trong điều kiện axit

Các nấm chịu axit có khả năng sản xuất enzyme chịu nhiệt và axit, ứng dụng trong công nghiệp. Acidomyces acidophilus sản xuất enzyme lignocellulolytic, trong khi Penicillium spp. sản xuất endo-polygalacturonase. Các enzyme này có tiềm năng lớn trong xử lý ô nhiễm môi trường và sản xuất công nghiệp.

II. Phân loại và sinh thái của nấm chịu axit

Nghiên cứu phân loại các loài nấm dựa trên trình tự DNA, bao gồm ITS, β-tubulin, và calmodulin. Các nấm chịu axit thuộc nhóm Ascomycota, với đặc điểm sinh thái đa dạng trong môi trường axit như đất, nước thải, và mỏ kim loại. Phân loại nấm giúp xác định các loài mới và hiểu rõ hơn về sự đa dạng sinh học trong môi trường axit.

2.1. Phân loại nấm dựa trên DNA

Các trình tự DNA như ITS, β-tubulin, và calmodulin được sử dụng để phân loại các loài nấm. Kết quả cho thấy các loài như Amplistroma và Penicillium có sự khác biệt đáng kể so với các nghiên cứu trước đây. Phương pháp này giúp xác định chính xác các loài nấm mới và mối quan hệ tiến hóa của chúng.

2.2. Sinh thái của nấm trong môi trường axit

Các nấm chịu axit thường được tìm thấy trong môi trường có pH thấp như đất axit, nước thải mỏ, và môi trường công nghiệp. Acidomyces acidophilus được phân lập từ đất gần nhà máy khí đốt, trong khi Hortaea acidophila được tìm thấy trong than nâu. Sự đa dạng sinh học của nấm trong môi trường axit cho thấy khả năng thích nghi cao của chúng.

III. Ứng dụng thực tiễn của nấm chịu axit

Các nấm chịu axit có tiềm năng lớn trong công nghiệp và xử lý môi trường. Enzyme chịu nhiệt và axit từ các loài nấm này được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, và xử lý chất thải. Penicillium spp. được ứng dụng trong sản xuất pho mát và enzyme công nghiệp. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc khai thác tiềm năng của nấm chịu axit.

3.1. Ứng dụng trong công nghiệp

Các enzyme từ nấm chịu axit như Acidomyces acidophilus và Penicillium spp. được sử dụng trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm. Penicillium spp. được ứng dụng trong sản xuất pho mát và enzyme công nghiệp. Các enzyme này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao và pH thấp, phù hợp với quy trình công nghiệp.

3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường

Các nấm chịu axit có khả năng phân hủy chất thải độc hại trong môi trường axit. Acidomyces acidophilus được sử dụng trong xử lý nước thải mỏ kim loại. Nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển các giải pháp sinh học để xử lý ô nhiễm môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nghiên cứu vi sinh vật tại các môi trường cực đoan (extremophiles), đặc biệt là môi trường có độ axit cao (pH cực thấp), là hướng tiếp cận thu hút nhiều sự quan tâm trong công nghệ sinh học và xử lý môi trường. Các loài nấm có khả năng chịu axit (acid-tolerant fungi) có thể sinh trưởng tại pH 1,0 và đạt mức sinh trưởng tối ưu ở khoảng pH 3,0. Các hệ enzyme chịu axit và chịu nhiệt từ nhóm vi sinh vật này mang lại giá trị lớn trong các quy trình công nghiệp (giảm độ nhớt cơ chất, tăng tốc độ phản ứng, giảm nguy cơ tạp nhiễm), tiêu biểu như enzyme lignocellulolytic từ chủng Bispora sp. MEY-1 hay endo-polygalacturonase từ Penicillium sp. CGMCC 1669 ứng dụng làm trong nước quả và rượu vang. Bên cạnh đó, các loài nấm chịu axit như Acidomyces acidophilus còn thể hiện tiềm năng trong việc xử lý ô nhiễm sinh học (mycoremediation), khử độc và tích lũy kim loại nặng như asen.

Tại Việt Nam, điều kiện tự nhiên nhiệt đới đem lại sự phong phú về tài nguyên sinh vật, tuy nhiên các nghiên cứu chuyên sâu về phân loại học và đặc tính sinh học của nhóm nấm chịu axit nồng độ cao còn rất hạn chế. Từ các khảo sát ban đầu tại Viện Công nghiệp Thực phẩm, nhiều chủng nấm có khả năng sinh trưởng ở pH < 1,0 đã được phân lập, mang nhiều đặc điểm sai khác so với các loài đã được công bố trên thế giới. Nhằm làm rõ vị trí phân loại và đặc tính của nguồn gen này, đề tài "Đặc điểm hình thái và sinh lý của một số loài nấm chịu axit" (tác giả Lê Phương Thảo, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp – Viện Công nghiệp Thực phẩm) đã được tiến hành.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể:

1. Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu trúc tế bào của các chủng nấm chịu axit trên các môi trường nuôi cấy.
2. Phân loại và định danh các chủng nấm chịu axit dựa trên việc phân tích các trình tự chỉ thị phân tử (DNA barcoding).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm 19 chủng nấm chịu pH thấp được phân lập từ các nguồn sinh thái đa dạng tại Việt Nam (đất rừng thông, đất đồi, rãnh xả thải axit của nhà máy, đất mỏ quặng pyrit, đất nương ngô, đất rác thải công nghiệp) thuộc các tỉnh thành: Kon Tum, Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ, Hà Nội, Thái Bình, Hưng Yên, Hà Giang, Hòa Bình, Thái Nguyên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận kết hợp đồng thời phương pháp phân loại học truyền thống (hình thái học, thử nghiệm sinh lý - sinh vật hóa học) và phương pháp sinh học phân tử hiện đại (định danh đa locus):

• Cơ sở lý thuyết phân loại nấm: Nghiên cứu dựa trên hệ thống phân loại nấm ngành Ascomycota, đặc biệt là khung phân loại chi Penicillium của Houbraken & Samson (2011) với 2 phân chi (Aspergilloides, Penicillium) và 25 phân đoạn (sections). Đồng thời, đề tài áp dụng nguyên lý định danh mã vạch DNA (DNA barcoding) nấm học theo chuẩn Schoch et al., kết hợp mã vạch chuẩn ITS (Internal Transcribed Spacer) với các mã vạch thứ cấp gồm D1/D2 (vùng LSU rDNA), $\beta$-tubulin (BenA), Calmodulin (CaM) và RPB2 (tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II).
• Phương pháp quan sát hình thái vi học: Nuôi cấy thuần khiết trên môi trường PDA (30°C, 3–7 ngày) và môi trường axit Malt-Glucose 2Bx chứa 1% $\text{H}_2\text{SO}_4$ (pH 1,0; 30°C, 14 ngày). Đặc điểm hình thái tế bào và cơ quan sinh sản được quan sát dưới kính hiển vi quang học Nikon Eclipse E-600 có trang bị kỹ thuật tương phản giao thoa vi sai (DIC), thu nhận hình ảnh qua camera kĩ thuật số.
• Phương pháp đánh giá sinh lý trên 9 môi trường chuẩn: Sử dụng kỹ thuật cấy điểm (three-point inoculation) với huyền phù bào tử ($30%$ glycerol, $0{,}05%$ agar, $0{,}05%$ Tween80) trên 9 môi trường dinh dưỡng chuẩn: CYA (Czapek Yeast Autolysate agar), MEA (Malt Extract agar), CZ (Czapek's agar), YES (Yeast Extract Sucrose agar), OA (Oatmeal agar), CREA (Creatine Sucrose agar), DG18 (Dichloran 18% Glycerol agar), MEAbl (Blakeslee's MEA) và CYAS (CYA bổ sung 5% NaCl). Nuôi cấy ở 30°C trong 7 ngày (kèm đối chứng CYA ở 37°C và kéo dài đĩa OA đến 30 ngày để theo dõi cấu trúc hữu tính), đo đường kính khuẩn lạc tại vị trí rộng nhất và ghi nhận sự đổi màu chỉ thị axit trên CREA.
• Phương pháp sinh học phân tử và phân tích phát sinh loài:
  • Tách chiết DNA tổng số: Phá vỡ tế bào bằng hạt thủy tinh ($0{,}5\text{ mm}$) và phenol/chloroform trên máy Mini-Beadbeater-8 trong 45 giây sau khi xử lý nhiệt 99°C trong đệm $2\times\text{SSC}$; tinh sạch qua cột Silica Beads DNA Gel Extraction Kit.
  • Khuếch đại PCR: Sử dụng các cặp mồi chuyên biệt gồm ITS1/ITS4 (vùng ITS), NL1/NL4 (vùng D1/D2), Bt2a/Bt2b (BenA), CF1/CF4 hoặc CMD5/CMD6 (CaM), và 5Feur/7CReur (RPB2). Chu trình luân nhiệt tiêu chuẩn ở nhiệt độ gắn mồi 55°C (hoặc 52°C đối với CaM) và chu trình Touch-up PCR đối với RPB2.
  • Điện di trên gel agarose 1% (đệm $0{,}5\times\text{TAE}$), nhuộm Ethidium bromide ($0{,}5\ \mu\text{g/ml}$).
  • Xử lý dữ liệu trình tự: Căn hàng đa trình tự bằng thuật toán FFT trên phần mềm MAFFT (EBI). Xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán Neighbor-joining trên phần mềm MEGA11 với kiểm định Bootstrap 500 lần lặp; khoảng cách di truyền tính theo mô hình Tamura 3-parameter (đối với ITS), Kimura 2-parameter (đối với D1/D2) và Maximum Composite Likelihood (đối với BenA, CaM).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu (Introduction)

Chương mở đầu phân tích tổng quan về tính đa dạng của vi sinh vật trong môi trường cực đoan, phân biệt ranh giới giữa nấm chịu axit (acid-tolerant) và nấm ưa axit (acidophilic). Tác giả tổng kết các mốc nghiên cứu nấm chịu axit từ năm 1943 với chủng Acontium velatum và "Fungus D" (tiền thân của Acidomyces acidophilus). Chương này làm rõ tiềm năng ứng dụng công nghiệp của các hệ enzyme chịu nhiệt - chịu axit trong việc thủy phân sinh khối lignocellulose và xử lý nước thải công nghiệp. Đồng thời, chương 1 chỉ ra khoảng trống nghiên cứu tại Việt Nam về nhóm vi sinh vật tiềm năng này và xác định rõ mục tiêu, nội dung thực nghiệm của khóa luận.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 trình bày chi tiết cơ sở lý luận và các công bố khoa học liên quan đến đề tài:

• Nguồn gốc và đặc điểm của nấm chịu axit: Phân tích khả năng thích nghi của sinh vật nhân thực trong các môi trường pH cực thấp kèm theo các điều kiện bất lợi như nồng độ kim loại nặng cao và nhiệt độ khắc nghiệt. Tổng hợp danh mục các loài nấm chịu axit tiêu biểu trên thế giới (Acidea extrema, Acidiella bohemica, Acidomyces acidophilus, Acidothrix acidophila, Hortaea acidophila).
• Tổng quan chi Penicillium: Lịch sử phân loại từ công bố của Link (1809) đến các sửa đổi phân loại phát sinh loài phân tử của Houbraken & Samson (2011); sự phân chia lại các chi trong họ Trichocomaceae, Aspergillaceae và Thermoascaceae.
• Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam: Nêu bật ứng dụng của A. acidophilus trong việc biểu hiện gen mã hóa glutathione S-transferase nhằm xử lý ô nhiễm asen trong đất, cũng như thực trạng thiếu hụt dữ liệu nghiên cứu bài bản về nấm chịu axit tại Việt Nam.
• Hệ thống DNA Barcoding: Đánh giá vai trò của chỉ thị ITS và các hạn chế của nó đối với các loài nấm có quan hệ gần gũi trong chi Penicillium; phân tích sự cần thiết của các gen mã vạch thứ cấp như BenA, CaM, và RPB2. Chi tiết hóa các trình tự mồi và chương trình luân nhiệt PCR.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương 3 mô tả toàn bộ vật liệu, hóa chất, thiết bị và các quy trình kỹ thuật đã triển khai:

• Thống kê nguồn gốc 19 chủng nấm phân lập tại Việt Nam.
• Thành phần các môi trường nuôi cấy chuyên biệt, bao gồm môi trường thạch Malt-Glucose 2Bx chứa 1% $\text{H}_2\text{SO}_4$, dung dịch huyền phù bào tử, và 9 môi trường sinh lý học chuẩn.
• Các bước thao tác tách chiết DNA tế bào nấm bằng phương pháp phá mẫu cơ học kết hợp hạt thủy tinh và phenol/chloroform.
• Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt cho từng vùng gen.
• Phương pháp phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MAFFT và MEGA11.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương 4 cung cấp toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào: Khi nuôi cấy trên PDA ở 30°C sau 3–7 ngày, các chủng phân hóa hình thái rõ rệt với màu sắc hệ sợi đa dạng (trắng, vàng, xanh lục, nâu), tạo sợi khí sinh và nhiều bào tử. Ngược lại, trên môi trường Malt-Glucose 2Bx pH 1,0 (sau 14 ngày), tốc độ sinh trưởng chậm hơn nhiều, khuẩn lạc có màu trắng đồng nhất, chủ yếu phát triển hệ sợi nấm dày đặc và sinh rất ít bào tử.
• Phân loại dựa trên trình tự rDNA (vùng ITS và D1/D2): 19 chủng nghiên cứu được phân loại sơ bộ vào 5 chi khác nhau gồm: 9 chủng thuộc chi Penicillium, 3 chủng thuộc chi Talaromyces, 3 chủng thuộc chi Amplistroma, 3 chủng thuộc chi Sarocladium, và 1 chủng thuộc chi Thyronectria.
  • Chủng Penicillium sp1. ASM 137-2 có quan hệ gần gũi với Penicillium dravuni trên cây phát sinh loài ITS (độ tương đồng 97,x%).
  • Chủng Sarocladium sp. ASS 135-1 chỉ đạt độ tương đồng 42,43% so với loài gần nhất đã biết là Sarocladium ochraceum.
  • Hai chủng ASS 40-3 và ASS 326-1 có độ tương đồng trình tự đạt 98,8% và tạm thời được xếp vào cùng một nhóm loài (Penicillium sp2).
  • Đối với chi Amplistroma (gồm các chủng AS 175-2, ASS 46-1, ASS 99-1), cây phát sinh loài xây dựng trên vùng D1/D2 (501 vị trí nucleotide, mô hình Kimura 2-parameter) cho thấy các chủng này tạo thành một nhánh riêng biệt có quan hệ gần với loài Amplistroma erinaceum CBS 134881.
• Phân loại dựa trên trình tự $\beta$-tubulin (BenA) và Calmodulin (CaM): Phân tích đa gen đối với nhóm Penicillium chỉ ra sự khác biệt so với cây phát sinh loài ITS. Trên cây phân loại BenA (381 vị trí) và CaM (482 vị trí), chủng ASM 137-2 nằm gần với loài Penicillium griseolum (NRRL 2671T / DTO 264-G7T) thay vì Penicillium dravuni như trên cây ITS, khẳng định tính cần thiết của việc sử dụng hệ thống phân loại đa locus.
• Đặc tính sinh trưởng trên 9 môi trường khác nhau: Khảo sát đường kính khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy ở 30°C:
  • Tất cả các loài phát triển trên môi trường YES đều không tạo extrolite phát huỳnh quang.
  • Chủng Penicillium sp2. ASM 147 thể hiện khả năng sinh axit mạnh trên môi trường CREA, làm đổi màu chỉ thị từ tím sang vàng, trong khi các chủng khác không làm đổi màu môi trường.
  • Các chủng thuộc chi Sarocladium sp. không sinh trưởng hoặc sinh trưởng cực kỳ yếu trên tất cả các môi trường khảo sát.
  • Trên các môi trường có hoạt độ nước thấp (DG18 và CYAS), các chủng phát triển trên CYAS kém hơn đáng kể so với trên DG18.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Proposal)

Chương cuối tóm tắt các kết luận chính về 8 nhóm loài mới được phân loại sơ bộ và các đặc tính sinh thái - sinh lý thu nhận được, đồng thời đưa ra kiến nghị tiếp tục giải trình tự các vùng gen RPB2 và EF1-$\alpha$ nhằm định danh chính xác vị trí phân loại học.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã khảo sát toàn diện 19 chủng nấm chịu axit phân lập tại Việt Nam, thu được các kết quả cụ thể về nguồn gốc và phân loại:

STT	Tên chủng	Tình trạng chủng	Nguồn gốc thu thập mẫu	Phân loại sơ bộ
1	AS 175-2	Type strain	Lá thông mục – Ya Ly, Sa Thầy, Kon Tum	Amplistroma sp.
2	ASS 46-1		Đất bãi khô – 217 & 516B, Cẩm Thủy, Thanh Hóa	Amplistroma sp.
3	ASS 99-1		Đất mùn chân đồi – Quan Lạn, Vân Đồn, Quảng Ninh	Amplistroma sp.
4	ASM 137-2	Type strain	Rãnh xả axit nhà máy – Hải Phòng	Penicillium sp1.
5	ASM 139-1		Rãnh xả axit nhà máy – Hải Phòng	Penicillium sp1.
6	ASM 141-1		Rãnh xả axit nhà máy – Hải Phòng	Penicillium sp1.
7	ASS 40-3	Type strain	Đất chân núi – Đường Yên Trung, Uông Bí, Quảng Ninh	Penicillium sp2.
8	ASS 326-1		Sông Công, Thái Nguyên	Penicillium sp2.
9	ASS 52-1	Type strain	Đất vườn – Đường Trần Thừa, Nam Định	Talaromyces sp.
10	ASM 115	Type strain	Quặng pyrit – Phú Thọ	Penicillium sp4.
11	ASM 147		Quặng pyrit Minh Quang – Ba Vì, Hà Nội	Penicillium sp2.
12	ASM 153-1		Quặng pyrit Minh Quang – Ba Vì, Hà Nội	Penicillium sp4.
13	AS 616-3	Type strain	Đông Hưng, Thái Bình	Talaromyces sp1.
14	AS 19		Rác sàn nhà máy nhiễm axit – Lạc Đạo, Văn Lâm, Hưng Yên	Talaromyces sp1.
15	ASS 348-2		Đông Anh, Hà Nội	Talaromyces sp1.
16	ASS 135-1	Type strain	Mẫu đất PQ1	Sarocladium sp.
17	ASS 125-1		Đất cằn nương ngô – Lũng Táo, Đồng Văn, Hà Giang	Sarocladium sp.
18	ASS 30		Đất axit mỏ quặng pyrit cũ – Minh Quang, Ba Vì, Hà Nội	Sarocladium sp.
19	ASS 64-1	Type strain	Đất đồi – Lâm Sơn, Lương Sơn, Hòa Bình	Thyronectria sp.

Nghiên cứu mang lại các đóng góp chính:

• Xác định và phân loại sơ bộ 8 loài nấm mới có khả năng sống ở môi trường axit cực đoan tại Việt Nam thuộc các chi: Amplistroma sp., Penicillium sp. (Penicillium sp1, Penicillium sp2, Penicillium sp4), Talaromyces sp. (Talaromyces sp1), Sarocladium sp., và Thyronectria sp.
• Cung cấp bộ dữ liệu hình thái hiển vi so sánh giữa môi trường chuẩn và môi trường pH 1,0, chứng minh sự biến đổi hình thái và hạn chế sinh bào tử của sợi nấm trong điều kiện pH khắc nghiệt.
• Bổ sung dữ liệu sinh học phân tử đa locus (ITS, D1/D2, BenA, CaM) cho các loài nấm chịu axit tại Việt Nam, đóng góp vào cơ sở dữ liệu phân loại học vi nấm quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế và đề xuất phương hướng phát triển tiếp theo:

• Hạn chế: Trình tự mã vạch của một số chủng mới chỉ dừng lại ở các vùng ITS, D1/D2, BenA và CaM; chưa hoàn thành việc khuếch đại và phân tích toàn diện vùng gen RPB2 và EF1-$\alpha$ do độ phức tạp trong phản ứng khuếch đại mồi thoái hóa; chưa mô tả đầy đủ các cấu trúc sinh sản hữu tính kéo dài trên môi trường OA sau 30 ngày đối với tất cả các chủng.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Tiếp tục khuếch đại và giải trình tự các gen mã vạch bổ trợ gồm RPB2 và EF1-$\alpha$ nhằm xác lập chính xác vị trí phân loại của các nhóm loài mới.
  2. Mô tả hình thái học chi tiết và giải phẫu vi học hoàn chỉnh để hoàn thiện hồ sơ công bố loài mới theo quy chuẩn danh pháp quốc tế.
  3. Khảo sát hoạt tính sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào chịu axit (cellulase, xylanase, pectinase) và khả năng hấp phụ kim loại nặng nhằm định hướng ứng dụng thực tế.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành: Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học môi trường, và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình pha chế và thiết lập hệ thống 9 môi trường sinh thái chuẩn để khảo sát phân loại học vi nấm.
  • Kỹ thuật tách chiết DNA nấm sợi vỏ dày bằng phương pháp phá mẫu cơ học kết hợp hạt thủy tinh và dung môi hữu cơ.
  • Bộ mồi và các chương trình luân nhiệt PCR (đặc biệt là Touch-up PCR) dùng cho khuếch đại các locus mã vạch phân tử ITS, D1/D2, BenA, CaM, và RPB2.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận nghiên cứu bao nhiêu chủng nấm chịu axit và phân lập từ những nguồn nào?
Nghiên cứu khảo sát 19 chủng nấm chịu axit được phân lập tại Việt Nam từ nhiều nguồn sinh cảnh khác nhau như lá thông mục (Kon Tum), đất đồi (Quảng Ninh, Hòa Bình), đất rãnh xả thải axit nhà máy (Hải Phòng), quặng pyrit (Phú Thọ, Ba Vì - Hà Nội), rác sàn công nghiệp nhiễm axit (Hưng Yên), và đất nương ngô cằn cỗi (Hà Giang).

2. Tại sao nghiên cứu phải sử dụng thêm các chỉ thị phân tử BenA và CaM bên cạnh mã vạch ITS?
Vùng ITS tuy là mã vạch chuẩn cho nấm nhưng không đủ độ biến dị để phân biệt các loài có quan hệ tiến hóa rất gần trong chi Penicillium. Phân tích thực nghiệm trong khóa luận cho thấy chủng ASM 137-2 khi phân tích theo ITS nằm gần Penicillium dravuni, nhưng khi phân tích theo BenA và CaM lại nằm gần Penicillium griseolum. Do đó, việc kết hợp các chỉ thị phân tử thứ cấp (BenA, CaM, RPB2) là bắt buộc để định danh chính xác tới cấp độ loài.

3. Sự khác biệt hình thái của các chủng nấm khi nuôi cấy trên môi trường PDA và môi trường Malt 2Bx pH 1,0 là gì?
Trên môi trường PDA (sau 3–7 ngày), khuẩn lạc phân hóa rõ rệt về màu sắc (trắng, vàng, xanh lục, nâu), tạo hệ sợi khí sinh phát triển mạnh và sản sinh nhiều bào tử. Trên môi trường Malt 2Bx chứa 1% $\text{H}_2\text{SO}_4$ ở pH 1,0 (sau 14 ngày), tốc độ phát triển chậm hơn, khuẩn lạc có màu trắng thuần, phát triển chủ yếu dạng mạng sợi dày đặc và sinh rất ít bào tử.

4. Chủng nấm nào trong nghiên cứu có khả năng sinh axit trên môi trường CREA?
Chủng Penicillium sp2. ASM 147 thể hiện hoạt tính sinh axit rõ rệt trên môi trường Creatine Sucrose agar (CREA), làm chuyển màu chỉ thị pH của môi trường từ màu tím sang màu vàng, trong khi các chủng còn lại không làm đổi màu môi trường.

5. Kết quả phân tích phát sinh loài đã phát hiện bao nhiêu loài nấm mới tiềm năng?
Nghiên cứu đã xác định được 8 nhóm loài mới tiềm năng thuộc 5 chi nấm khác nhau: Amplistroma sp., Penicillium sp. (Penicillium sp1, Penicillium sp2, Penicillium sp4), Talaromyces sp. (Talaromyces sp1), Sarocladium sp., và Thyronectria sp.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Lê Phương Thảo đã thực hiện khảo sát toàn diện đặc điểm hình thái học và sinh lý học của 19 chủng nấm chịu axit phân lập tại Việt Nam, chứng minh khả năng sinh trưởng của các chủng này trong điều kiện pH cực thấp (pH 1,0). Bằng phương pháp giải trình tự đa gen (ITS, D1/D2, BenA, CaM), nghiên cứu đã phân loại 19 chủng vào 5 chi (Penicillium, Talaromyces, Amplistroma, Sarocladium, Thyronectria) và bước đầu phát hiện 8 loài mới tiềm năng. Các kết quả đạt được cung cấp nguồn dẫn liệu vi sinh học quan trọng cho việc phân loại học nấm chịu axit và mở ra tiềm năng khai thác các hệ enzyme chịu axit trong công nghệ sinh học tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  LE PHUONG THAO UNDERGRADUATE THESIS TITLE: MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF SOME ACID-TOLERANT FUNGI SPECIES Hanoi, March 2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  UNDERGRADUATE THESIS TITLE: MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF SOME ACID-TOLERANT FUNGI SPECIES Student name : Le Phuong Thao Class : K62CNSHE Faculty : Biotechnology Supervisors : Nguyen Thi Thuy Hanh, PhD. Vu Nguyen Thanh, Assoc. Hanoi, March 2022 COMMITMENT I hereby declare that: This is my study, which was conducted under the guidance of the supervisors; All data provided are true and accurate; All published data and information have been duly cited. Hanoi, March 2022 Student Le Phuong Thao i ACKNOWLEDGEMENTS Firstly, I would like to express my gratitude to Assoc.

Vu Nguyen Thanh – who has given me all support, guidance, all the necessary information that made me complete the thesis. He allowed me to do the necessary research work and use the lab equipment needed in his lab – Center for industrial microbiology, Food Industries Research Institute. In addition, I would like to extend our sincere esteems to all members in laboratory for their timely support. Secondly, I owe my deep gratitude to Dr.

Nguyen Thi Thuy Hanh for an opportunity to conduct my thesis at Food Industries Research Institute and her invaluable guidance during the past time. It is also giving my thankfulness to friends and relatives for sharing my difficulties and giving me various used advices during the process of learning and studying. Finally, I would like to thanks the leaders of Vietnam National University of Agriculture, Department of Biotechnology and Food Industries Research Institute for creating conditions for me to complete my thesis well. Thank you so much! Le Phuong Thao ii TABLE OF CONTENTS COMMITMENT.

ii TABLE OF CONTENTS. iii LIST OF TABLES. v LIST OF FIGURES. Introduction of acid-tolerant fungi.

Origin and characteristics of acid-tolerant fungi. Some representative group of acid-tolerant fungi. Introduction of the genus Penicillium. Research on acid-tolerant fungi in the world and in Vietnam.

Research on acid-tolerant fungi in the world. Research on acid-tolerant fungi in Vietnam. DNA barcoding for identification for phylogenetic species recognition. Methods to evaluate the biochemical and physiological characteristics of fungi.

MATERIALS AND METHODS. Chemicals, equipment and media. Observation of colonies, cells. Purification and maintenance of strains.

Method for biochemical and physiological test. DNA extraction and purification method for fungi cells. Method to classify based on DNA barcoding. Staining the gel and reading the result.

RESULTS AND DISCUSSION. Observation of colonies and cells. Classification of strains based on rDNA sequence. Classification of strains based on β-tubulin and calmodulin sequence.

The growth of strains on different environmental conditions. CONCLUSION AND PROPOSAL. 41 iv LIST OF TABLES Table 2. The list of the acid-tolerant fungi, the fungi originally described as indigenous inhabitants of highly acidic habitats (pH < 3).

(Hujslová et al. Primers used for amplification and sequencing. (Visagie et al. Thermal cycle programs used for amplification.

(Visagie et al. Origin of isolates of low pH acid-tolerant fungi strains. Primers used for amplification and sequencing. The colony diameter at the widest part of the colony after 7 days of cultivation.

36 v LIST OF FIGURES Figure 2. Extreme acidic environments. Morphological features of the Acidomyces acidophilus WKC-1. Microscopy of Hortaea acidophila, CBS 113389.

Morphological characteristics of colonies and cells on PDA medium and Malt 2Bx medium pH 1.0 of representative strains. Neighbour-joining phylogram depicting the relationships between strains and neighbouring taxa based on ITS sequences. Neighbour-joining phylogram depicting the relationships between Amplistroma and neighbouring taxa based on D1/D2 sequences. Neighbour-joining phylogram depicting the relationships between Penicillum and neighbouring taxa based on CaM sequences.

Neighbour-joining phylogram depicting the relationships between Penicillum and neighbouring taxa based on BenA sequences. Colonies after 7 days of cultivation on different media.