Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Atropin và scopolamin là các độc tố tự nhiên thuộc nhóm Tropan alcaloid (TA), phân bố chủ yếu trong các loài thực vật thuộc họ Cà (Solanaceae) như Datura (cây Cà độc dược), Hyoscyamus và Atropa, cũng như một số họ thực vật khác (Brassicaceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Convolvulaceae). Trong tự nhiên, các loài cỏ dại chứa TA phát triển phổ biến và mọc xen lẫn trong các vùng canh tác cây lương thực. Khi thu hoạch bằng phương pháp cơ giới hóa, hạt, lá, hoa hoặc quả của chúng dễ bị thu hái lẫn, dẫn đến tình trạng lây nhiễm chéo vào các loại nông sản như ngô, kê, lúa miến, kiều mạch, đậu nành, hạt lanh, hạt hướng dương, cũng như các loại trà thảo dược.

Về mặt dược lý và độc học, atropin và scopolamin là các chất đối kháng cạnh tranh với acetylcholin tại thụ thể muscarinic (mAChR) ở cả hệ thần kinh trung ương và ngoại vi. Sự phơi nhiễm qua đường tiêu hóa gây ra hội chứng kháng cholinergic cấp tính với các triệu chứng lâm sàng: khô miệng, giảm tiết mồ hôi, giãn đồng tử, tăng nhãn áp, rối loạn điều tiết mắt, tim đập nhanh, tăng huyết áp, ức chế cơ trơn tiêu hóa; ở liều cao có thể gây bồn chồn, lú lẫn, ảo giác, mê sảng, hôn mê và tử vong. Trên thế giới, nhiều vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn do nhiễm TA đã được ghi nhận: đợt bùng phát tại Uganda năm 2019 khiến hơn 300 người nhập viện và 5 ca tử vong do sử dụng bột ngô và đậu nành cứu trợ; đợt ngộ độc tại Slovakia và Cộng hòa Séc vào tháng 3 năm 2021 khiến hơn 100 người nhập viện do nhiễm trên 3000 µg/kg TA trong rau bina xay nhuyễn đông lạnh.

Trước các nguy cơ này, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) năm 2013 đã thiết lập liều tham chiếu cấp tính (ARfD) cho tổng hàm lượng (-)-hyoscyamin và (-)-scopolamin là 0,016 µg/kg thể trọng. Tiếp đó, Ủy ban Châu Âu đã ban hành Quy định (EU) 2016/239 và Quy định (EU) 2021/1408 (có hiệu lực từ ngày 01/09/2022) siết chặt giới hạn tối đa của TA trong thực phẩm: từ 1,0 µg/kg đối với thức ăn chế biến từ ngũ cốc cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, đến 5,0 – 15,0 µg/kg đối với nông sản chưa chế biến và sản phẩm chế biến từ ngô, kê, lúa miến, kiều mạch.

Tại Việt Nam, cây Cà độc dược (Datura metel L.) mọc hoang dại và phân bố rộng rãi tại nhiều địa phương (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh...), tiềm ẩn nguy cơ cao lây nhiễm atropin và scopolamin vào nguồn lương thực và dược liệu. Tuy nhiên, Bộ Y tế Việt Nam chưa ban hành quy định giới hạn phơi nhiễm cũng như chưa có quy trình phân tích tiêu chuẩn để kiểm soát các Tropan alcaloid trong nền mẫu thực phẩm. Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Quang Tùng được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống kỹ thuật này với 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời atropin và scopolamin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
  2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để khảo sát, xác định hàm lượng atropin và scopolamin trong một số mẫu thực phẩm và thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường.
  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất atropin, scopolamin và chất chuẩn nội Atropin-D5.
  • Đối tượng phân tích (nền mẫu): Thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên được chế biến từ các loại hạt và ngũ cốc (kê, ngô, lúa mạch, yến mạch, đậu đỗ...).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội phối hợp với Khoa Độc học và Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia; các mẫu thực phẩm thương mại được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ nông sản và vùng trồng trên địa bàn Hà Nội (quận Hai Bà Trưng, Hoàn Kiếm, Thanh Xuân) trong năm 2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và quy chuẩn tham chiếu

Nghiên cứu ứng dụng nguyên lý sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) kết hợp đầu dò khối phổ hai lần (Tandem Mass Spectrometry - MS/MS) với nguồn ion hóa phun điện tử chế độ dương (ESI+) và kỹ thuật theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring - MRM). Do cấu trúc khung tropan chứa nguyên tử nitơ bậc 3 mang tính base yếu ($pK_a$ của atropin là 9,25; scopolamin là 7,75), các phân tử dễ dàng nhận proton để tạo thành ion tiền thân $[M+H]^+$ trong pha động acid hóa nhẹ. Kỹ thuật khối phổ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole) cho phép lọc chọn ion mẹ tại tứ cực thứ nhất (Q1), phân rã bằng va chạm khí trơ (CID) tại tứ cực thứ hai (Q2) và chọn lọc các ion con đặc trưng tại tứ cực thứ ba (Q3), mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà không đòi hỏi phân tử phải có nhóm mang màu mạnh.

Quy trình thẩm định phương pháp được thiết kế và đánh giá tuân thủ nghiêm ngặt theo các hướng dẫn chuẩn hóa quốc tế:

  • Hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức (AOAC International - 2016, Appendix F).
  • Hướng dẫn xác thực phương pháp phân tích dư lượng của Ủy ban Châu Âu theo Quyết định Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 (thay thế Decision 2002/657/EC), áp dụng hệ thống tính điểm nhận dạng (Identification Points - IP) và tỷ lệ ion định tính/định lượng.
  • Dược điển Hoa Kỳ (USP) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA) về tiêu chí độ phù hợp hệ thống sắc ký.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình chiết xuất pha rắn phân tán QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) cải tiến kết hợp làm sạch bằng d-SPE nhằm loại bỏ triệt để các hợp chất nền phức tạp (protein, chất béo, acid hữu cơ phân cực, đường) trong ngũ cốc:

  • Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 5,0 g mẫu nghiền mịn vào ống ly tâm 50 mL, bổ sung 10 µL dung dịch chuẩn nội Atropin-D5 100 ppb; làm ẩm bằng 10 mL nước cất (vortex 1 phút); chiết bằng 10 mL acetonitril (ACN) chứa 1% acid formic (HCOOH) (lắc ngang 30 phút).
  • Tách pha: Phân tách pha bằng hỗn hợp muối析 xuất gồm 4,0 g $MgSO_4$ khan và 1,0 g $NaCl$, vortex 1 phút và ly tâm lạnh ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 3 phút.
  • Làm sạch (d-SPE): Hút 1,0 mL lớp dịch nổi ACN chuyển vào ống eppendorf d-SPE chứa 50 mg chất hấp phụ pha đảo octadecylsilan ($C_{18}$) và 50 mg $MgSO_4$ khan; vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút; lọc dịch trong vào vial phân tích.

Trang thiết bị, hóa chất và nguồn dữ liệu

  • Thiết bị chính: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Prominence 20 AXL ghép nối đầu dò khối phổ Sciex Triple Quad 5500; cột phân tích pha đảo Waters Symmetry $C_{18}$ ($3,0 \times 150 \text{ mm}, 3,5\ \mu\text{m}$); máy ly tâm lạnh Hermle Z326K; máy lắc ngang IKA KS501; cân phân tích Mettler Toledo (độ chính xác 0,1 mg).
  • Hóa chất và chất chuẩn: Chất chuẩn atropin (độ tinh khiết 99,15%, LGC), scopolamin (độ tinh khiết 96%, Sigma-Aldrich), chất chuẩn nội đồng vị Atropin-D5 ($C_{17}H_{18}D_5NO_3$, độ tinh khiết 98%, Sigma-Aldrich); dung môi ACN, methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn phân tích sắc ký khối phổ; các muối $MgSO_4$, $NaCl$, $Na_2SO_4$, chất hấp phụ $C_{18}$, amin thứ cấp PSA, acid formic, amoni format đạt độ tinh khiết phân tích.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về atropin và scopolamin

Chương này hệ thống hóa các tư liệu khoa học về đặc tính lý hóa, nguồn gốc tự nhiên, độc tính học, các khung pháp lý quốc tế và tổng quan phương pháp phân tích Tropan alcaloid:

  • Đặc tính lý hóa: Atropin ($C_{17}H_{23}NO_3$, phân tử lượng 289,4 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 118,5°C, $\log K_{ow} = 1,83$) và scopolamin ($C_{17}H_{21}NO_4$, phân tử lượng 303,35 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 59°C, $\log K_{ow} = 0,98$) đều là este của acid tropic với các base amin tropin hoặc scopin. Cả hai hợp chất đều ở dạng bột kết tinh trắng, tan tốt trong nước và dung môi hữu cơ phân cực.
  • Độc tính theo liều lượng: Liệt kê chi tiết đáp ứng lâm sàng của atropin: từ liều 0,5 mg (giảm tiết mồ hôi, nhịp tim chậm nhẹ), 1,0 – 2,0 mg (khô miệng rõ rệt, giãn đồng tử, tim đập nhanh), 5,0 mg (khó nuốt, nhức đầu, giảm nhu động ruột) đến liều độc 10,0 mg (mạch nhanh yếu, sốt cao, da đỏ bừng, ảo giác, mê sảng, hôn mê). Scopolamin có tác dụng ức chế thần kinh trung ương mạnh hơn, gây an thần, mất trí nhớ tạm thời và rối loạn tâm thần cấp tính. Thuốc đối kháng điều trị ngộ độc đặc hiệu là physostigmin salicylat.
  • So sánh các kỹ thuật phân tích: Tổng hợp 7 nghiên cứu tiêu biểu trên thế giới về định lượng TA trên các nền mẫu bột mì, bánh mì, rau bina, trà thảo mộc, mật ong và ngũ cốc. Phân tích chỉ ra phương pháp HPLC-MS/MS và UHPLC-MS/MS vượt trội hoàn toàn so với HPLC-UV (do TA không có nhóm mang màu mạnh) và GC-MS (đòi hỏi dẫn xuất hóa phức tạp do TA kém bền nhiệt và khó bay hơi).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 thiết lập toàn bộ quy trình thực nghiệm, từ hóa chất, nồng độ pha chế dung dịch chuẩn gốc (atropin 1040 ppm, scopolamin 384 ppm, Atropin-D5 490 ppm), phương pháp tối ưu hóa thiết bị, quy trình QuEChERS dự kiến, cho đến thiết kế thẩm định phương pháp:

  • Thiết lập công thức đánh giá ảnh hưởng nền mẫu ($ME%$) thông qua so sánh hệ số góc đường chuẩn trên nền mẫu trắng ($a_{\text{nền}}$) và trên nền dung môi ($a_{\text{dung môi}}$): $$ME (%) = \frac{a_{\text{nền}} - a_{\text{dung môi}}}{a_{\text{dung môi}}} \times 100%$$
  • Quy định các tiêu chí thẩm định theo AOAC 2016 và EC 2021/808: độ phù hợp hệ thống ($RSD \le 2%$), độ tuyến tính ($r^2 \ge 0,99$), giới hạn định lượng ($S/N \ge 10$), độ thu hồi (yêu cầu $40 - 120%$ ở mức 1 ppb với $RSD \le 30%$), và hệ thống 5 điểm nhận dạng IP.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả thực nghiệm tối ưu hóa, thẩm định phương pháp và ứng dụng trên mẫu thực tế:

1. Tối ưu hóa điều kiện LC-MS/MS

  • Khối phổ MS/MS: Bơm trực tiếp dung dịch chuẩn 10 ppb qua kỹ thuật FIA ở chế độ ESI(+). Xác định ion phân tử $[M+H]^+$ và tối ưu hóa năng lượng va chạm CE, thế thoát ô va chạm CXP cho từng mảnh ion định tính và định lượng.
Hợp chất Ion mẹ ($m/z$) Ion con ($m/z$) CE (eV) CXP (V) Vai trò ion
Atropin 290,0 124,0 29 20 Định lượng
93,0 37 14 Định tính
Scopolamin 304,0 138,0 29 18 Định lượng
156,0 21 20 Định tính
Atropin-D5 (IS) 295,2 124,0 29 20 Định lượng
93,0 37 14 Định tính
  • Thông số nguồn ion: Curtain Gas (CUR) 30 psi, Collision Gas (CAD) 8 psi, Ionspray Voltage (IS) 4500 V, Temperature (TEM) 450°C, Ion Source Gas 1 (GS1) 45 psi, Ion Source Gas 2 (GS2) 45 psi, Entrance Potential (EP) 10 V.
  • Tối ưu hóa pha động: Khảo sát 5 hệ pha động khác nhau. Hệ đệm Kênh A ($0,1% \text{ HCOOH} + 10\text{ mM } HCOONH_4$ trong nước) và Kênh B ($\text{MeOH}$) theo chương trình gradient trong 8,5 phút cho pic sắc ký cân đối nhất, hạn chế ion hóa sớm và tách rời hoàn toàn các chất phân tích (thời gian lưu: scopolamin 4,15 phút; Atropin-D5 4,51 phút; atropin 4,54 phút).

2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

  • Dung môi chiết: HCOOH 1% trong ACN cho đáp ứng tín hiệu diện tích pic $R(m)$ vượt trội so với $CH_3COOH$ 1% trong ACN nhờ khả năng acid hóa mạnh hơn, làm tăng mức độ phân ly của các TA.
  • Thời gian chiết: Khảo sát tại 0, 15, 30, 60, 120 phút. Thời gian 30 phút đạt hiệu suất chiết tối ưu ($R(m)$ atropin đạt 0,96; scopolamin đạt 1,44 $1/\text{g}$), kéo dài thời gian đến 60–120 phút không làm tăng thêm tín hiệu.
  • Muối chiết và làm sạch d-SPE: Hỗn hợp muối $4\text{ g } MgSO_4 + 1\text{ g } NaCl$ cho hiệu suất muối析 tách pha tốt nhất. Hỗn hợp làm sạch d-SPE gồm $50\text{ mg } C_{18} + 50\text{ mg } MgSO_4$ giúp loại bỏ chất béo và dịch trong nhất mà không làm thất thoát hoạt chất.

3. Đánh giá ảnh hưởng nền và thẩm định phương pháp

  • Ảnh hưởng nền mẫu (ME): Hệ số $ME%$ trên nền ngũ cốc lần lượt là $-1,18%$ (atropin) và $-1,87%$ (scopolamin). Do $|ME| < 20%$, việc sử dụng chất chuẩn nội Atropin-D5 đã triệt tiêu hoàn toàn hiệu ứng ức chế ion hóa của nền mẫu, cho phép sử dụng đường chuẩn trong dung môi để định lượng mẫu thực tế.
  • Độ đặc hiệu và tỷ số ion: Phương pháp đạt 5 điểm nhận dạng IP theo tiêu chuẩn EU 2021/808 (1 điểm cho LC, 1 điểm cho ion mẹ, $2 \times 1,5$ điểm cho 2 ion con). Độ lệch tỷ số ion $R_{\text{diff}}$ giữa nền mẫu thêm chuẩn và dung môi đạt $-6,59%$ với atropin (giới hạn cho phép $\pm 25%$) và $-44,88%$ với scopolamin (giới hạn cho phép $\pm 50%$).
  • Độ phù hợp hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 0,1 ppb cho $RSD$ thời gian lưu $\le 0,36%$; $RSD$ diện tích pic và tỷ số diện tích chất phân tích/chuẩn nội đều $< 2,0%$.
Thông số thẩm định Atropin Scopolamin Tiêu chuẩn AOAC / Đánh giá
Khoảng tuyến tính 0,1 – 2,0 ppb 0,1 – 2,0 ppb $r^2 \ge 0,99$
Phương trình hồi quy $y = 7,64x - 0,0246$ $y = 5,88x - 0,0697$ Tuyến tính cao
Hệ số tương quan ($r^2$) 0,9998 1,0000 Đạt
Độ chệch ($\Delta_i$) $-2,8% \text{ đến } +8,0%$ $-2,3% \text{ đến } +4,0%$ Đạt ($
LOQ (ppb) $< 0,1$ ($S/N = 49,3$) $< 0,1$ ($S/N = 83,7$) Đạt ($S/N \ge 10$)
LOD (ppb) $< 0,03$ $< 0,03$ Tính theo $LOQ / 3,3$
Độ thu hồi trung bình $85,1% - 100,0%$ $85,3% - 96,3%$ Đạt ($40 - 120%$ ở 1 ppb)
Độ lặp lại ($RSD$, $n=6$) $1,49% - 2,71%$ $1,91% - 3,07%$ Đạt ($RSD \le 30%$)
Độ tái lặp nội bộ ($RSD_R$) $0,97%$ (mức 0,5 ppb) $1,05%$ (mức 0,5 ppb) Đạt ($RSD_R \le 30%$)

4. Phân tích mẫu thực tế

Áp dụng phương pháp phân tích 11 mẫu nông sản và ngũ cốc thương mại thu thập tại Hà Nội:

STT Loại mẫu Khối lượng cân (g) Thể tích chiết (mL) Hàm lượng Atropin ($\mu\text{g/kg}$) Hàm lượng Scopolamin ($\mu\text{g/kg}$)
1 Bột nếp 5,0215 10 $< LOD$ $< LOD$
2 Hạt hỗn hợp 5,0106 10 $< LOD$ $< LOD$
3 Hạt đỗ xanh 5,0105 10 $< LOD$ $< LOD$
4 Hạt đậu tương 5,0170 10 $< LOD$ $< LOD$
5 Hạt đỗ đen 5,0046 10 $< LOD$ $< LOD$
6 Hạt lạc 4,9930 10 $< LOD$ $< LOD$
7 Hạt vừng 4,9990 10 $< LOD$ $< LOD$
8 Kiều mạch 5,0115 10 $< LOD$ $< LOD$
9 Hạt gạo 5,0065 10 $< LOD$ $< LOD$
10 Hạt kê (mẫu 1) 5,0053 10 Dương tính ($> 0,2$) Dương tính ($> 0,2$)
11 Hạt kê (mẫu 2 - lặp lại) 5,0053 10 1,1688 1,7821

Kết quả phát hiện $2/11$ mẫu hạt kê bị nhiễm đồng thời atropin ($1,17\ \mu\text{g/kg}$) và scopolamin ($1,78\ \mu\text{g/kg}$), tổng hàm lượng đạt $2,95\ \mu\text{g/kg}$. Căn cứ theo ngưỡng liều tham chiếu cấp tính ARfD ($0,016\ \mu\text{g/kg}$ thể trọng), trẻ nhỏ tiêu thụ trên 100 g sản phẩm từ mẫu hạt kê này có nguy cơ bị ngộ độc cấp tính.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính đạt được

  1. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phân tích đồng thời atropin và scopolamin trên thiết bị HPLC-MS/MS sử dụng cột Symmetry $C_{18}$ với thời gian phân tích ngắn (8,5 phút/mẫu) và quy trình chuẩn bị mẫu QuEChERS kết hợp d-SPE nhanh chóng, tiết kiệm dung môi.
  2. Thẩm định đầy đủ các thông số kỹ thuật theo tiêu chuẩn AOAC 2016 và EC 2021/808: giới hạn định lượng $LOQ < 0,1\ \mu\text{g/kg}$ (thấp hơn nhiều so với ngưỡng quy định của EU là $1,0\ \mu\text{g/kg}$); khoảng tuyến tính $0,1 - 2,0\ \text{ppb}$ với $r^2 \ge 0,9998$; độ thu hồi cao ($85,1 - 100,0%$); độ chụm cao với $RSD < 3,1%$ và $RSD_R \le 1,05%$.
  3. Đánh giá thực trạng nhiễm độc tự nhiên: Khảo sát 11 mẫu nông sản lưu hành tại Hà Nội, phát hiện 2 mẫu hạt kê nhiễm atropin ($1,1688\ \mu\text{g/kg}$) và scopolamin ($1,7821\ \mu\text{g/kg}$).

Kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục ứng dụng phương pháp để mở rộng kiểm nghiệm trên quy mô lớn đối với nhiều loại thực phẩm chế biến, thực phẩm chức năng và thức ăn dặm trẻ em trên thị trường nhằm đánh giá toàn diện nguy cơ phơi nhiễm TA.
  • Nghiên cứu mở rộng phương pháp để phân tích đồng thời các dẫn xuất Tropan alcaloid khác (như anisodin, homatropin...) trên các nền mẫu thảo dược, dịch chiết thực vật và dịch truyền.

Đóng góp học thuật và thực tiễn

  • Là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam phát triển quy trình phân tích vết Tropan alcaloid trong thực phẩm bằng LC-MS/MS đạt ngưỡng định lượng dưới $0,1\ \text{ppb}$, vượt trội về độ nhạy so với nhiều nghiên cứu quốc tế trước đó (thường có $LOQ$ từ $0,3 - 1,2\ \mu\text{g/kg}$).
  • Chứng minh hiệu quả vượt trội của chất chuẩn nội đồng vị Atropin-D5 trong việc triệt tiêu ảnh hưởng nền ($|ME| < 2%$), cho phép đơn giản hóa quy trình tính toán bằng đường chuẩn dung môi thay vì phải lập đường chuẩn thêm trên từng nền mẫu phức tạp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế về quy mô khảo sát: Số lượng mẫu thực tế được phân tích còn khiêm tốn ($n = 11$ mẫu), phạm vi lấy mẫu chỉ tập trung tại một số quận nội thành Hà Nội, chưa phản ánh đầy đủ bức tranh phơi nhiễm TA trên toàn quốc.
  • Hạn chế về phổ hoạt chất: Nghiên cứu mới tập trung vào 2 hoạt chất chính là atropin và scopolamin, chưa bao quát các alcaloid tropan phụ khác có thể cùng tồn tại trong cây họ Cà.
  • Hướng phát triển: Mở rộng thẩm định phương pháp trên các nền mẫu phức tạp hơn như thực phẩm chức năng dạng cao lỏng, trà thảo dược phối hợp nhiều thành phần, và các sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho trẻ sơ sinh.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học; kiểm nghiệm viên tại các viện kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm, các phòng phân tích dịch vụ đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
  • Phần giá trị nhất: Quy trình xử lý mẫu QuEChERS cải tiến kết hợp d-SPE và bộ thông số tối ưu hóa đa phản ứng (MRM transitions, CE, CXP, thông số nguồn ESI) trên hệ thống khối phổ tứ cực chập ba, có thể áp dụng trực tiếp vào thực tế kiểm nghiệm thường quy mà không cần mất thời gian khảo sát lại từ đầu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu sử dụng chất chuẩn nội Atropin-D5 và hiệu quả mang lại là gì?
Atropin-D5 ($C_{17}H_{18}D_5NO_3$) là đồng vị bền chứa 5 nguyên tử Deuteri thay thế Hydro. Do có cấu trúc hóa học và tính chất phân bố tương đồng với atropin và scopolamin, Atropin-D5 giúp bù trừ toàn bộ sai số do thất thoát mẫu trong quá trình chiết QuEChERS và làm sạch d-SPE. Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền cho thấy hệ số $ME%$ giảm xuống chỉ còn $-1,18%$ (atropin) và $-1,87%$ (scopolamin), nhỏ hơn nhiều so với ngưỡng $20%$ theo AOAC, cho phép phòng thí nghiệm sử dụng trực tiếp đường chuẩn trong dung môi để định lượng.

2. Các ion mẹ và ion con nào được lựa chọn để định tính và định lượng atropin và scopolamin trong chế độ MRM?

  • Atropin: Ion mẹ $m/z\ 290,0 \rightarrow$ Ion con định lượng $m/z\ 124,0$ (năng lượng va chạm $CE = 29\text{ eV}$); ion con định tính $m/z\ 93,0$ ($CE = 37\text{ eV}$).
  • Scopolamin: Ion mẹ $m/z\ 304,0 \rightarrow$ Ion con định lượng $m/z\ 138,0$ ($CE = 29\text{ eV}$); ion con định tính $m/z\ 156,0$ ($CE = 21\text{ eV}$).
  • Atropin-D5: Ion mẹ $m/z\ 295,2 \rightarrow$ Ion con định lượng $m/z\ 124,0$ ($CE = 29\text{ eV}$); ion con định tính $m/z\ 93,0$ ($CE = 37\text{ eV}$).

3. Quy trình xử lý mẫu tối ưu trong khóa luận gồm những bước cụ thể nào?
Cân 5,0 g mẫu nghiền mịn $\rightarrow$ Thêm $10\ \mu\text{L}$ Atropin-D5 100 ppb $\rightarrow$ Thêm 10 mL nước cất (vortex 1 phút) $\rightarrow$ Thêm 10 mL ACN chứa 1% HCOOH (vortex 1 phút, lắc ngang 30 phút) $\rightarrow$ Thêm $4\text{ g } MgSO_4 + 1\text{ g } NaCl$ (vortex 1 phút, ly tâm 6000 rpm trong 3 phút) $\rightarrow$ Lấy 1,0 mL dịch nổi cho vào ống d-SPE chứa $50\text{ mg } C_{18} + 50\text{ mg } MgSO_4$ (vortex 1 phút, ly tâm 13000 rpm trong 5 phút) $\rightarrow$ Lọc dịch trong vào vial tiêm HPLC-MS/MS.

4. Giới hạn định lượng (LOQ) và độ thu hồi của phương pháp đạt được là bao nhiêu, có đáp ứng yêu cầu của AOAC không?
Giới hạn định lượng của cả atropin và scopolamin đều đạt $< 0,1\ \mu\text{g/kg}$ ($LOQ = 0,1\ \text{ppb}$ với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu $S/N$ của atropin là 49,3 và scopolamin là 83,7). Độ thu hồi trên nền mẫu thêm chuẩn đạt $85,1% - 100,0%$ (atropin) và $85,3% - 96,3%$ (scopolamin) với độ lệch chuẩn tương đối $RSD \le 3,07%$. Các kết quả này hoàn toàn thỏa mãn quy định AOAC 2016 đối với phân tích vết ở mức nồng độ 1 ppb (yêu cầu độ thu hồi $40 - 120%$ và $RSD \le 30%$).

5. Kết quả phân tích mẫu thực tế trên thị trường Hà Nội ghi nhận những phát hiện gì đáng lưu ý?
Trong 11 mẫu khảo sát (gồm bột nếp, đỗ xanh, đậu tương, đỗ đen, lạc, vừng, kiều mạch, gạo, hạt hỗn hợp và hạt kê), phát hiện 2 mẫu hạt kê có phản ứng dương tính với hàm lượng atropin là $1,1688\ \mu\text{g/kg}$ và scopolamin là $1,7821\ \mu\text{g/kg}$ (tổng hàm lượng $2,9509\ \mu\text{g/kg}$). Mức phơi nhiễm này vượt ngưỡng cảnh báo an toàn cấp tính (ARfD $0,016\ \mu\text{g/kg}$ thể trọng do EFSA quy định) nếu trẻ nhỏ tiêu thụ khẩu phần trên 100 g.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Quang Tùng đã phát triển và thẩm định thành công phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) kết hợp chiết xuất QuEChERS/d-SPE và chuẩn nội Atropin-D5 để định lượng đồng thời atropin và scopolamin trong ngũ cốc. Phương pháp đạt độ nhạy cao ($LOQ < 0,1\ \mu\text{g/kg}$), độ thu hồi tốt ($85,1 - 100,0%$) và triệt tiêu hoàn toàn ảnh hưởng nền mẫu theo các tiêu chuẩn quốc tế AOAC 2016 và EC 2021/808. Kết quả phát hiện độc tố tự nhiên trong các mẫu hạt kê thương mại tại Hà Nội khẳng định tính cấp thiết của việc ban hành quy chuẩn kiểm soát và quy trình phân tích Tropan alcaloid trong thực phẩm tại Việt Nam.