CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng cellulose vi khuẩn Màng cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn, trong đó vi khuẩn Acetobacter xylinum cho hiệu quả tổng hợp màng tốt nhất [1]. Do đó, mục này sẽ làm rõ đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum cũng như điều kiện hình thành màng cellulose vi khuẩn từ loài này. Tìm hiểu về tính chất của màng cellulose vi khuẩn, những ưu điểm nổi trội của nó so với cellulose thực vật và ứng dụng của màng vào các ngành công nghiệp hiện nay.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum được phát hiện lần đầu tiên bởi A.J Brown vào năm 1886 do khả năng sản xuất cellulose. Trong tự nhiên, vi khuẩn A.xylinum được tìm thấy trong đất và trên trái cây rụng mục nát [2].xylinum là vi khuẩn Gram (-). Độ dài của vi khuẩn A.xylinum nằm trong khoảng từ 2 đến 10 µm với chiều rộng trong phạm vi 0.xylinum là một loại vi sinh vật hiếu khí, do đó cần oxy để tồn tại. Thông tin cụ thể về vị trí phân loại của vi khuẩn A.xylinum được trình bày ở bảng 1.
Vị trí phân loại của vi khuẩn Acetobacter xylinum [2] Ngành Proteobacteria Lớp Alphaproteobacteria Bộ Rhodospirillales Họ Acetobacteraceae Chi Acetobacter Loài Xylinum Tên khoa học Acetobacter xylinum Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng tổng hợp glucose thành cellulose chỉ thông qua một quá trình tổng hợp.xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như sự mất nước của môi trường nuôi cấy, độ pH, sự hiện diện của các chất độc 3 hại và sinh vật gây bệnh.xylinum hình que, thẳng hoặc đôi khi có dạng cong, độ dài của vi khuẩn trong khoảng 2 − 3 µm, bề ngang khoảng 0.8 µm, vi khuẩn có thể di động hoặc không, thường có sự sắp xếp riêng lẻ, đôi khi thành một chuỗi. Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bởi chất nhầy tạo váng nhăn có thành phần là hemicellulose [3]. Hình dạng của A.xylinum được thể hiện qua hình 1. Ảnh chụp vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC thông qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) [4] Khoảng phát triển của vi khuẩn A.xylinum khá rộng, vi khuẩn có thể phát triển ở điều kiện pH từ 3 − 8, nhiệt độ phát triển trong khoảng 12 − 30 °C.
Ở 37 °C, vi khuẩn này bị thoái hóa hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế nhiều nghiên cứu thường bổ sung thêm acetic acid vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn để hạn chế sự xâm nhiễm của các khuẩn lạ. Đặc tính của màng cellulose vi khuẩn (BC) Màng BC đang được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trong nhiều năm qua bởi nó sở hữu tính chất độc đáo so với màng cellulose thực vật. Cấu trúc và tính chất của màng BC thông qua mục 1. Cấu trúc của màng BC Cellulose là một polymer tự nhiên được tổng hợp bởi thực vật, nấm, tảo và vi khuẩn.
Cellulose hiếm khi được tìm thấy trong cấu trúc của tế bào vi khuẩn, nhưng nó là thành phần chính của thành tế bào thực vật và được tìm thấy trong vỏ hạt, gỗ, v. Các đại 4 phân tử cellulose được cấu tạo từ một chuỗi D-glucose không phân nhánh, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-β-glycosidic ở dạng mạch thẳng [4]. Liên kết giữa các phân tử glucose trong màng BC Cấu trúc của cellulose từ thực vật và cellulose vi khuẩn giống nhau, có công thức (C6H10O5)n, tuy nhiên, chúng khác nhau về tính chất vật lý và hóa học (hình 1. Cellulose từ vi khuẩn có tính chất vượt trội hơn cellulose thực vật như độ kết tinh cao, cấu trúc siêu mỏng, khả năng hút nước cao và độ bền cơ học ở trạng thái ngậm nước [5, 6].
a - Cellulose sinh học b – Cellulose thực vật Hình 1. Cấu trúc của cellulose sinh học và cellulose thực vật Các sợi của cellulose sinh học mỏng hơn 100 lần so với cellulose thực vật, điều này làm cho nó trở thành vật liệu có độ xốp cao. Phân tích cấu trúc cho thấy phân tử cellulose sinh học có dạng vi sợi, các vi sợi này kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi, các bó sợi kết hợp tạo các thớ sợi có đường kính từ 1.5 – 2 nm với chiều dài microfibrill tầm 50 − 100 µm [4]. Tính chất của màng BC Màng BC có nhiều đặc tính tuyệt vời và độc đáo.
Đầu tiên là nó có độ tinh khiết cao. Nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã cho thấy BC có độ tinh khiết rất cao (gần 100% cellulose) và không chứa hemicellulose hoặc lignin [7, 8]. Cellulose cấu tạo màng BC có thành phần hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Đặc điểm nổi bậc khác của BC là khả năng giữ nước cao và tính ưa nước của nó.
Hàm lượng nước có thể lên đến 98% trong gel BC pellicle, tức là khoảng 50 lần trọng lượng của sợi, khiến nó giống hydrogel hơn [8]. Các sợi cellulose có thể ở dạng I và I, đây là loại cellulose có trong thành tế bào thực vật và tảo. Màng thu được bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh có chứa nhiều I hơn là nuôi cấy động. Cellulose I tạo cấu trúc bền hơn I.
Cellulose sinh học có chứa đến gần 60% là I trong khi ở thực vật chỉ tầm 30%. Khả năng ngậm nước của cellulose sinh học cao từ 96 – 98. Ở thực vật cellulose I chiếm phần lớn [9]. Ngoài ra, độ bền kéo của BC cũng lớn hơn cellulose thực vật, đạt khoảng 114 GPa, gần bằng nhiều sợi tổng hợp có độ bền cao [10].
Nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng BC BC được sản xuất bởi các loài vi khuẩn khác nhau, chẳng hạn như Gluconacetobacter (trước đây là Acetobacter), Agrobacterium, Aerobacter, Achromobacter, Azotobacter, Rhizobium, Sarcina và Salmonella, trong đó A. xylinum cho hiệu quả tổng hợp BC tốt nhất [1]. Các loài Komagataeibacter spp. có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau, chẳng hạn như hexoses, glycerol, dihydroxyacetone, pyruvate và dicarboxylic acid.
Trong trường hợp này chúng sinh tổng hợp cellulose với hiệu suất chuyển hóa là gần 50%. Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp màng BC bao gồm: phương pháp nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy động), thành phần của môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nguồn nitơ, các chất kích thích sinh trưởng). Ngoài ra, còn có yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất thu màng như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ cấy. Phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường thích hợp sẽ tạo thành các hạt cellulose dạng lưới liên kết theo không gian 3 chiều với nhau [11].xylinum cần oxy để tồn tại, do 6 đó tốc độ trao đổi khí quyết định hiệu suất tổng hợp BC.
Khi nuôi cấy động sử dụng cánh khuấy, hạt BC phân tán trong môi trường và cho năng suất cao hơn so với nuôi cấy tĩnh, vì lượng oxy trao đổi nhiều [12]. Tuy nhiên, nuôi cấy động không thể hình thành màng BC với kích thước mong muốn. Phương pháp nuôi cấy tĩnh sẽ giúp hình thành màng BC nổi trên bề mặt môi trường, kích thước của màng phụ thuộc vào diện tích bề mặt của dụng cụ nuôi cấy.xylinum sử dụng carbon từ nhiều nguồn đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường có thể thay đổi. Những loại đường hay được sử dụng nhất là: glucose, fructose, mannitol, sorbitol.
Nguồn carbon cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, saccharose [13]. Nguồn nitơ Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập có chứa cao nấm men và tryptone. Đã có nhiều nghiên cứu thay đổi nguồn tryptone như nước ngâm ngô (corn steep liquor) [13], nguồn nitơ này được cho là có hiệu quả nhất, cho tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh tổng hợp cellulose cao so với các nguồn nitơ khác. Các chất kích thích tăng trưởng Các vitamin pyridoxin, biotin, nicotinic acid, P−aminobenzoic acid (pABA), được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pentothenat và riboflavin cho kết quả ngược lại.
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến sản xuất BC bao gồm thành phần lên men, tức là cacbon, nitơ và khoáng chất các nguồn được sử dụng trong môi trường và các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, oxy hòa tan của môi trường, tỷ lệ cấy. Nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự đã tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn A.xylinum D9 theo phương pháp Box−Willson thu được kết quả với nhiệt độ thích hợp 30 °C, thời gian thu màng 7 ngày, pH=5 là điều kiện thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn A. Có thể nuôi cấy thu sinh khối màng BC, xử lý thu màng có màu trắng trong, không mùi, đạt giá trị về mặt cảm quan [14]. Các ứng dụng của màng BC Xu hướng giảm sử dụng nguyên liệu từ dầu mỏ và thay thế chúng bằng các sản phẩm tuần hoàn và có thể tái chế đang được đẩy mạnh trên toàn cầu.
Trong số các vật liệu tự nhiên, cellulose là một trong những sinh khối có khả năng phân hủy sinh học phong phú nhất trên Trái đất [15]. Sở hữu những tính chất như: cấu trúc sợi nano, độ bền cơ học cao, khả năng giữ nước, thoát nước tốt, không độc và khả năng phân hủy sinh học, BC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y tế, mỹ phẩm, thực phẩm, giấy, dệt may, công nghiệp điện tử. Trong đó, ứng dụng của màng BC vào lĩnh vực y tế được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm, màng BC được ứng dụng trong điều trị vết thương, mỹ phẩm, dẫn truyền thuốc và vật liệu sử dụng trong phẫu thuật. Ứng dụng của BC trong điều trị vết thương BC có khả năng tương thích sinh học, do đó được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học.
Màng BC thu được sau khi nuôi cấy có cấu trúc sợi nano, cho phép các tế bào tổn thương liên kết với nhau và rút ngắn thời gian hồi phục, được sử dụng làm da nhân tạo [16, 17]. Calvalcanti và cộng sự (2017) đã kết luận rằng màng BC hỗ trợ lành vết thương loét da ở chân mà không gây bất kỳ tác dụng phụ nào so với băng vết thương thông thường, khi tới 95% các đại thực bào còn tồn tại [18]. Màng BC đắp lên vùng da bị tổn thương do bỏng [19] Ứng dụng của BC trong mỹ phẩm BC có mức độ hydrat hóa cao, được sử dụng như một thành phần trong kem ẩm. Ngoài ra, mặt nạ làm từ BC có thể dùng như chất mang những hoạt chất nuôi dưỡng, dưỡng ẩm, tái tạo và tẩy da, cung cấp độ đàn hồi, mềm mại và êm ái cho da.