Nghiên Cứu Mô Hình Nuôi Tế Bào 2D, 3D Để Sàng Lọc Cao Chiết Thực Vật Có Độc Tính Trên Tế Bào Ung Thư Vú

• Tác giả: Phan Lữ Chính Nhân
• Người hướng dẫn: GS. Trương Đình Kiệt
• Trường học: Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Mô Hình Nuôi Tế Bào 2D, 3D Để Sàng Lọc Cao Chiết Thực Vật Có Độc Tính Trên Tế Bào Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về ung thư Vú
• 1.2. Sinh học tế bào ung thư Vú
• 1.3. Cơ sở phân tử của ung thư Vú. Tế bào gốc ung thư Vú
• 1.4. Phân lập và marker phân tử. Những đặc tính quan trọng của tế bào gốc ung thư vú
• 1.5. Nuôi cấy tế bào ung thư dùng trong sàng lọc thuốc. Nuôi tế bào lớp đơn (nuôi 2D)
• 1.6. Nhu cầu nuôi khối tế bào 3 chiều (nuôi 3D). Ưu điểm của mô hình nuôi tế bào 3D dùng trong sàng lọc thuốc
• 1.7. Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D. Sự biểu hiện các protein kết nối tế bào – tế bào, tế bào và chất nền ngoại bào khi nuôi cấy 3D
• 1.8. Sàng lọc thuốc trong nghiên cứu điều trị ung thư. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.9. Các liệu pháp điều trị ung thư chính dựa vào hợp chất thiên nhiên. Lý do cho sự cần thiết nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú ở dạng 3D cho sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào
• 1.10. Vật liệu - Phương pháp. Sơ đồ các nội dung trong nghiên cứu trong luận án
• 1.11. Đối tượng thí nghiệm. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các phương pháp nuôi, phân lập tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam
• 2.2. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng dòng chảy
• 2.3. Các phương pháp dùng trong thiết lập mô hình nuôi 2D, 3D
• 2.4. Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng MTT
• 2.5. Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng Resazurin
• 2.6. Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng và thời gian nhân đôi của dòng tế bào
• 2.7. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose
• 2.8. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa giọt treo
• 2.9. Phương pháp đánh giá lõi hoại tử
• 2.10. Phương pháp nuôi cấy trong chất nền matrigel
• 2.11. Phương pháp RT-PCR
• 2.12. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
• 2.13. Các phương pháp khác
• 2.14. Phương pháp thể hiện số liệu bằng màu
• 2.15. Phương pháp phân tích quần thể apoptosis
• 2.16. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24-, khảo sát sự tăng trưởng, khả năng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2
• 3.2. Thiết lập mô hình nuôi 2D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin
• 3.3. Thiết lập mô hình nuôi 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin và Tirapazamine
• 3.4. Quy trình thử chất kháng phân bào trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú nuôi 3D
• 3.5. So sánh biểu hiện một số gen, tỷ lệ quần thể tế bào CD44+/CD24- trong mô hình nuôi 2D và mô hình nuôi 3D dùng matrigel
• 3.6. Đề xuất việc chọn mô hình nuôi 2D hoặc nuôi 3D dùng trong sàng lọc hợp chất có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú
• 3.7. Ứng dụng mô hình nuôi 2D, 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú trong sàng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Mô Hình Nuôi Cấy Tế Bào Ung Thư Vú

Nghiên cứu mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D mở ra hướng đi mới trong sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là cao chiết thực vật có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú. Mô hình in vitro này cho phép đánh giá độc tính tế bào một cách hiệu quả, từ đó xác định các ứng viên tiềm năng cho liệu pháp điều trị ung thư. Việc so sánh giữa nuôi cấy tế bào 2D và 3D giúp làm sáng tỏ những khác biệt về đáp ứng thuốc và cơ chế tác động của các hợp chất. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa các mô hình nuôi cấy, đồng thời ứng dụng chúng để sàng lọc cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú.

1.1. Tầm quan trọng của mô hình in vitro trong nghiên cứu ung thư

Mô hình in vitro, bao gồm nuôi cấy tế bào 2D và 3D, đóng vai trò then chốt trong nghiên cứu ung thư. Chúng cung cấp một hệ thống đơn giản hóa để nghiên cứu các quá trình sinh học phức tạp và đánh giá hiệu quả của các liệu pháp điều trị tiềm năng. So với mô hình in vivo, mô hình in vitro có ưu điểm về chi phí thấp, thời gian thực hiện ngắn và khả năng kiểm soát các yếu tố môi trường tốt hơn. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất và xác định các ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu sâu hơn. Theo nghiên cứu, mô hình in vitro giúp giảm thiểu số lượng thí nghiệm trên động vật, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế tác động của thuốc.

1.2. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào 3D so với nuôi cấy tế bào 2D

Nuôi cấy tế bào 3D mang lại nhiều ưu điểm so với nuôi cấy tế bào 2D truyền thống. Mô hình 3D tái tạo cấu trúc và chức năng của mô ung thư in vivo một cách chân thực hơn, bao gồm sự tương tác giữa các tế bào, sự hình thành gradient oxy và chất dinh dưỡng, và sự biểu hiện của các protein liên kết tế bào. Điều này dẫn đến sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa hai mô hình, với tế bào ung thư trong mô hình 3D thường kháng thuốc hơn so với tế bào trong mô hình 2D. Do đó, nuôi cấy tế bào 3D được coi là một công cụ sàng lọc thuốc hiệu quả hơn, giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong môi trường phức tạp hơn.

II. Thách Thức Trong Sàng Lọc Độc Tính Cao Chiết Thực Vật

Việc sàng lọc cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú đối mặt với nhiều thách thức. Sự phức tạp của thành phần hóa học trong cao chiết gây khó khăn cho việc xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hơn nữa, sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú đòi hỏi việc sử dụng các mô hình sàng lọc phù hợp. Việc đánh giá độc tính một cách chính xác và toàn diện, bao gồm cả ảnh hưởng đến chu trình tế bào, apoptosis, và sự hình thành khối u, là rất quan trọng. Nghiên cứu này tập trung vào việc giải quyết những thách thức này bằng cách phát triển các quy trình sàng lọc hiệu quả và sử dụng các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D phù hợp.

2.1. Sự phức tạp của thành phần hóa học trong cao chiết thực vật

Cao chiết thực vật chứa một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất hóa học, bao gồm các hợp chất có hoạt tính sinh học và các hợp chất trơ. Sự phức tạp này gây khó khăn cho việc xác định các hợp chất chịu trách nhiệm cho độc tính quan sát được. Việc phân lập và xác định các hợp chất hoạt tính đòi hỏi các kỹ thuật phân tích phức tạp và tốn kém. Hơn nữa, các hợp chất khác nhau trong cao chiết có thể tương tác với nhau, dẫn đến các hiệu ứng hiệp đồng hoặc đối kháng, làm phức tạp thêm quá trình đánh giá độc tính.

2.2. Đánh giá độc tính toàn diện trên tế bào ung thư vú

Việc đánh giá độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú cần được thực hiện một cách toàn diện, bao gồm cả ảnh hưởng đến chu trình tế bào, apoptosis, và sự hình thành khối u. Các xét nghiệm như MTT assay và Resazurin assay có thể được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Phân tích chu trình tế bào và apoptosis giúp xác định cơ chế tác động của các hợp chất. Nghiên cứu cũng cần đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng di căn và xâm lấn của tế bào ung thư.

III. Phương Pháp Nuôi Cấy Tế Bào 2D 3D Để Sàng Lọc Độc Tính

Nghiên cứu này sử dụng cả phương pháp nuôi cấy tế bào 2D và 3D để sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú. Nuôi cấy tế bào 2D được sử dụng để sàng lọc ban đầu do tính đơn giản và chi phí thấp. Nuôi cấy tế bào 3D được sử dụng để xác nhận kết quả và đánh giá độc tính trong môi trường phức tạp hơn. Các phương pháp nuôi cấy 3D được sử dụng bao gồm nuôi cấy trên đĩa giọt treo, nuôi cấy trong chất nền matrigel, và nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose. Các phương pháp này cho phép tế bào ung thư hình thành khối u, tái tạo cấu trúc và chức năng của mô ung thư in vivo.

3.1. Quy trình nuôi cấy tế bào 2D và đánh giá độc tính bằng MTT

Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D được thực hiện bằng cách cấy tế bào ung thư vú trong môi trường dinh dưỡng phù hợp trên đĩa petri. Sau khi tế bào bám dính và phát triển, cao chiết thực vật được thêm vào môi trường. Sau một thời gian ủ nhất định, khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng MTT assay. MTT assay dựa trên khả năng của tế bào sống để khử muối tetrazolium thành formazan, một sản phẩm có màu. Lượng formazan được đo bằng quang phổ kế, và tỷ lệ sống sót của tế bào được tính toán.

3.2. Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và đánh giá độc tính

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp nuôi cấy tế bào 3D, bao gồm nuôi cấy trên đĩa giọt treo, nuôi cấy trong chất nền matrigel, và nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose. Trong nuôi cấy trên đĩa giọt treo, tế bào được cấy trong các giọt môi trường nhỏ và lơ lửng. Trong nuôi cấy trong chất nền matrigel, tế bào được cấy trong một chất nền protein phức tạp, tái tạo môi trường ngoại bào. Trong nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose, tế bào được cấy trên một lớp agarose, ngăn chặn sự bám dính của tế bào vào đĩa. Sau khi tế bào hình thành khối u, cao chiết thực vật được thêm vào môi trường, và độc tính được đánh giá bằng các phương pháp như MTT assay, Resazurin assay, và phân tích apoptosis.

IV. Ứng Dụng Mô Hình 2D 3D Sàng Lọc Cao Chiết Thực Vật

Các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D được sử dụng để sàng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật trên các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Kết quả cho thấy một số cao chiết có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư, với IC50 thấp. Sự khác biệt về độc tính giữa các cao chiết và giữa các dòng tế bào được quan sát. Một số cao chiết có độc tính chọn lọc trên tế bào gốc ung thư vú, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào tế bào gốc ung thư.

4.1. Phân tích IC50 của cao chiết thực vật trên các dòng tế bào

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) được xác định cho mỗi cao chiết thực vật trên các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú trong cả mô hình nuôi cấy 2D và 3D. Giá trị IC50 cho phép so sánh độc tính của các cao chiết khác nhau và xác định các cao chiết có hoạt tính mạnh nhất. Sự khác biệt về giá trị IC50 giữa các dòng tế bào cho thấy sự khác biệt về độ nhạy cảm với các cao chiết.

4.2. Đánh giá tiềm năng sử dụng cao chiết cây Sao đen Hopea odorata

Một trong những cao chiết thực vật được nghiên cứu là cao chiết từ cây Sao đen (Hopea odorata). Kết quả cho thấy cao chiết này có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và cơ chế tác động của cao chiết cây Sao đen có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

V. So Sánh Mô Hình Nuôi 2D và 3D Trong Sàng Lọc Độc Tính

Nghiên cứu so sánh hiệu quả của mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D trong việc sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật. Kết quả cho thấy mô hình nuôi cấy 3D có khả năng tái tạo môi trường in vivo tốt hơn, dẫn đến sự khác biệt về đáp ứng thuốc so với mô hình nuôi cấy 2D. Tế bào ung thư trong mô hình 3D thường kháng thuốc hơn so với tế bào trong mô hình 2D. Do đó, mô hình nuôi cấy 3D được coi là một công cụ sàng lọc thuốc hiệu quả hơn, giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong môi trường phức tạp hơn.

5.1. Sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa mô hình 2D và 3D

Sự khác biệt về đáp ứng thuốc giữa mô hình nuôi cấy 2D và 3D có thể là do sự khác biệt về cấu trúc tế bào, sự tương tác giữa các tế bào, và sự biểu hiện của các protein liên kết tế bào. Trong mô hình 3D, tế bào ung thư hình thành khối u, tạo ra gradient oxy và chất dinh dưỡng, và biểu hiện các protein liên kết tế bào. Những yếu tố này có thể ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của thuốc và cơ chế tác động của thuốc.

5.2. Đề xuất lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc

Việc lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc độc tính phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu. Mô hình nuôi cấy 2D phù hợp cho sàng lọc ban đầu do tính đơn giản và chi phí thấp. Mô hình nuôi cấy 3D phù hợp cho xác nhận kết quả và đánh giá độc tính trong môi trường phức tạp hơn. Nghiên cứu cũng cần xem xét sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các dòng tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú để lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Mô Hình Nuôi Tế Bào

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng và ứng dụng các mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D để sàng lọc độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú. Kết quả cho thấy các mô hình nuôi cấy này là công cụ hữu ích để xác định các hợp chất có tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Hướng nghiên cứu trong tương lai bao gồm việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các cao chiết có hoạt tính, và phát triển các mô hình nuôi cấy phức tạp hơn, tái tạo môi trường in vivo một cách chân thực hơn.

6.1. Tóm tắt kết quả chính và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xác định một số cao chiết thực vật có độc tính đáng kể trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Nghiên cứu cũng đã so sánh hiệu quả của mô hình nuôi cấy tế bào 2D và 3D trong việc sàng lọc độc tính, và đề xuất lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp cho sàng lọc. Kết quả của nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và tiềm năng ứng dụng

Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các cao chiết có hoạt tính, và phát triển các mô hình nuôi cấy phức tạp hơn, tái tạo môi trường in vivo một cách chân thực hơn. Nghiên cứu cũng có thể tập trung vào việc phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào tế bào gốc ung thư, và đánh giá hiệu quả của các liệu pháp này trong các mô hình nuôi cấy và in vivo.