Nghiên cứu biểu hiện gen gmdreb6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

Luận án tiến sĩ nghiên cứu gen gmdreb6 nhằm cải thiện khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen, góp phần nâng cao năng suất nông nghiệp.

Trường đại học

Đại học Thái Nguyên

Chuyên ngành

Di truyền học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

luận án tiến sĩ

2021

142
1
0

Phí lưu trữ

35 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN, CHỊU MẶN

1.1. Cây đậu tương

1.2. Đặc tính chống chịu hạn, mặn của cây đậu tương

1.3. Tác động của hạn và cơ chế phân tử của tính chịu hạn

1.4. Tác động của mặn và cơ chế chịu mặn ở cây đậu tương

1.5. Nhân tố phiên mã DREB ở thực vật và cây đậu tương

1.5.1. Đặc điểm của phân họ DREB ở thực vật và cây đậu tương

1.5.2. Vai trò của DREB trong việc điều chỉnh phản ứng với stress phi sinh học ở thực vật

1.5.3. Khả năng chống chịu stress thông qua việc biểu hiện mạnh nhân tố phiên mã DREB

1.6. Kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu cải thiện đặc tính chống chịu của cây đậu tương

1.6.1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua A

1.6.2. Nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm phương pháp phân tích phân họ gen DREB ở cây đậu tương

2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật và phân tích hoạt động của vector biểu hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá

2.3.3. Nhóm phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen

2.3.4. Nhóm phương pháp chuyển gen GmDREB6 vào cây đậu tương

2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu

2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm và sự phát sinh của phân họ gen DREB ở cây đậu tương

3.1.1. Kết quả xác định các gen trong phân họ gen DREB ở cây đậu tương

3.1.2. Sự phát sinh của các thành viên trong phân họ gen GmDREB ở cây đậu tương

3.1.3. Cây phát sinh miền AP2 ở đậu tương

3.2. Thiết kế vector chuyển gen GmDREB6 và phân tích hoạt động của vector trên cây thuốc lá

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB6

3.2.2. Biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB6 vào mô cây thuốc lá

3.2.3. Phân tích sự biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen bằng Real time qRT-PCR

3.3. Xử lý mặn các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây WT

3.3.1. Phân tích mức độ biểu hiện của các gen GmDREB6, NtP5CS và NtCLC phản ứng với stress mặn ở các dòng thuốc lá chuyển gen

3.3.2. Thảo luận kết quả biểu hiện gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC ở các dòng thuốc lá chuyển gen

3.4. Biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 thông qua Agrobacterium tumefaciens ở giống đậu tương ĐT22

3.4.1. Biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen GmDREB6 từ giống đậu tương ĐT22

3.4.2. Phân tích sự hiện diện và sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 trên cây đậu tương chuyển gen

3.4.3. Thảo luận kết quả chuyển gen GmDREB6 ở cây đậu tương

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

PHỤ LỤC 1: DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN GmDREB VÀ PROTEIN THUỘC PHÂN HỌ DREB CỦA ĐẬU TƯƠNG SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Giới thiệu về gen GmDREB6

Gen GmDREB6 là một thành viên quan trọng trong phân họ gen DREB, có vai trò quyết định trong khả năng chống chịu mặn của cây đậu tương. Nghiên cứu cho thấy, gen này có khả năng điều chỉnh biểu hiện của các gen khác liên quan đến khả năng chịu mặn, như NtP5CS và NtCLC. Việc hiểu rõ về gen GmDREB6 sẽ giúp phát triển các giống đậu tương có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

1.1. Đặc điểm của gen GmDREB6

Gen GmDREB6 nằm trên nhiễm sắc thể số 5 của cây đậu tương và có 8 bản sao trong hệ gen. Miền AP2 của gen này chứa 59-60 amino acid, cho thấy sự tương đồng với các gen DREB khác. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, gen này có khả năng kích hoạt các gen chịu mặn khác, từ đó nâng cao khả năng chống chịu của cây trong điều kiện stress mặn.

II. Cải thiện khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

Nghiên cứu về cải thiện khả năng chịu mặn thông qua việc chuyển gen GmDREB6 vào cây đậu tương đã cho thấy những kết quả khả quan. Việc chuyển gen này không chỉ giúp cây đậu tương tăng cường khả năng chịu mặn mà còn cải thiện năng suất và chất lượng hạt. Các thí nghiệm cho thấy, cây chuyển gen có khả năng sinh trưởng tốt hơn trong điều kiện mặn so với cây không chuyển gen.

2.1. Phương pháp chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen được thực hiện thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, cho phép gen GmDREB6 được đưa vào cây đậu tương ĐT22. Quá trình này bao gồm các bước như lây nhiễm, tái sinh đa chồi và tạo cây chuyển gen. Kết quả cho thấy, có nhiều cây chuyển gen dương tính với PCR, chứng minh sự thành công của quá trình chuyển gen.

III. Đánh giá hiệu quả của gen GmDREB6

Đánh giá hiệu quả của gen GmDREB6 cho thấy sự gia tăng đáng kể trong mức độ biểu hiện của các gen chịu mặn khác như NtP5CS và NtCLC. Các dòng thuốc lá chuyển gen cho thấy mức độ phiên mã của gen GmDREB6 tăng từ 2,40 đến 3,22 lần trong điều kiện stress mặn. Điều này chứng tỏ rằng, gen này có vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng chịu mặn của cây trồng.

3.1. Kết quả thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm cho thấy, cây chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu mặn tốt hơn so với cây không chuyển gen. Mức độ biểu hiện của gen NtP5CS và NtCLC cũng tăng lên đáng kể, cho thấy sự tương tác tích cực giữa các gen trong việc cải thiện khả năng chịu mặn của cây đậu tương. Những kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu về gen GmDREB6 không chỉ có ý nghĩa trong việc hiểu rõ cơ chế di truyền của khả năng chịu mặn ở cây đậu tương mà còn mở ra triển vọng ứng dụng trong nông nghiệp. Việc phát triển các giống đậu tương chuyển gen có khả năng chịu mặn sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng trong bối cảnh biến đổi khí hậu. Điều này có thể góp phần quan trọng vào việc đảm bảo an ninh lương thực và phát triển bền vững trong nông nghiệp.

4.1. Ứng dụng trong nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu cho thấy, gen GmDREB6 có thể được sử dụng để phát triển các giống đậu tương mới có khả năng chịu mặn tốt hơn. Điều này không chỉ giúp cải thiện năng suất mà còn giảm thiểu thiệt hại do các yếu tố môi trường bất lợi. Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng nghiêm trọng.

25/01/2025
Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen gmdreb6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN, CHỊU MẶN 1. Cây đậu tương Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu Fabaceae, chi Glycine, là một loại cây trồng được biết đến từ rất lâu.

Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc xuất hiện vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên, sau đó loại cây này được ở nhiều nước Châu Á Châu Âu và Hoa Kỳ. Hệ thống phân loại đậu tương dựa vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể. Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merr và loài hoang dại hàng năm Glycine Soja Sieb và Zucc [2]. Về đặc điểm thực vật học, đậu tương là cây thân thảo, tự thụ phấn, cây trồng cạn thu hạt, gồm thân, rễ, lá, hoa, quả và hạt (Hình 1.

Từ lúc nảy mầm đến khi cây có 5 lá thật (3 lá kép) khoảng 25-30 ngày sau khi gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường. Khi cây đã có 6-7 lá thật (4-5 lá kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh nhất vào lúc ra hoa rộ (Hình 1. Sự khác biệt của cây đậu tương với cây trồng khác là khi cây ra hoa rộ lại là lúc thân cành phát triển mạnh nhất. Đây là giai đoạn 2 quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước khi vào thời kỳ này và tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi.

luan an 7 Hình 1. Một số đặc điểm hình thái cây đậu tương (Glycine max) A: Hình vẽ mô tả hình thái cây đậu tương [149]; B: Mẫu ép đậu tương [150]; C: Hoa đậu tương; D: Nốt sần đậu tương; E: Cây đậu tương, quả và hạt; F: Hạt đậu tương [151] Rễ đậu tương gồm có rễ cái và nhiều rễ con, rễ cái do phôi phát triển thành và có thể ăn sâu tới 150 cm, thông thường chỉ ăn sâu 20 – 30 cm. Từ rễ cái mọc ra nhiều rễ con. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ.

Nốt sần có thể dài 1cm, đường kính 5 – 6 mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu đỏ hồng thì có khả năng cố định nitơ mạnh, nếu nốt sần cắt ngang có màu đen là không còn khả năng cố định nitơ [2]. luan an 8 Hình 1. Các giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương [151] Thân cây đậu tương có nhiều lông nhỏ và nhiều đốt, lá mọc từ các đốt, cành mọc từ nách lá. Thân cây có màu xanh, xanh nhạt, tím nhạt.

Chiều cao thân dao động từ 20 – 50 cm, có thể lên tới 150 cm và được chia làm nhiều loại như thân đứng, bán đứng, leo. Dựa vào sự sinh trưởng của thân chia thành các loại là sinh trưởng hữu hạn (thân ngừng phát triển khi quả chín), sinh trưởng bán hữu hạn (quả sắp chín thân vẫn tiếp tục dài ra) và loại hình trung gian [2]. Lá đậu tương có 3 loại: lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Lá có thể có hình quả xoan, ngọn giáo, trứng.

Màu xanh của lá có ảnh hưởng đến sản lượng quả, lá nằm cạnh hoa nào thì có quyết định đến chính chùm hoa, quả đó. Độ góc sắp xếp lá trên cây có ý nghĩa quan trọng, độ góc hẹp lá sắp xếp thẳng góc với tia sáng thì có khả năng tận dụng được nhiều năng lượng mặt trời và có thể trồng dày để thu năng suất cao [2]. Cành trên thân thay đổi tùy theo giống, thời vụ và điều kiện canh tác. Cành mọc từ đốt thứ nhất tới đốt thứ 12, mọc khỏe từ đốt thứ 5 - 6.

Giống chín sớm vụ xuân có thể không có cành hoặc chỉ có từ 1 - 2 cành, các giống chín muộn vụ hè có từ 4 - 6 cành. Trong chọn tạo giống mục tiêu chọn ra các luan an 9 giống có số cành cấp 1 trên cây nhiều để tăng năng suất. Một số vùng trồng đậu tương áp dụng biện pháp ngắt ngọn khi cây có 4- 5 lá để tăng khả năng phân cành [2]. Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa có màu tím, tím nhạt, trắng.

Hoa đậu tương rất bé, có chiều dài 6 -7mm và mọc thành chùm. Hoa có cấu tạo dạng cánh bướm đặc trưng với ống đài 5 cánh không bằng nhau và tràng hoa bao gồm cánh cờ phía sau, 2 cánh bên và 2 cánh phía trước tiếp xúc nhau. Bộ nhị hoa gồm 10 nhị chia thành 2 nhóm, nhóm 1 gồm 9 nhị với cuống đính với nhau thành một khối và nhóm 2 nhị chỉ có 1 nhụy hoa, nhụy hoa có 1 lá noãn và từ 1 đến 4 lá noãn đính. Hoa ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên tới 80% [2].

Quả đậu tương thuộc loại quả giáp, số quả trên cây tuỳ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh, số quả trên cây dao động từ 10 - 20 quả với các giống chín sớm, các giống chín trung bình và chín muộn thì số quả trên cây nhiều hơn, có thể lên tới 150 quả/cây. Mỗi quả có từ 1 - 4 hạt nhưng chủ yếu là 2 - 3 hạt. Hạt thường có dạng hình tròn, dẹt, bầu dục. Màu sắc hạt có thể là vàng, vàng rơm, xanh, hoặc màu đen như một số giống nhập nội.

Giống có hạt màu vàng giá trị thương phẩm cao. Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt. Các giống có rốn hạt màu trắng được ưa chuộng hơn các giống có rốn hạt màu đen, nâu. Khối lượng 1000 hạt thay đổi tuỳ theo giống và điều kiện canh tác, có thể dao động từ 50 - 400g [2].

Khi các hạt đã rắn dần và đạt đến độ chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trưng của giống, còn vỏ quả thì chuyển sang màu vàng, vàng tro, xám, lá cây cũng chuyển sang úa vàng và rụng dần. Hàm lượng dầu trong hạt được ổn định sớm lúc hạt đang phát triển nhưng hàm lượng protein thì vẫn còn chịu ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng của cây cho đến cuối thời kì của quá trình chín [2]. luan an 10 Các nhân tố sinh thái cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương. Đất trồng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, tơi xốp, sẫm màu, thoáng, thoát nước, pH từ 6,5- 7,2.

Thời kỳ mọc nhiệt độ thích hợp nhất là 18- 22 oC, phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho thời kỳ mọc là 10 o C và 40 oC. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng cành lá là 20- 23 oC, thấp nhất là 15 oC, cao nhất là 37oC. Nhiệt độ dưới 10 oC ngăn cản sự phân hoá hoa, dưới 18oC đã có khả năng làm cho quả không đậu. Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ ra hoa là 22- 25 oC.

Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ hình thành quả và hạt là 21- 23 oC, thấp nhất là 15 oC cao nhất là 35 oC. Thời kỳ chín nhiệt độ thích hợp nhất là 19- 20 oC. Nhiệt độ 25- 27 oC hoạt động của vi khuẩn nốt sần tốt nhất. Đặc tính chống chịu hạn, mặn của cây đậu tương Các tác động bất lợi từ ngoại cảnh hay những stress có thể là nhân tố sinh học hoặc phi sinh học.

Các stress phi sinh học thường xuyên tác động đến thực vật nói chung, cây đậu tương nói riêng. Những yếu tố môi trường gây ra stress là úng nước, hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, đất mặn, thiếu chất dinh dưỡng trong đất; ánh sáng, gió, kim loại nặng và tổn thương cơ học. Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với stress phụ thuộc vào đặc tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Những phản ứng của thực vật đối với các tác động của các stress thể hiện ở sự thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi tỉ lệ sinh trưởng và năng suất.

Thời gian, mức độ khốc liệt của stress ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của cây trồng. Tính chống chịu là khả năng của thực vật ngăn ngừa, kháng lại và chịu đựng được các tác động bất lợi từ ngoại cảnh. Có ba dạng chống chịu các luan an 11 stress phi sinh học, đó là khả năng tránh stress (stress avoidance), khả năng kháng stress (stress tolerance) và khả năng chịu đựng được các stress. Tác động của hạn và cơ chế phân tử của tính chịu hạn Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật.

Hạn cũng như những yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tùy theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại khô hạn gây ra khác nhau: một số bị chết, một số bị tổn thường, một số khác bị ảnh hưởng, còn số khác có thể không bị ảnh hưởng. Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định của chu kì sống ở thực vật (hạt, bào tử). Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền.

Trong giai đoạn hình thành hạt, tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt các điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió [9]. Hạn do tác động của môi trường gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và mất mùa.

Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào. Những yếu tố bất lợi này chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết và khí hậu. Có thể phân biệt hai loại hạn do môi trường tác động, đó là hạn đất và hạn không khí.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Bài luận án tiến sĩ mang tiêu đề "Nghiên cứu biểu hiện gen gmdreb6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen" của tác giả Phutthakone VACIAXA, dưới sự hướng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu và TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, được thực hiện tại Đại học Thái Nguyên vào năm 2021. Nghiên cứu này tập trung vào việc cải thiện khả năng chịu mặn của cây thông qua việc điều chỉnh biểu hiện của gen gmdreb6. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất cây trồng trong điều kiện môi trường khắc nghiệt mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển nông nghiệp bền vững.

Để mở rộng thêm kiến thức về các nghiên cứu liên quan đến công nghệ sinh học và cải thiện cây trồng, bạn có thể tham khảo bài viết "Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây ráy mũi tên lá dài Alocasia longiloba", nơi trình bày quy trình nhân giống cây trồng hiệu quả. Ngoài ra, bài viết "Khảo sát khả năng nhân nhanh và tái sinh chồi lan Mokara vàng chanh trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời" cũng cung cấp cái nhìn sâu sắc về kỹ thuật nhân giống cây trồng. Cuối cùng, bài viết "Luận văn thạc sĩ về vi khuẩn chuyển hóa ammonium và xử lý nước thải thủy sản" sẽ giúp bạn hiểu thêm về ứng dụng vi sinh vật trong nông nghiệp và môi trường. Những tài liệu này sẽ giúp bạn mở rộng kiến thức và khám phá thêm nhiều khía cạnh thú vị trong lĩnh vực công nghệ sinh học.