Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo mô hình nuôi tế bào 2d 3d dùng để sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú tế bào gốc ung thư vú vn9 cd44

Luận án tiến sĩ nghiên cứu sinh học nghiên cứu tạo mô hình nuôi tế bào 2d 3d dùng để sàng lọc các cao chiết thực vật có độc, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Phan Lữ Chính Nhân
• Người hướng dẫn: GS. Trương Đình Kiệt
• Trường học: Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Mô Hình Nuôi Tế Bào 2D, 3D Để Sàng Lọc Cao Chiết Thực Vật Có Độc Tính Trên Tế Bào Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về ung thư Vú
• 1.2. Sinh học tế bào ung thư Vú
• 1.3. Cơ sở phân tử của ung thư Vú. Tế bào gốc ung thư Vú
• 1.4. Phân lập và marker phân tử. Những đặc tính quan trọng của tế bào gốc ung thư vú
• 1.5. Nuôi cấy tế bào ung thư dùng trong sàng lọc thuốc. Nuôi tế bào lớp đơn (nuôi 2D)
• 1.6. Nhu cầu nuôi khối tế bào 3 chiều (nuôi 3D). Ưu điểm của mô hình nuôi tế bào 3D dùng trong sàng lọc thuốc
• 1.7. Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D. Sự biểu hiện các protein kết nối tế bào – tế bào, tế bào và chất nền ngoại bào khi nuôi cấy 3D
• 1.8. Sàng lọc thuốc trong nghiên cứu điều trị ung thư. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.9. Các liệu pháp điều trị ung thư chính dựa vào hợp chất thiên nhiên. Lý do cho sự cần thiết nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú ở dạng 3D cho sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào
• 1.10. Vật liệu - Phương pháp. Sơ đồ các nội dung trong nghiên cứu trong luận án
• 1.11. Đối tượng thí nghiệm. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các phương pháp nuôi, phân lập tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam
• 2.2. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng dòng chảy
• 2.3. Các phương pháp dùng trong thiết lập mô hình nuôi 2D, 3D
• 2.4. Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng MTT
• 2.5. Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng Resazurin
• 2.6. Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng và thời gian nhân đôi của dòng tế bào
• 2.7. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose
• 2.8. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa giọt treo
• 2.9. Phương pháp đánh giá lõi hoại tử
• 2.10. Phương pháp nuôi cấy trong chất nền matrigel
• 2.11. Phương pháp RT-PCR
• 2.12. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
• 2.13. Các phương pháp khác
• 2.14. Phương pháp thể hiện số liệu bằng màu
• 2.15. Phương pháp phân tích quần thể apoptosis
• 2.16. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24-, khảo sát sự tăng trưởng, khả năng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2
• 3.2. Thiết lập mô hình nuôi 2D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin
• 3.3. Thiết lập mô hình nuôi 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin và Tirapazamine
• 3.4. Quy trình thử chất kháng phân bào trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú nuôi 3D
• 3.5. So sánh biểu hiện một số gen, tỷ lệ quần thể tế bào CD44+/CD24- trong mô hình nuôi 2D và mô hình nuôi 3D dùng matrigel
• 3.6. Đề xuất việc chọn mô hình nuôi 2D hoặc nuôi 3D dùng trong sàng lọc hợp chất có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú
• 3.7. Ứng dụng mô hình nuôi 2D, 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú trong sàng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Mô Hình Nuôi Cấy Tế Bào Ung Thư Vú

Nghiên cứu mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D mở ra hướng đi mới trong sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là cao chiết thực vật có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú. Mô hình in vitro này cho phép đánh giá độc tính tế bào một cách hiệu quả, từ đó xác định các ứng viên tiềm năng cho liệu pháp điều trị ung thư. Việc so sánh giữa nuôi cấy tế bào 2D và 3D giúp làm sáng tỏ những khác biệt về đáp ứng thuốc và cơ chế tác động của các hợp chất. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa các mô hình nuôi cấy, đồng thời ứng dụng chúng để sàng lọc cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú.

1.1. Tầm quan trọng của mô hình in vitro trong nghiên cứu ung thư

Mô hình in vitro, bao gồm nuôi cấy tế bào 2D và 3D, đóng vai trò then chốt trong nghiên cứu ung thư. Chúng cung cấp một hệ thống đơn giản hóa để nghiên cứu các quá trình sinh học phức tạp và đánh giá hiệu quả của các liệu pháp điều trị tiềm năng. So với mô hình in vivo, mô hình in vitro có ưu điểm về chi phí thấp, thời gian thực hiện ngắn và khả năng kiểm soát các yếu tố môi trường tốt hơn. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất và xác định các ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu sâu hơn. Theo nghiên cứu, mô hình in vitro giúp giảm thiểu số lượng thí nghiệm trên động vật, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế tác động của thuốc.

1.2. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào 3D so với nuôi cấy tế bào 2D

Nuôi cấy tế bào 3D mang lại nhiều ưu điểm so với nuôi cấy tế bào 2D truyền thống. Mô hình 3D tái tạo cấu trúc và chức năng của mô ung thư in vivo một cách chân thực hơn, bao gồm sự tương tác giữa các tế bào, sự hình thành gradient oxy và chất dinh dưỡng, và sự biểu hiện của các protein liên kết tế bào. Điều này dẫn đến sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa hai mô hình, với tế bào ung thư trong mô hình 3D thường kháng thuốc hơn so với tế bào trong mô hình 2D. Do đó, nuôi cấy tế bào 3D được coi là một công cụ sàng lọc thuốc hiệu quả hơn, giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong môi trường phức tạp hơn.

II. Thách Thức Trong Sàng Lọc Độc Tính Cao Chiết Thực Vật

Việc sàng lọc cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú đối mặt với nhiều thách thức. Sự phức tạp của thành phần hóa học trong cao chiết gây khó khăn cho việc xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hơn nữa, sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú đòi hỏi việc sử dụng các mô hình sàng lọc phù hợp. Việc đánh giá độc tính một cách chính xác và toàn diện, bao gồm cả ảnh hưởng đến chu trình tế bào, apoptosis, và sự hình thành khối u, là rất quan trọng. Nghiên cứu này tập trung vào việc giải quyết những thách thức này bằng cách phát triển các quy trình sàng lọc hiệu quả và sử dụng các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D phù hợp.

2.1. Sự phức tạp của thành phần hóa học trong cao chiết thực vật

Cao chiết thực vật chứa một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất hóa học, bao gồm các hợp chất có hoạt tính sinh học và các hợp chất trơ. Sự phức tạp này gây khó khăn cho việc xác định các hợp chất chịu trách nhiệm cho độc tính quan sát được. Việc phân lập và xác định các hợp chất hoạt tính đòi hỏi các kỹ thuật phân tích phức tạp và tốn kém. Hơn nữa, các hợp chất khác nhau trong cao chiết có thể tương tác với nhau, dẫn đến các hiệu ứng hiệp đồng hoặc đối kháng, làm phức tạp thêm quá trình đánh giá độc tính.

2.2. Đánh giá độc tính toàn diện trên tế bào ung thư vú

Việc đánh giá độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú cần được thực hiện một cách toàn diện, bao gồm cả ảnh hưởng đến chu trình tế bào, apoptosis, và sự hình thành khối u. Các xét nghiệm như MTT assay và Resazurin assay có thể được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Phân tích chu trình tế bào và apoptosis giúp xác định cơ chế tác động của các hợp chất. Nghiên cứu cũng cần đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng di căn và xâm lấn của tế bào ung thư.

III. Phương Pháp Nuôi Cấy Tế Bào 2D 3D Để Sàng Lọc Độc Tính

Nghiên cứu này sử dụng cả phương pháp nuôi cấy tế bào 2D và 3D để sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú. Nuôi cấy tế bào 2D được sử dụng để sàng lọc ban đầu do tính đơn giản và chi phí thấp. Nuôi cấy tế bào 3D được sử dụng để xác nhận kết quả và đánh giá độc tính trong môi trường phức tạp hơn. Các phương pháp nuôi cấy 3D được sử dụng bao gồm nuôi cấy trên đĩa giọt treo, nuôi cấy trong chất nền matrigel, và nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose. Các phương pháp này cho phép tế bào ung thư hình thành khối u, tái tạo cấu trúc và chức năng của mô ung thư in vivo.

3.1. Quy trình nuôi cấy tế bào 2D và đánh giá độc tính bằng MTT

Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D được thực hiện bằng cách cấy tế bào ung thư vú trong môi trường dinh dưỡng phù hợp trên đĩa petri. Sau khi tế bào bám dính và phát triển, cao chiết thực vật được thêm vào môi trường. Sau một thời gian ủ nhất định, khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng MTT assay. MTT assay dựa trên khả năng của tế bào sống để khử muối tetrazolium thành formazan, một sản phẩm có màu. Lượng formazan được đo bằng quang phổ kế, và tỷ lệ sống sót của tế bào được tính toán.

3.2. Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và đánh giá độc tính

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp nuôi cấy tế bào 3D, bao gồm nuôi cấy trên đĩa giọt treo, nuôi cấy trong chất nền matrigel, và nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose. Trong nuôi cấy trên đĩa giọt treo, tế bào được cấy trong các giọt môi trường nhỏ và lơ lửng. Trong nuôi cấy trong chất nền matrigel, tế bào được cấy trong một chất nền protein phức tạp, tái tạo môi trường ngoại bào. Trong nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose, tế bào được cấy trên một lớp agarose, ngăn chặn sự bám dính của tế bào vào đĩa. Sau khi tế bào hình thành khối u, cao chiết thực vật được thêm vào môi trường, và độc tính được đánh giá bằng các phương pháp như MTT assay, Resazurin assay, và phân tích apoptosis.

IV. Ứng Dụng Mô Hình 2D 3D Sàng Lọc Cao Chiết Thực Vật

Các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D được sử dụng để sàng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật trên các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Kết quả cho thấy một số cao chiết có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư, với IC50 thấp. Sự khác biệt về độc tính giữa các cao chiết và giữa các dòng tế bào được quan sát. Một số cao chiết có độc tính chọn lọc trên tế bào gốc ung thư vú, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào tế bào gốc ung thư.

4.1. Phân tích IC50 của cao chiết thực vật trên các dòng tế bào

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) được xác định cho mỗi cao chiết thực vật trên các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú trong cả mô hình nuôi cấy 2D và 3D. Giá trị IC50 cho phép so sánh độc tính của các cao chiết khác nhau và xác định các cao chiết có hoạt tính mạnh nhất. Sự khác biệt về giá trị IC50 giữa các dòng tế bào cho thấy sự khác biệt về độ nhạy cảm với các cao chiết.

4.2. Đánh giá tiềm năng sử dụng cao chiết cây Sao đen Hopea odorata

Một trong những cao chiết thực vật được nghiên cứu là cao chiết từ cây Sao đen (Hopea odorata). Kết quả cho thấy cao chiết này có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và cơ chế tác động của cao chiết cây Sao đen có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

V. So Sánh Mô Hình Nuôi 2D và 3D Trong Sàng Lọc Độc Tính

Nghiên cứu so sánh hiệu quả của mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D trong việc sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật. Kết quả cho thấy mô hình nuôi cấy 3D có khả năng tái tạo môi trường in vivo tốt hơn, dẫn đến sự khác biệt về đáp ứng thuốc so với mô hình nuôi cấy 2D. Tế bào ung thư trong mô hình 3D thường kháng thuốc hơn so với tế bào trong mô hình 2D. Do đó, mô hình nuôi cấy 3D được coi là một công cụ sàng lọc thuốc hiệu quả hơn, giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong môi trường phức tạp hơn.

5.1. Sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa mô hình 2D và 3D

Sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa mô hình nuôi cấy 2D và 3D có thể là do sự khác biệt về cấu trúc tế bào, sự tương tác giữa các tế bào, và sự biểu hiện của các protein liên kết tế bào. Trong mô hình 3D, tế bào ung thư hình thành khối u, tạo ra gradient oxy và chất dinh dưỡng, và biểu hiện các protein liên kết tế bào. Những yếu tố này có thể ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của thuốc và cơ chế tác động của thuốc.

5.2. Đề xuất lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc

Việc lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc độc tính phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu. Mô hình nuôi cấy 2D phù hợp cho sàng lọc ban đầu do tính đơn giản và chi phí thấp. Mô hình nuôi cấy 3D phù hợp cho xác nhận kết quả và đánh giá độc tính trong môi trường phức tạp hơn. Nghiên cứu cũng cần xem xét sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú để lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Mô Hình Nuôi Tế Bào

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng và ứng dụng các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D để sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú. Kết quả cho thấy các mô hình nuôi cấy này là công cụ hữu ích để xác định các hợp chất có tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Hướng nghiên cứu trong tương lai bao gồm việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các cao chiết có hoạt tính, và phát triển các mô hình nuôi cấy phức tạp hơn, tái tạo môi trường in vivo một cách chân thực hơn.

6.1. Tóm tắt kết quả chính và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xác định một số cao chiết thực vật có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Nghiên cứu cũng đã so sánh hiệu quả của mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D trong việc sàng lọc độc tính, và đề xuất lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc. Kết quả của nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và tiềm năng ứng dụng

Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các cao chiết có hoạt tính, và phát triển các mô hình nuôi cấy phức tạp hơn, tái tạo môi trường in vivo một cách chân thực hơn. Nghiên cứu cũng có thể tập trung vào việc phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào tế bào gốc ung thư, và đánh giá hiệu quả của các liệu pháp này trong các mô hình nuôi cấy và in vivo.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu ung thư học hiện đại đang đối mặt với thách thức lớn về tỷ lệ tái phát và kháng thuốc trong điều trị ung thư biểu mô tuyến vú. Báo cáo của GLOBOCAN năm 2018 chỉ ra rằng ung thư vú chiếm 11,6% tổng số ca mắc mới ung thư toàn cầu (xấp xỉ 2,1 triệu ca) và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nữ giới. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc mới tăng từ 24,4/100.000 (năm 2013) lên 26,2/100.000 phụ nữ (năm 2018), tương đương hơn 15.000 ca mắc mới và trên 6.000 trường hợp tử vong. Đáng chú ý, hơn 40% bệnh nhân bị tái phát sau các can thiệp đa mô thức (phẫu thuật, hóa trị, xạ trị) và có từ 60-70% bệnh nhân tái phát tiến triển thành di căn xa. Khoảng trống tri thức (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng các mô hình thử nghiệm tiền lâm sàng 2D (monolayer culture) truyền thống thất bại trong việc tái hiện vi môi trường khối u (Tumor Microenvironment - TME) và không đánh giá được quần thể tế bào gốc ung thư vú (Breast Cancer Stem Cells - BCSCs), dẫn đến tỷ lệ thất bại của các ứng viên thuốc điều trị ung thư trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III lên đến 50%, với chi phí nghiên cứu vượt mức 1 tỷ USD cho mỗi phân tử thuốc được phê duyệt thương mại.

Để giải quyết triệt để vấn đề này, luận án tiến sĩ chuyên ngành Sinh lý học Người và Động vật của nghiên cứu sinh Phan Lữ Chính Nhân, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Trương Đình Kiệt tại Viện Tế bào gốc (Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM) phối hợp cùng phòng thí nghiệm GS. David Eisenberg và PGS. Alice Soragni (Đại học California, Los Angeles - UCLA), đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu tạo mô hình nuôi tế bào 2D, 3D dùng để sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24-".

Mục tiêu nghiên cứu tập trung vào 4 câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và giả thuyết khoa học (Hypotheses - H) tương ứng:

• RQ1/H1: Tế bào gốc ung thư vú phân lập từ dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam (VN9) mang kiểu hình $CD44^{+}/CD24^{-}$ có biểu hiện đặc tính tự làm mới, tạo khối cầu mammosphere và bộc lộ các dấu ấn kháng thuốc cao hơn dòng tế bào khối u đại trà.
• RQ2/H2: Khung nuôi cấy 3D (sử dụng đĩa giọt treo Hanging Drop và khuôn nền Matrigel) phản ánh chính xác cấu trúc vi mô khối u in vivo, tái lập gradient oxy/dinh dưỡng và biến đổi kiểu hình phân tử bám dính so với nuôi cấy lớp đơn 2D.
• RQ3/H3: Độ nhạy và cơ chế kháng hóa trị liệu (Doxorubicin, Tirapazamine) biến thiên có ý nghĩa thống kê giữa cấu trúc tế bào 2D và 3D, đặc biệt ở quần thể $CD44^{+}/CD24^{-}$.
• RQ4/H4: Thư viện 34 cao chiết thực vật bản địa Việt Nam chứa đựng các phân tử có hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc (Selective Effect Index - SEI) cao trên tế bào gốc ung thư vú khi sàng lọc qua nền tảng 3D chuẩn hóa.

Phạm vi nghiên cứu bao quát từ mức độ biểu hiện gen (RT-PCR: DNMT1, DNMT3B, BRCA1, p53, PI3KCA, AKT1), hóa mô miễn dịch, phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) đến sàng lọc độc tính tế bào trên 34 cao chiết tự nhiên, mở ra giải pháp đột phá trong đánh giá tiền lâm sàng dược liệu chống ung thư tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu định vị giao điểm giữa sinh học tế bào gốc ung thư, công nghệ nuôi cấy tế bào không gian ba chiều và sàng lọc hoạt chất tự nhiên. Lịch sử nuôi cấy tế bào bắt đầu từ công trình kinh điển của Harrison (1907) về nuôi cấy mô thần kinh đơn lớp, sau đó phát triển thành chuẩn mực thử nghiệm độc chất in vitro. Tuy nhiên, các phân tích từ Dangles-Marie và cộng sự (2003) cùng Hirschhaeuser và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng nuôi cấy 2D làm mất tính phân cực tế bào, triệt tiêu tương tác giữa tế bào với chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix - ECM), đồng thời đồng nhất hóa bất thường mức độ tiếp xúc với dinh dưỡng và oxy.

Trong dòng nghiên cứu về tế bào gốc ung thư vú, Al-Hajj và cộng sự (2003) đã tạo nên bước ngoặt khi chứng minh dấu ấn bề mặt $CD44^{+}/CD24^{-/low}$ sở hữu khả năng sinh u vượt trội: "Chỉ cần khoảng 100 tế bào thuộc quần thể này đã có thể hình thành khối u trong chuột NOD/SCID trong khi 10.000 tế bào ung thư bình thường không thể hình thành được khối u". Điều này củng cố thuyết "Seed and Soil" khởi xướng bởi Stephen Paget (1889), khẳng định BCSCs là hạt mầm quyết định sự di căn và tái phát ung thư. Tranh biện khoa học kéo dài giữa hai trường phái: một bên cho rằng tính kháng thuốc thuần túy do các kênh bơm ngoại bào nhóm ATP-binding cassette (như ABCG2, tăng phiên mã đến 30 lần trong quần thể side population) được kích hoạt bởi chọn lọc hóa trị (Fillmore & Kuperwasser, 2008); bên còn lại chứng minh cấu trúc vi môi trường vật lý (barrier thẩm thấu, vùng lõi hoại tử thiếu oxy - hypoxic necrotic core) mới là nhân tố tiên quyết hạn chế sự xâm nhập của phân tử trị liệu (Minchinton & Tannock, 2006).

Về mặt công nghệ nuôi cấy 3D, luận án đặt đối sánh trực tiếp với hai nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Kelm và cộng sự (2003, 2004) thiết lập hệ thống giọt treo (Hanging Drop) vi giọt 20 $\mu$L nhưng gặp trở ngại khi mở rộng quy mô sàng lọc thông lượng cao (High-Throughput Screening - HTS) và khó kiểm soát sự bay hơi môi trường.
2. Công trình của Ivascu và Kubbies (2006) ứng dụng bề mặt tráng phủ chất chống bám dính Poly-HEMA (Poly-2-hydroxyethyl methacrylate) để tạo spheroid đồng nhất bằng lực ly tâm nhưng thiếu hụt các phối tử tương tác sinh học ngoại bào.

Luận án của Phan Lữ Chính Nhân đã định vị tính tiên phong bằng cách kết hợp song song cả kỹ thuật giọt treo cải tiến (đĩa Perfecta3D 96 giếng) và nuôi cấy cài đặt trong khung nền Matrigel tự nhiên trên dòng tế bào ung thư vú bản địa người Việt Nam (VN9), đối chứng trực tiếp với dòng chuẩn quốc tế MCF-7. Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam thiết lập hoàn chỉnh quy trình sàng lọc hoạt chất tự nhiên nhắm trúng đích quần thể tế bào gốc ung thư $CD44^{+}/CD24^{-}$ trên nền tảng 3D đa tầng.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng thuyết Tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cell Theory) và thuyết Vi môi trường khối u thông qua việc làm sáng tỏ cơ chế điều hòa biểu sinh (epigenetics) và con đường truyền tín hiệu nội bào khi chuyển đổi hình học tế bào từ không gian 2D sang 3D:

• Lý thuyết Methyl hóa DNA & Biểu sinh: Mở rộng các luận điểm của Robertson (2005) và Lin cùng cộng sự thông qua việc chứng minh cấu trúc 3D làm biến đổi mức độ phiên mã của các enzyme DNA methyltransferase duy trì (DNMT1) và de novo (DNMT3B). Sự thay đổi này trực tiếp chi phối trạng thái tăng methyl hóa (hypermethylation) tại vùng promoter của các gen ức chế khối u then chốt (p53, BRCA1), giải thích cơ chế tế bào tự điều chỉnh biểu hiện để thích nghi với tình trạng stress vi môi trường.
• Lý thuyết Tín hiệu sinh tồn PI3K/AKT: Đóng góp bằng chứng thực nghiệm vào con đường truyền tín hiệu do Cantley (1990) và cộng sự phát hiện. Luận án chỉ ra sự tăng cường biểu hiện của PI3KCA (tiểu đơn vị xúc tác $p110\alpha$) và kinase AKT1 trong khối 3D BCSC, tạo ra cascade phosphoryl hóa ức chế các phân tử gây chết theo chương trình (Bad, Bax) và kích hoạt các yếu tố thúc đẩy chu kỳ tế bào (Cyclin D1 thông qua bất hoạt GSK3$\beta$).
• Mô hình Chuyển đổi Kháng thuốc Không gian: Đề xuất mô hình lý thuyết khẳng định cơ chế kháng hóa trị liệu là sự tích hợp giữa hai yếu tố: hàng rào khuếch tán vật lý của khối cầu 3D và sự chọn lọc sinh học phân tử biểu hiện quá mức kênh vận chuyển ABCG2 ở quần thể $CD44^{+}/CD24^{-}$.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng từ 3 khung lý thuyết chuyên ngành: (1) Mô hình dược động học vi mô chất rắn, (2) Động học tăng sinh tế bào gốc, và (3) Hệ số tương tác bám dính tế bào - chất nền ngoại bào.

Luận án xây dựng ma trận phân tích 4 nhóm tế bào đối sánh song song:

1. Tế bào ung thư vú đại trà VN9 (2D vs 3D)
2. Tế bào gốc ung thư vú VN9 $CD44^{+}/CD24^{-}$ (2D vs 3D)
3. Tế bào ung thư chuẩn quốc tế MCF-7 (2D vs 3D)
4. Tế bào gốc ung thư MCF-7 $CD44^{+}/CD24^{-}$ (2D vs 3D)

Điều kiện biên (boundary conditions) được xác lập chặt chẽ: Áp dụng trên các khối tế bào spheroid có kích thước hình học chuẩn hóa $50-100\ \mu\text{m}$ nhằm bảo tồn vùng vi lõi thiếu oxy nhưng loại trừ biến dạng hoại tử tự phát quá mức trước can thiệp dược chất; môi trường nuôi cấy không bổ sung huyết thanh ngoại lai nhằm loại trừ các yếu tố tăng trưởng gây nhiễu trong quá trình đánh giá chỉ số ức chế nửa tối đa ($\text{IC}_{50}$).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo hệ hình thực chứng (positivism) với lập trường nhận thức luận khách quan thực nghiệm y sinh học, sử dụng thiết kế đa tầng (multi-level experimental design):

• Cấp độ tế bào & dưới tế bào: Tách chiết, phân loại kiểu hình bề mặt và phân tích biểu hiện gen.
• Cấp độ mô hình không gian: Đối sánh chéo giữa 2D Monolayer, 3D Scaffold-free (Hanging Drop trên đĩa Perfecta3D 96 giếng), và 3D Scaffold-based (khuôn nền Matrigel tự nhiên trích xuất từ màng đáy tế bào chuột EHS).
• Cấp độ sàng lọc hoạt chất: Thử nghiệm độc tính song song trên 34 cao chiết thảo dược thực vật bản địa Việt Nam.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thao tác chuẩn (SOP) được tiến hành qua các giai đoạn nghiêm ngặt:

1. Làm giàu và phân tách tế bào gốc ung thư vú: Dòng tế bào ung thư vú VN9 được phân lập bằng hệ thống kháng thể gắn hạt từ tính MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) với bộ kit chuyên biệt cho dấu ấn CD44 và CD24. Độ tinh sạch của quần thể $CD44^{+}/CD24^{-}$ được tái kiểm định bằng Flow cytometry đạt độ đồng nhất cao, chứng minh khả năng hình thành khối cầu mammosphere ổn định qua nhiều thế hệ cấy chuyền.
2. Chuẩn hóa kỹ thuật đo lường tín hiệu sống của tế bào: So sánh thực nghiệm giữa phương pháp khử muối tetrazolium (MTT) và phương pháp huỳnh quang Resazurin khử thành Resorufin. Kết quả xác lập Resazurin là chất chỉ thị tối ưu cho các mô hình 3D nhờ khả năng khuếch tán sâu vào lõi tế bào mà không phá hủy cấu trúc ECM.
3. Quy trình tạo hình khối 3D:
   • Hanging drop: Mật độ gieo cấy $2.000\ \text{tế bào/giếng}$ trên đĩa Perfecta3D cho phép hình thành khối cầu đơn lẻ có đường kính đồng nhất sau 48-72 giờ nuôi cấy.
   • Matrigel Matrix: Tế bào đơn được hòa trộn trong dung dịch Matrigel $50-70%$ ở nhiệt độ $4^\circ\text{C}$, gieo vào đĩa 96 giếng và ủ ở $37^\circ\text{C}$ để polymer hóa, tạo khối tế bào hình trăng khuyết có đường kính trung bình $54\ \mu\text{m}$ sau 5 ngày.
4. Kiểm chuẩn độ tin cậy và giá trị: Đánh giá tính toàn vẹn của mô hình qua nhuộm mô học cắt lát H&E, nhuộm Propidium Iodide (PI) để xác định lõi hoại tử, và kiểm chứng dấu ấn apoptosis bằng nhuộm kép Annexin V/PI.

Data và phân tích

Phân tích số liệu thực nghiệm được xử lý bằng các công cụ phần mềm chuyên dụng:

• Xác định $\text{IC}_{50}$: Sử dụng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 8.0 để dựng đường cong hồi quy phi tuyến tính (Non-linear regression analysis - sigmoidal dose-response curve) với độ tin cậy $95%$ CI.
• Phân tích biểu hiện gen: RT-PCR bán định lượng với hệ thống máy UVP BioImaging Systems, đo mật độ quang học (optical density) chuẩn hóa theo gen nội sinh $\beta\text{-actin}$ hoặc GAPDH.
• Phân tích dòng chảy tế bào: Thu thập và phân tích dữ liệu trên phần mềm FlowJo cho các kênh huỳnh quang FITC, PE, PerCP-Cy5.5 và APC.
• Đánh giá tế bào đối chứng lành tính: Luận án thực hiện bước cải tiến phương pháp luận mang tính đột phá khi sử dụng tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ người (Adipose Derived Stem Cells - ADSCs) mang đầy đủ các dấu ấn dương tính ($CD44^{+}, CD73^{+}, CD90^{+}, CD105^{+}$) và âm tính ($CD14^{-}, CD34^{-}, CD45^{-}, \text{HLA-DR}^{-}$), chứng minh khả năng biệt hóa 3 dòng (mỡ, xương, sụn) để thay thế cho dòng nguyên bào sợi da người (Human Fibroblasts - HF) truyền thống trong xác định Chỉ số tác dụng phụ (Selective Effect Index - $\text{SEI} = \text{IC}{50\text{ (tế bào lành)}} / \text{IC}{50\text{ (tế bào ung thư)}}$).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Sự phân kỳ đáp ứng dược lý giữa 2D và 3D: Đối với thuốc kháng phân bào chuẩn Doxorubicin, nồng độ ức chế $\text{IC}{50}$ trên mô hình 3D cao hơn rõ rệt so với 2D ($p < 0,001$) trên cả 4 dòng tế bào khảo sát, chứng minh cấu trúc spheroid tạo ra rào cản vật lý và biến đổi chuyển hóa bảo vệ tế bào ung thư khỏi độc tính hóa trị. Ngược lại, đối với thuốc kích hoạt trong điều kiện thiếu oxy Tirapazamine (TPZ), giá trị $\text{IC}{50}$ ở mô hình 3D lại thấp hơn có ý nghĩa so với mô hình 2D ($p < 0,001$), minh chứng xác thực sự tồn tại của vùng lõi hoại tử thiếu oxy (hypoxic core) bên trong khối spheroid 3D.
2. Tái cấu trúc biểu hiện phân tử bám dính và biểu sinh: Phân tích Flow cytometry cho thấy tế bào nuôi cấy trong mô hình 3D Matrigel có sự gia tăng vượt bậc về biểu hiện của các protein liên kết tế bào - tế bào và tế bào - chất nền ngoại bào gồm Ep-CAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), N-CAM và V-CAM so với nuôi cấy 2D. Đồng thời, RT-PCR chứng minh sự tăng cường phiên mã của các gen điều hòa methyl hóa DNMT1, DNMT3B cùng các gen trong con đường sinh tồn PI3KCA và AKT1.
3. Bảo tồn ưu việt kiểu hình tế bào gốc trong 3D: Tỷ lệ quần thể tế bào mang dấu ấn $CD44^{+}/CD24^{-}$ được duy trì ổn định ở mức cao khi nuôi cấy 3D trong Matrigel, trong khi nuôi cấy 2D lớp đơn dẫn đến hiện tượng biệt hóa tự phát làm suy giảm nhanh chóng tỷ lệ này qua các thế hệ cấy chuyền.
4. Phát hiện hoạt tính tiêu diệt BCSC đột phá từ cao chiết Sao đen (Hopea odorata - E18): Trong tổng số 34 cao chiết thực vật bản địa được sàng lọc, cao chiết Sao đen E18 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh mẽ và chọn lọc cao trên dòng tế bào gốc ung thư vú VN9 $CD44^{+}/CD24^{-}$ trong mô hình 3D. Phân tích tế bào học chứng minh E18 cảm ứng ngừng chu kỳ tế bào tại pha G2/M và kích hoạt quá trình apoptosis phụ thuộc caspase, với tỷ lệ tế bào dương tính với Annexin V/PI tăng vượt trội so với nhóm đối chứng, đồng thời thể hiện chỉ số tác dụng phụ SEI an toàn vượt bậc khi thử nghiệm trên tế bào gốc trung mô ADSCs.

Implications đa chiều

• Tiến bộ lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định tương tác không gian 3D trực tiếp định hình cảnh quan biểu sinh (DNMTs) và trạng thái phosphoryl hóa của trục tín hiệu PI3K/AKT, bổ sung dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho mô hình động học tế bào gốc ung thư vú người châu Á.
• Đổi mới phương pháp luận: Thiết lập bộ quy trình chuẩn hóa từ khâu nuôi cấy giọt treo, đúc khuôn Matrigel đến phương pháp đo Resazurin thông lượng cao, cung cấp nền tảng kỹ thuật có thể chuyển giao cho các phòng thí nghiệm nghiên cứu ung thư và sàng lọc thuốc sinh học.
• Ứng dụng thực tiễn & Dược liệu học: Định danh cây Sao đen (Hopea odorata) như một nguồn dược liệu quý giá chứa các hoạt chất có khả năng triệt tiêu tế bào gốc ung thư vú, định hướng cho các nghiên cứu hóa thực vật chiết tách và tinh sạch hợp chất đơn phân tử tiếp theo.
• Khuyến nghị chính sách y dược: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để các cơ quan quản lý y tế (Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế) ban hành tiêu chuẩn đánh giá tiền lâm sàng mới, khuyến khích bổ sung thử nghiệm 3D spheroid trước khi cấp phép thử nghiệm lâm sàng cho các chế phẩm thuốc mới từ dược liệu.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án nghiêm túc chỉ ra 4 giới hạn nghiên cứu chính:

1. Tính chất phức tạp của khuôn nền Matrigel: Matrigel có nguồn gốc từ sarcoma chuột EHS chứa các yếu tố tăng trưởng và protein ngoại bào chưa được định lượng tuyệt đối giữa các lô sản xuất (batch-to-batch variation), có thể gây ra dao động nhỏ trong đáp ứng nền sinh học.
2. Giới hạn thư viện hoạt chất thô: 34 mẫu thử nghiệm là cao chiết tổng (crude extracts), chưa thực hiện phân đoạn phân lập để định danh chính xác cấu trúc hóa học của các phân tử đơn chất (single compounds) hoạt tính trong cao Sao đen E18.
3. Thiếu vắng tương tác miễn dịch và mạch máu: Mô hình 3D in vitro hiện tại là dạng đơn nuôi cấy/đồng nuôi cấy khối u, chưa tích hợp hoàn chỉnh dòng chảy vi lưu (microfluidics/organ-on-a-chip) cũng như các tế bào miễn dịch (T-cells, macrophages) của vi môi trường u toàn diện.
4. Quy mô mẫu dòng tế bào bản địa: Nghiên cứu tập trung chuyên sâu vào dòng tế bào VN9; cần mở rộng bộ sưu tập dòng tế bào ung thư vú đại diện cho các phân nhóm phân tử khác nhau (Luminal A, Luminal B, HER2-enriched, Triple-Negative) trên bệnh nhân Việt Nam.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Tinh sạch và giải mã cấu trúc phân tử các hoạt chất thứ cấp từ cao chiết Hopea odorata bằng kỹ thuật HPLC-MS/MS và NMR.
• Phát triển hệ thống vi lưu 3D (3D Microfluidic Tumor-on-a-chip) tích hợp dòng chảy mao mạch và tế bào nội mô mạch máu (HUVECs).
• Thực hiện kiểm chứng in vivo hiệu quả tiêu diệt khối u và ức chế di căn của cao chiết Sao đen trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch NOD/SCID mang khối u ghép từ bệnh nhân (Patient-Derived Xenograft - PDX).
• Ứng dụng giải trình tự RNA đơn tế bào (scRNA-seq) để lập bản đồ biến đổi phiên mã chi tiết của quần thể $CD44^{+}/CD24^{-}$ dưới tác động của các hợp chất tự nhiên.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra những tác động lan tỏa sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Tác động học thuật: Định hình chuẩn mực nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh lý học và tế bào gốc tại Việt Nam; mở ra tiềm năng công bố trên các tạp chí quốc tế chuyên ngành (Q1/Q2) thuộc hệ thống ISI/Scopus với kỳ vọng trích dẫn cao trong các phân tích tổng quan về mô hình 3D và BCSC.
• Chuyển đổi công nghiệp Dược: Cung cấp công cụ sàng lọc tin cậy cho các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm, giúp rút ngắn thời gian phát triển thuốc, tiết kiệm hàng triệu USD chi phí sàng lọc rác (false positives/false negatives) từ các mô hình 2D truyền thống.
• Tối ưu hóa nguồn tài nguyên bản địa: Nâng tầm giá trị nguồn dược liệu phong phú của Việt Nam, chuyển đổi từ kinh nghiệm sử dụng dân gian sang y học chứng cứ phân tử hiện đại.
• Lợi ích xã hội: Đặt nền móng cho các liệu pháp nhắm trúng đích tế bào gốc ung thư, hướng tới mục tiêu giảm thiểu tỷ lệ tái phát và di căn, nâng cao chất lượng cuộc sống và tỷ lệ sống sót sau 5 năm cho bệnh nhân ung thư vú.

Đối tượng hưởng lợi

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh sự điều biến biểu sinh qua trục DNMT1/DNMT3B và kích hoạt con đường sinh tồn PI3K/AKT phụ thuộc hoàn toàn vào cấu trúc không gian 3 chiều của tế bào. Kết quả này mở rộng trực tiếp Thuyết Tế bào gốc ung thư (Al-Hajj et al., 2003) và Thuyết Biểu sinh trong ung thư (Robertson, 2005), chỉ ra rằng tính kháng hóa trị liệu của BCSC không chỉ là thuộc tính nội tại của kiểu hình gen mà là hệ quả thích ứng động của tế bào trong vi môi trường 3D đa tầng.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án thể hiện thế nào khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Kelm và cộng sự (2003) vốn sử dụng giọt treo thủ công thể tích nhỏ dễ bay hơi, luận án đã chuẩn hóa trên đĩa vi giọt Perfecta3D 96 giếng kết hợp hệ thống khay giữ ẩm, cho phép thay môi trường định kỳ và tương thích với sàng lọc thông lượng cao HTS. So với phương pháp tráng phủ Poly-HEMA của Ivascu & Kubbies (2006), luận án đã thiết lập thành công mô hình nhúng khung nền Matrigel $50-70%$ giúp tái lập toàn vẹn mạng lưới tín hiệu bám dính tế bào - ECM (Ep-CAM, V-CAM, N-CAM). Đồng thời, luận án tiên phong sử dụng tế bào gốc trung mô ADSCs người thay cho dòng nguyên bào sợi HF để thiết lập chuẩn đánh giá chỉ số an toàn sinh học SEI.

3. Phát hiện nào bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm và giải thích cơ chế phân tử?

Phát hiện bất ngờ nhất là sự đảo chiều đáp ứng dược lý đối với Tirapazamine (TPZ): trong khi tế bào 3D kháng mạnh Doxorubicin ($\text{IC}{50}$ tăng vọt so với 2D), chúng lại trở nên cực kỳ nhạy cảm với TPZ ($\text{IC}{50}$ giảm sâu so với 2D, $p < 0,001$). Cơ chế được giải thích do TPZ là tiền chất kích hoạt sinh học (bioreductive prodrug) chuyên biệt trong điều kiện yếm khí; cấu trúc spheroid 3D tạo ra vùng lõi thiếu oxy nghiêm trọng ở trung tâm, tạo môi trường lý tưởng để TPZ chuyển hóa thành gốc tự do độc phá hủy chọn lọc DNA tế bào ung thư ở lõi.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản (replication protocol) chi tiết không?

Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số kỹ thuật cho phép tái lập hoàn toàn: nồng độ kháng thể hạt từ tính MACS, mật độ gieo cấy tối ưu ($2.000\ \text{tế bào/giếng}$ cho đĩa 96 giếng), nồng độ Resazurin ($0,01\ \text{mg/mL}$ với thời gian ủ 4 giờ), chu trình nhiệt và trình tự mồi RT-PCR cho 6 gen mục tiêu (DNMT1, DNMT3B, BRCA1, p53, PI3KCA, AKT1), cùng công thức toán học tính toán chỉ số $\text{IC}_{50}$ và $\text{SEI}$.

5. Luận án phác thảo chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo như thế nào?

Chương trình nghiên cứu dài hạn tập trung vào 3 trụ cột: (1) Chiết tách phân đoạn, định danh cấu trúc và bán tổng hợp dẫn xuất các hợp chất tinh khiết từ Hopea odorata; (2) Chế tạo chip vi lưu đa cơ quan (Multi-organ Tumor-on-a-chip) kết hợp công nghệ in sinh học 3D (3D Bioprinting) với tế bào bệnh nhân Việt Nam; (3) Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình chuột nhân hóa PDX tiến tới đăng ký thử nghiệm lâm sàng (Phase I/II) cho sản phẩm thuốc mới hỗ trợ điều trị ung thư vú tái phát và kháng thuốc.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Phan Lữ Chính Nhân là một công trình nghiên cứu khoa học công phu, nghiêm túc và có hàm lượng học thuật xuất sắc, thể hiện qua 5 đóng góp cốt lõi:

1. Phân lập, làm giàu và chuẩn hóa thành công dòng tế bào gốc ung thư vú bản địa người Việt Nam VN9 $CD44^{+}/CD24^{-}$ mang đầy đủ các đặc tính tự làm mới, tạo mamosphere và biểu hiện mức độ cao của transporter kháng thuốc ABCG2.
2. Thiết lập và chuẩn hóa hoàn chỉnh hệ thống nuôi cấy 3D song song (Hanging Drop và Matrigel Matrix), chứng minh tính ưu việt tuyệt đối của mô hình 3D trong việc tái lập vi môi trường u, phân bố bám dính tế bào và mô phỏng chính xác đáp ứng dược lý in vivo so với nuôi cấy 2D cổ điển.
3. Làm sáng tỏ cơ chế sinh học phân tử và biểu sinh liên quan đến sự đề kháng hóa trị liệu trong không gian 3D thông qua sự biến đổi phiên mã của hệ enzyme DNMT1, DNMT3B và con đường tín hiệu PI3K/AKT.
4. Tiên phong ứng dụng tế bào gốc trung mô ADSCs người làm chuẩn đối chứng tế bào lành để xác định chỉ số độc tính chọn lọc SEI, nâng cao độ chính xác và tính nhân văn trong thử nghiệm độc chất học.
5. Sàng lọc toàn diện thư viện 34 cao chiết thực vật bản địa, phát hiện tiềm năng chống ung thư đột phá của cây Sao đen (Hopea odorata - E18) với khả năng gây độc chọn lọc trên tế bào gốc ung thư vú thông qua cơ chế dừng chu kỳ tế bào tại pha G2/M và cảm ứng apoptosis.

Công trình không chỉ nâng tầm vị thế của nghiên cứu y sinh học thực nghiệm Việt Nam trên bản đồ khoa học quốc tế mà còn mở ra hướng đi đầy triển vọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới nhắm trúng đích từ nguồn tài nguyên dược liệu quý báu của quốc gia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tong quan về ung thư vú Theo thống kê ung thư toàn cầu năm 2018, GLOBOCAN ước tính ung thư vú chiếm 11,6% tỷ lệ các ca mắc bệnh ung thư gây tử vong, xếp thứ hai sau ung thư phối. Trên toàn thế giới, có khoảng 2.1 triệu trường hợp ung thư vú ở nữ mới được chan đoán vào năm 2018 [13]. Tại Mỹ, khoảng 266.120 phụ nữ mắc ung thư vú vào năm 2018 và 63.960 mắc ung thư vú di căn.

Theo Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, tỷ lệ ung thư vú ở phụ nữ từ các nhóm chủng tộc và sắc tộc khác nhau như sau: tỷ lệ tử vong đo ung thư vú đã giảm trong 25 năm qua ở Bắc Mỹ và một số khu vực ở châu Âu. Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia châu Phi và châu Á, tỷ lệ tử vong do ung thư vú đang tăng lên. Tỷ lệ mắc ung thư vú tăng theo tuổi, từ 1,5/100.000 ở phụ nữ từ 20 đến 24 tuổi lên đến đỉnh điểm là 421,3/100.000 ở phụ nữ từ 75 đến 79 tuổi; 95% trường hợp mới xảy ra ở phụ nữ từ 40 tuôi trở lên. Độ tuổi trung bình của phụ nữ tại thời điểm chân đoán ung thư vú là 61 tuổi [108].

Riêng tại Việt Nam, ung thư vú là bệnh phổ biến nhất ở phụ nữ và ngày càng tăng cao. Cụ thé, năm 2013, tỉ lệ mắc ở mức 24,4/100.000 phụ nữ, đến năm 2018 đã tăng lên tới 26,2 tương đương 15.000 ca mắc mới, trong đó có hơn 6.000 ca tử vong.000 người phụ nữ Việt Nam người mắc ung thư vú có 10.5 người tử vong tương đương [12]. So với năm 2013, tuy số người mắc mới mỗi năm tăng hơn, nhưng số lượng người tử vong do ung thư vú đã giảm (cứ 100.000 người có 23 người tử vong vào 2013 thì đến nay chỉ 10,5 người tử vong vào 2018). Tỉ lệ mắc mới ung thư vú của Việt Nam đang xếp 146/185 quốc gia, vùng lãnh thô khảo sát, tỉ lệ tử vong ở mức 10,5/100.

Phéi 2 093 876 (11,6%) Vú 2 088 849 (11,6%) ' Trực tràng Ung thư khác 1 849 518 (10,2%) 9 736 907 (53,9%) Tuyến tiền liệt 1276 106 (7,1%) Tổng: 18 078 957 Hình 1. Số liệu các ca mắc ung thư toàn cầu năm 2018 1. Sinh học tế bào ung thư vú a. Định nghĩa ung thư vú Ung thư vú là ung thư phát triển từ mô vú, trong đó các tế bào ác tính hình thành trong các mô của vú.

TẾ bao ung thư xâm lấn sang các mô vú khoẻ mạnh lân cận rồi từ đó lan đến các hạch bạch huyết dưới nách. Ung thư vú thường phát triển nhiều nhất trong các tế bào từ lớp lót của ống dẫn sữa, được gọi là ung thư biểu mô ống và các tiểu thùy được gọi là ung thư biểu mô thuỳ [125]. Trong các nguyên nhân chính gây ung thư vú, yếu tố di truyền, bao gồm tiền sử cá nhân hoặc gia đình mắc ung thư vú thường mắc các đột biến di truyền (BRCAI , BRCA2 và các gen liên quan đến với ung thư vú khác), chiếm từ 5% đến 10% các trường hợp mắc ung thư vú [27]. Các yếu tổ nguy cơ sinh sản như bắt đầu của kinh nguyệt trước 12 tuổi, sinh con đầu tiên sau 30 tudi, vô sinh và mãn kinh sau 55 tuổi.

Ngoài ra còn các yếu tố khác do độ tuổi, giới tính, lỗi sống hay lạm dụng sử dụng các hormone như estrogen và progesterone, với hai trường hợp phổ biến nhất là tránh thai ở phụ nữ tiền mãn kinh và liệu pháp thay thế hormone ở phụ nữ sau mãn kinh [108] Tế bảo tiểu thùy Tế bảo tiêu quản Các tiêu quan Các tiểu thùy Quang vú Núm vú b. Phân loại ung thư vú Phương pháp phân loại ung thư vú truyền thống dựa trên khả năng xâm lấn được tham khảo theo tài liệu của Tổ chức Y tế Thế giới đã được chỉnh sửa lần 4 [125]. Xâm lan: Các tê bao ung thư vượt ra khỏi vi trí ban đầu và lan đến các mô xung quanh và có thể đi căn đến hạch bạch huyết và các bộ phận cơ thể khác, gồm: - Ung thư biéu mô ống dẫn sữa xâm lan (Invasive Ductal Carcinoma — IDC) Đây là loại phố biến nhất trong tổng số các ca mắc ung thư vú, chiếm 50-75% các ca ung thư vú xâm lan. Chúng bắt đầu từ ống dẫn sữa và lan đến các mô xung quanh.

Khối u thường có dang hình sao bat thường. - Ung thư biểu mô tiểu thuỳ xâm lắn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC) Chiém 5-15% các ca ung thư vú xâm lấn. Khối u bắt đầu bên trong các tiêu thuỳ hoặc thuỳ và di căn đến các bộ phận khác của cơ thé. Khối u có kết cau bình thường, phần bên ngoài của bầu vú khá cứng hoặc cứng.

Khối u thường biểu hiện dương tính với thụ thé estrogen và progesteron. - Ung thư biểu mô dang ống (Tubular Carcinoma) Là một nhánh nhỏ của IDC, chiếm 1-5% các ca ung thư vú xâm lan. Khối u thường rất nhỏ và các tế bào ung thư tạo thành các cấu trúc dạng ống. Khối u thường biểu hiện dương tính với thụ thé estrogen và biểu hiện âm tính với thụ thé yếu tố tăng trưởng biểu mô tuyến vú HER2.

- Ung thư biểu mô dịch nhay (Mucinous Carcinoma) Là một nhánh nhỏ của IDC, chiếm 1-5% các ca ung thư vú xâm lan. Phổ biến hơn ở phụ nữ lớn tuổi. Khối u mềm và hiếm khi di căn đến các hạch bạch huyết. Các tế bao được bao bọc bởi một lượng lớn chất nhay.

Chất nhày và tế bao ung thư kết hợp với nhau tạo thành khối u giống như thạch. - Ung thư biểu mô dang tuy (Medullary Carcinoma) La một nhánh nhỏ của IDC, chiếm <1% các ca ung thư vú xâm lắn, phổ biến ở các phụ nữ trung niên. Dạng này có khối u mềm và các mô tế bào giống như tuỷ của não bộ. - Ung thư biểu mô dạng nha (Papillary Carcinoma) Phổ biến ở các phụ nữ sau mãn kinh.

Có hình thái nhú, nhưng mặt khác không có các đặc điểm lâm sảng, di truyền hoặc tiên lượng. Không xâm lan: các tế bao ung thư không lan đến các mô xung quanh mà chỉ tập trung tại vị trí ban đầu, gồm có: - Ung thư biểu mô ống dẫn sữa tại chỗ (Ductal Carcinoma In-Situ - DCIS) Là một dạng ung thư biểu mô không xâm lấn thường gặp, có thé trở thành dạng ung thư xâm lan. Nguy cơ tái mắc bệnh là dưới 30%. - Ung thư biểu mô tiêu thuỳ tại chỗ (Lobular Carcinoma In-Situ - LCIS) Là dạng u lành tính không triệu chứng và không phát hiện được trong ảnh chụp X-quang.

Thường được phát hiện ở phụ nữ trước mãn kinh, 40-50 tuổi. Cơ sở phân tử của ung thư vú a. Vai tro cua gen p53 al. Khai quat P53 là một trong những gen thường có sự mat chức năng trong nhiều loại ung thư, hơn một nửa trường hợp các bệnh ung thư thì có sự mất biểu hiện của P53.

P53 không hoạt động trong tế bào khi không có sự hư hại DNA. Khi có sự ton hại DNA p53 sẽ dừng chu ki tế bào đến khi được sửa chữa, nếu p53 không thực hiện được chức năng thì chu trình tế bào vẫn tiếp tục với những sai hỏng và tạo ra nhiều sai hỏng DNA hơn nữa, dẫn đến không kiểm soát được chu trình tế bào và có thể hình thành ung thư, nhiều nghiên cứu công bồ liên quan giữa ung thư vú và sự bất hoạt hoặc đột biến p53 đã được báo cáo [28]. Chức năng Như một tác nhân ức chế khối u, p53 cần thiết trong việc ngăn chặn sự tăng sinh không phù hợp của tế bao và duy trì tính toàn vẹn của bộ gen sau stress genotoxic. Theo sau các kích thích nội bao và ngoại bào khác nhau: chang hạn như tổn thương DNA, biểu hiện vượt mức các oncogene, ø5 3 được hoạt hoá và trở thành protein điều hòa gây ra những thay đổi sinh học khác nhau, ở cả 2 cấp độ tế bào đơn cũng như trong toàn bộ cơ thê [156].

P53 đáp ứng với những hư hại DNA bằng cách dừng chu trình tế bào dé cho tế báo có khả năng sửa chữa những hư hỏng hoặc cảm ứng gây apoptosis khi những hư hỏng không sữa chữa được, trên tế bào ung thư vú, nhiều thuốc được phát triển dựa trên nguyên tắc này [128]. Điều hoà chu kỳ tế bào Khả năng của p53 có thé ngăn sự phát triển tế bào là mau chốt quan trọng cho chức năng ức chế khối u. p53 có thé bắt giữ tế bào trong pha G1, S và G2 của chu kỳ tế bào. P53 cảm ứng ngừng chu kỳ tế bào tại G1 và G2 và nó cung cấp thêm thời gian dé cho các tế bao sửa chữa những hư hại di truyền trước khi vào giai đoạn tông hợp DNA và phân bào.

Một trong những mục tiêu hạ nguồn - down stream chính của p53 là tác nhân ức chế cyclin phụ thuộc kinase (CDK) p21. p21 là một tác nhân điều hoa chính việc ngừng chu kỳ tế bào phụ thuộc p53 ở pha G1 diễn ra sau khi tổn thương DNA. Dé đáp ứng với stress tế bào, p53 điều hòa tăng nồng độ p21 nội sinh. Sự biểu hiện vượt mức của p21 bắt giữ tế bào ở G1 bằng cách ngăn phức hợp cyclin E/CDK2- mediated phosphoryl hóa Rb và phóng thích E2F (E2F có chức năng giúp biéu hiện những gen cần thiết cho tế bào đi vào pha S) [156].

Ngược lại, khi p21 bị ức chế, phức hợp cyclinE/CDK2 phosphoryl hóa protein Rb thành dạng hyperphosphoryl Rb, dạng này rời khỏi phức hợp với E2F, E2F được giải phóng sẽ cho phép tế bào tiếp tục chu trình đi vào pha S [22]. Cảm ứng quá trình apoptosis Với chức năng là một protein gác công (gatekeeper), p53 có vai trò theo đõi stress tế bào và gây chết tế bào nếu cần thiết. Trong các mô nếu tác nhân stress gây hư hỏng nghiêm trọng và không thé phục hồi các hư hai, p53 có thé cảm ứng dé bắt dau quá trình apoptosis, để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng. Kha năng của p53 dé tạo ra quá trình apoptosis dường như tương quan với khả năng ngăn chặn những biến đôi ác tính.

Những kết qua này cho thấy việc quy định quá trình apoptosis là một chức năng trong việc ức chế khối u cũng như sự tiến hóa của p53. Những sản phẩm gen gây ra apoptotic bởi p53 bao gồm Bax (Bel-2 liên kết với protein X), DR5/KILLER (death receptor 5), DRAL, Fas/CD95 (thụ thể tín hiệu chết tế bào), PIG3 (cảm ứng gen p53), Puma (tác nhân điều chỉnh điều hòa tăng P53 của quá trình apoptosis), Noxa, pidd, PERP, Apaf-1 (yếu tố hoạt hoá protease- apoptosis 1), Scotin, pS3AIP1, và một số yếu tố khác.