Luận án về biểu hiện kháng nguyên gp5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây thiệt… 179 trang · Viện Công nghệ sinh học · 2018.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Kháng Nguyên Gp5 Của Virus Gây Hội Chứng Hô Hấp Ở Lợn Trong Cây Thuốc Lá
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.2. Sơ lược tình hình dịch bệnh
• 1.3. Bệnh tích của PRRS
• 1.4. Vaccine phòng PRRS
• 1.5. Vaccine sống - nhược độc
• 1.6. Vaccine vô hoạt
• 1.7. Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV
• 1.8. Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium
• 1.9. Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium
• 1.10. Quá trình thẩm lọc nhờ A.
• 1.11. Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật
• 2.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS
• 2.6. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m phục vụ chuyển gen
• 2.7. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá N.
• 2.8. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá
• 2.9. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số
• 2.10. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot
• 2.11. Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
• 2.12. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5-ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP trên động vật thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng
• 3.2. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (M-ELP)
• 3.3. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP (GP5-ELP)
• 3.4. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP (GP5ectoM-ELP)
• 3.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M - ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N
• 3.5.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ
• 3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS
• 3.5.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A.
• 3.5.4. Ảnh hưởng của tuổi của lá
• 3.5.5. Ảnh hưởng của tuổi cây
• 3.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch
• 3.7. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
• 3.7.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên
• 3.7.2. Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC
• 3.8. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm
• 3.8.1. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
• 3.8.2. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên lợn
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium
• 4.2. Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện
• 4.3. Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.4. Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
• 4.5. Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
• 4.6. Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Virus gây bệnh này, được gọi là PRRSV, đã xuất hiện tại Việt Nam từ năm 2007 và gây ra nhiều ổ dịch. Việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để kiểm soát dịch bệnh. Các kháng nguyên như kháng nguyên gp5 và M của virus PRRS được xem là ứng viên tiềm năng cho vaccine tiểu đơn vị. Nghiên cứu này nhằm mục đích biểu hiện các kháng nguyên này trong cây thuốc lá, sử dụng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.

1.1. Tình hình dịch bệnh

Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam đã diễn biến phức tạp, với nhiều ổ dịch xuất hiện. Theo thống kê, từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2016, đã có 14 ổ dịch tại 4 tỉnh, ảnh hưởng đến hàng ngàn con lợn. Việc phòng chống dịch bệnh chủ yếu dựa vào vaccine, nhưng hiện tại vẫn còn nhiều hạn chế. Các vaccine hiện có chưa đáp ứng đủ yêu cầu về hiệu quả và an toàn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vaccine mới là rất cần thiết.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium để biểu hiện tạm thời các kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM trong cây thuốc lá. Các vector chuyển gen được thiết kế để mang các gen mã hóa kháng nguyên. Quá trình tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen được thực hiện để đạt được mức độ biểu hiện cao nhất. Các điều kiện như nồng độ AS, mật độ vi khuẩn và tuổi của lá được điều chỉnh để tối ưu hóa hiệu quả biểu hiện. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng phương pháp này có thể tạo ra kháng nguyên với số lượng lớn và chất lượng cao.

2.1. Thiết kế vector chuyển gen

Vector chuyển gen được thiết kế dựa trên promoter CaMV 35S, cho phép biểu hiện mạnh mẽ trong cây thuốc lá. Các gen mã hóa kháng nguyên được kết hợp với các yếu tố hỗ trợ để tăng cường hiệu quả biểu hiện. Việc tạo ra các chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng là bước quan trọng trong quy trình nghiên cứu này.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có thể được biểu hiện thành công trong cây thuốc lá. Mức độ biểu hiện của các kháng nguyên này đã được xác định thông qua các phương pháp như điện di SDS-PAGE và lai Western blot. Các kháng nguyên tái tổ hợp này đã cho thấy khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên động vật thí nghiệm, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phát triển vaccine mới cho PRRS.

3.1. Đánh giá tính sinh miễn dịch

Các thí nghiệm trên động vật cho thấy rằng kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Đặc biệt, kháng thể IgG đặc hiệu đã được phát hiện trong huyết thanh của chuột và lợn được tiêm kháng nguyên. Điều này chứng tỏ rằng các kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát triển vaccine hiệu quả chống lại virus PRRS.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện các kháng nguyên gp5 và M của virus PRRS trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả cho thấy tiềm năng của các kháng nguyên này trong việc phát triển vaccine mới cho PRRS. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá tính hiệu quả của vaccine trong điều kiện thực tế.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Đề xuất nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc thử nghiệm các kháng nguyên tái tổ hợp trên quy mô lớn hơn và đánh giá tính hiệu quả của vaccine trong điều kiện thực địa. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về các kháng nguyên khác của virus PRRS để phát triển các loại vaccine đa dạng và hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số: 94 20 116) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hằng, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bảo vệ năm 2018), tập trung vào đề tài: "Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium".

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), thường gọi là bệnh lợn tai xanh, là bệnh truyền nhiễm do virus PRRSV (thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae) gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn toàn cầu và tại Việt Nam. Tại Mỹ, thiệt hại do PRRSV ước tính khoảng 664 triệu USD mỗi năm. Tại Việt Nam, từ khi chủng PRRSV thể độc lực cao xuất hiện năm 2007, dịch bệnh đã bùng phát trên diện rộng với tính chất chu kỳ 2–3 năm một lần. Các loại vaccine thương mại hiện hành chủ yếu là vaccine vô hoạt (độ an toàn cao nhưng hiệu lực bảo hộ thấp) và vaccine sống nhược độc (tạo miễn dịch tốt hơn nhưng tồn tại nguy cơ đột biến phục hồi độc lực, đào thải virus qua tinh dịch và tái tổ hợp di truyền với các chủng thực địa).

Trước thực trạng virus PRRS lưu hành tại Việt Nam thuộc thể độc lực cao và chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, việc phát triển vaccine thế hệ mới—đặc biệt là vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp—trở thành nhu cầu cấp thiết. Hai protein cấu trúc chính của virus là GP5 (glycoprotein 5) và M (matrix protein) đóng vai trò trung tâm trong quá trình xâm nhiễm và kích thích tạo kháng thể trung hòa. Luận án lựa chọn hướng biểu hiện tạm thời kháng nguyên M, GP5 và kháng nguyên dung hợp GP5ectoM (vùng ngoại bào của GP5 liên kết với protein M) trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana nhờ Agrobacterium tumefaciens, kết hợp dung hợp chuỗi peptide ELP (Elastin-like polypeptide) nhằm giải quyết bài toán nâng cao năng suất tích lũy và đơn giản hóa quy trình tinh sạch kháng nguyên.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể trong văn bản luận án bao gồm:

• Mục tiêu chung: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của chủng virus PRRS đang gây bệnh tại Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
• Mục tiêu cụ thể 1: Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5opt (được tối ưu hóa mã bộ ba) và gp5ecto-m của chủng PRRSV thể độc lực cao dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S.
• Mục tiêu cụ thể 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hóa 3 loại kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá.
• Mục tiêu cụ thể 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm (chuột và lợn).

Đối tượng nghiên cứu là các gen m, gp5opt, gp5ecto-m của chủng PRRSV thể độc lực cao dòng Bắc Mỹ đang lưu hành tại Việt Nam; hệ thống biểu hiện thực vật Nicotiana benthamiana; chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; cùng động vật thí nghiệm gồm chuột nhắt trắng và lợn. Phạm vi thực nghiệm được triển khai tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thử nghiệm sinh học (Viện Công nghệ sinh học) và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về dịch tễ học, đặc điểm sinh học phân tử của PRRSV, các giải pháp vaccine và công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp trong thực vật:

• Lịch sử và dịch tễ PRRSV: Bệnh được phát hiện lần đầu tại Mỹ năm 1987 (Rossow, 1998) và nhanh chóng phân lập tại Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a, 1992b). Dịch bùng phát mạnh tại Trung Quốc năm 2006 do chủng độc lực cao gây "bệnh sốt cao" (Tian et al., 2007). Tại Việt Nam, virus xuất hiện từ năm 1996 trên lợn nhập khẩu (Tô Long Thành, 2007); đến năm 2007, chủng PRRSV thể độc lực cao type II bùng phát tại Hải Dương có độ tương đồng 99% với chủng Trung Quốc và mất đoạn 30 axit amin ở protein nsp2 (Feng et al., 2008; Lê Thanh Hòa et al., 2008; Tiêu Quang An et al., 2010; Metwally et al., 2010). Phân tích đoạn gen ORF5 của 32 chủng phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2008–2012 cho thấy độ tương đồng nucleotide đạt 94,8–100% thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyen et al., 2012).
• Cấu trúc virus và đặc tính kháng nguyên: Hệ gen PRRSV là RNA sợi đơn dương dài 13–15 kb gồm các khung đọc mở ORF 1a, 1b (mã hóa 14 protein phi cấu trúc nsp) và ORF 2–7 mã hóa protein cấu trúc (Snijder & Meulenberg, 1998; Meulenberg, 2000; Fang & Snijder, 2010). GP5 (ORF5, 24–25 kDa, 200 aa) chứa peptide tín hiệu (aa 1–32), vùng ngoại bào ectodomain (aa 33–63) với các vị trí N-glycosyl hóa (N33, N44, N51 ở type II), epitope trung hòa B (aa 37–45/47) và decoy epitope A (aa 27–31) (Oleksiewicz et al., 2002; Ostrowski et al., 2002; Thaa et al., 2013). Protein M (ORF6, 18–19 kDa, 174 aa) không glycosyl hóa, có tính bảo thủ cao, liên kết với GP5 qua cầu nối disulfide tạo phức hợp heterodimer (Wieringa et al., 2004; Wissink et al., 2005; Yang et al., 2000; Bastos et al., 2002; Trible et al., 2012).
• Các hướng phát triển vaccine: Điểm lại các nghiên cứu vaccine nhược độc (Welch et al., 2004; Calvert et al., 2007; Linhares et al., 2012; Opriessnig et al., 2002; Rowland et al., 2003; Amonsin et al., 2009), vaccine vô hoạt (Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007), vaccine virus vector (Jiang et al., 2006a, 2008; Qiu et al., 2005; Cruz et al., 2010; Shen et al., 2007; Zheng et al., 2007), vaccine DNA (Chia et al., 2010, 2011; Li et al., 2009; Pirzadeh et al., 1998; Nan et al., 2017) và vaccine sản xuất từ thực vật (Twyman et al., 2003; Daniell et al., 2001; Giddings et al., 2000; Mason et al., 2002; Chen & Lai, 2013; Floss & Conrad, 2012; Fujiuchi et al., 2014; Piron et al., 2014; Hu et al., 2012; Chan et al., 2013; Verwoerd et al., 1995; Scheller et al., 2001; Cordis, 2015; Uribe-Campero et al., 2015).
• Phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium: Phân tích các nghiên cứu của Kapila et al. (1997), Voinnet et al. (2003), Peyret et al. (2013), Potera (2012), Rivera et al. (2012), Schillberg et al. (2013) về lợi thế biểu hiện tạm thời: tốc độ nhanh, mức độ tích lũy cao, không phụ thuộc vị trí gắn gen, an toàn sinh học.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: Thiết kế cấu trúc dung hợp vùng ngoại bào mang epitope trung hòa của GP5 với protein M (GP5ectoM) liên kết với đuôi ELP; thiết lập quy trình tối ưu hóa biểu hiện tạm thời và tinh sạch mITC trên cây thuốc lá N. benthamiana đối với chủng PRRSV thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam; kiểm chứng khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu trên mô hình động vật thí nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên khung lý thuyết sinh học phân tử thực vật và miễn dịch học thú y:

1. Hệ thống biểu hiện tạm thời qua Agrobacterium: Sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens đưa T-DNA chứa cassette gen đích vào tế bào mô lá N. benthamiana. T-DNA tồn tại ngoài nhiễm sắc thể nhưng thực hiện phiên mã mạnh mẽ dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S và kết thúc bởi 35S terminator (35S Ter).
2. Kỹ thuật dung hợp ELP và tinh sạch mITC: Dung hợp trình tự 100xELP (Elastin-like polypeptide) vào đầu C của kháng nguyên giúp tăng tính ổn định của protein trong tế bào thực vật và cho phép tinh sạch bằng phương pháp chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng (Membrane-based Inverse Transition Cycling - mITC) dựa trên hiện tượng tủa thuận nghịch khi có mặt chất cảm ứng muối hoặc PEG 8000.
3. Kháng câm gen sau phiên mã: Sử dụng các protein ức chế cơ chế câm gen PTGS (Post-Transcriptional Gene Silencing) từ virus gồm protein 2b của Cucumber mosaic virus (vector pBI-35S-2bCMV) và protein HC-Pro của Potato virus Y (vector pIBT-35S-HC-Pro PVY) để tăng cường mức tích lũy protein tái tổ hợp.

Hệ thống phương pháp thực nghiệm gồm:

• Tạo dòng và thiết kế vector: Tách dòng gen m, gp5opt, gp5ecto-m vào vector trung gian pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP; chuyển cassette biểu hiện sang vector nhị phân pCB301; biến nạp vào A. tumefaciens và kiểm tra bằng Colony-PCR.
• Thẩm lọc chân không và tiêm: Sử dụng huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào mô lá cây thuốc lá N. benthamiana 6–8 tuần tuổi bằng buồng hút chân không hoặc ống tiêm.
• Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Khảo sát thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng gồm: vector hỗ trợ ức chế câm gen, nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone (AS), mật độ quang học vi khuẩn ($OD_{600}$), tầng lá (tuổi sinh lý của lá) và tuổi của cây thuốc lá.
• Phân tích hóa sinh và miễn dịch: Tách chiết protein hòa tan tổng số (TSP); điện di biến tính SDS-PAGE; lai Western blot sử dụng kháng thể đơn dòng kháng c-Myc; định lượng mức độ tích lũy protein dựa trên đường chuẩn protein H5-pII.
• Đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật: Tiêm kháng nguyên tinh sạch cho chuột nhắt trắng và lợn; thu thập huyết thanh định kỳ; xác định hiệu giá kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV bằng kỹ thuật ELISA, Western blot và xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (Immunoperoxidase Monolayer Assay - IPMA).

Nội dung chính theo từng chương

Chương	Nội dung khoa học chính	Các phát hiện và số liệu then chốt
Mở đầu	Tính cấp thiết, mục tiêu, đối tượng, phạm vi nghiên cứu	Xác lập 3 mục tiêu cụ thể và 3 nội dung nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên PRRSV thể độc lực cao tại Việt Nam.
Chương 1: Tổng quan tài liệu	Tổng quan PRRSV, dịch tễ học, các dạng vaccine, hệ thống biểu hiện thực vật	Tổng hợp số liệu dịch PRRS 2015–2016 tại Việt Nam; phân tích cấu trúc ORF 1–7, đặc tính epitope GP5 và M; so sánh ưu nhược điểm các hệ thống biểu hiện.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp	Chủng vi sinh vật, vector, phương pháp sinh học phân tử, hóa sinh và miễn dịch	Mô tả chi tiết quy trình thiết kế vector pCB301, phương pháp thẩm lọc chân không, tinh sạch mITC bằng PEG 8000 và các thử nghiệm ELISA, Western blot, IPMA.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu	Thiết kế vector, tối ưu biểu hiện tạm thời, tinh sạch mITC và đánh giá miễn dịch	Thiết kế thành công 3 cấu trúc vector; tối ưu hóa các thông số thẩm lọc; tinh sạch thu hồi protein tái tổ hợp; xác định đáp ứng IgG trên chuột và lợn.
Chương 4: Bàn luận kết quả	Biện luận cơ chế biểu hiện, vai trò cấu trúc GP5ectoM-ELP, hiệu quả mITC và đáp ứng miễn dịch	Giải thích tính ưu việt của cấu trúc dung hợp heterodimer nhân tạo GP5ectoM; so sánh hiệu suất với các nghiên cứu quốc tế; phân tích tiềm năng ứng dụng vaccine tiểu đơn vị.

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 trình bày tổng quan về tình hình dịch PRRS trên thế giới và tại Việt Nam. Văn bản ghi nhận số liệu thống kê dịch bệnh giai đoạn 2015–2016 tại Việt Nam:

Chỉ tiêu so sánh	Năm 2015	Năm 2016
Số xã có dịch	19	14
Số huyện có dịch	11	8
Số tỉnh có dịch	6	4
Số gia súc mắc bệnh, chết, tiêu hủy	1.157 con	3.433 con mắc (1.242 con tiêu hủy)

Chương này đi sâu phân tích đặc điểm hình thái học hạt virus (đường kính 50–65 nm, trung bình 55 nm; lõi nucleocapsid 40 nm; vòng trống 39 nm), tổ chức hệ gen RNA đơn dương và chức năng của các protein cấu trúc. Phân tích chi tiết kháng nguyên GP5 (25 kDa) với 3 vị trí N-glycosyl hóa (N33, N44, N51) và epitope trung hòa (aa 37–45/47); protein M (18–19 kDa) liên kết tạo heterodimer với GP5. Tác giả phân tích hạn chế của vaccine nhược độc (nguy cơ biến đổi độc lực, đào thải qua tinh dịch) và vaccine vô hoạt (đáp ứng miễn dịch yếu), từ đó khẳng định vai trò của việc phát triển vaccine tiểu đơn vị sản xuất trên nền tảng thực vật thông qua phương pháp thẩm lọc Agrobacterium.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả hệ thống vật liệu và các kỹ thuật thực nghiệm:

• Vật liệu sinh học: Chủng vi khuẩn E. coli DH5α, A. tumefaciens (chủng LBA4404 và C58C1); vector tách dòng pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP, vector chuyển gen nhị phân pCB301; vector hỗ trợ pBI-35S-2bCMV và pIBT-35S-HC-Pro PVY; cây chủ Nicotiana benthamiana; động vật thí nghiệm gồm chuột BALB/c và lợn khỏe mạnh sạch kháng thể PRRSV.
• Quy trình tạo dòng: Sử dụng các cặp mồi chuyên biệt khuếch đại gen m, gp5opt và cấu trúc ghép nối đoạn gp5ecto với m. Lắp ráp các cassette biểu hiện chứa promoter CaMV 35S, tín hiệu định vị lưới nội chất, tag nhận diện His-tag, c-Myc, đuôi 100xELP và 35S terminator vào plasmid pCB301.
• Phương pháp thẩm lọc: Xâm nhiễm huyền phù Agrobacterium vào mô lá cây bằng phương pháp hút chân không (ngập toàn bộ tán lá trong dung dịch huyền phù và giải phóng áp suất chân không) hoặc tiêm bằng ống tiêm qua mặt dưới lá.
• Phương pháp tinh sạch mITC: Tách chiết dịch chiết protein tổng số từ lá cây thuốc lá sau thẩm lọc, bổ sung dung dịch PEG 8000 ở nồng độ tối ưu để gây chuyển pha thuận nghịch của chuỗi polypeptide ELP, tiến hành lọc qua màng và ly tâm thu nhận protein đích tinh khiết.
• Đánh giá miễn dịch: Động vật được gây miễn dịch theo phác đồ đa liều; hiệu giá kháng thể IgG đặc hiệu kháng virus PRRS trong huyết thanh được đo lường bằng ELISA, kiểm tra tính đặc hiệu qua lai Western blot và xác định hoạt tính nhận diện virus qua xét nghiệm IPMA.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 công bố các kết quả thực nghiệm đạt được theo 4 nhóm nội dung:

1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật:
   • Thiết kế thành công 3 vector chuyển gen: pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, và pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP.
   • Kiểm tra sự tích hợp của các cassette chuyển gen trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp Colony-PCR, xác nhận dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang đúng kích thước đoạn gen mục tiêu.
2. Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện tạm thời:
   • Ảnh hưởng của vector hỗ trợ: Sự đồng thẩm lọc với vector pIBT-35S-HC-Pro PVY hoặc pBI-35S-2bCMV giúp gia tăng đáng kể mức độ tích lũy protein tái tổ hợp so với khi không có mặt protein ức chế câm gen.
   • Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS): Nồng độ AS bổ sung vào dịch huyền phù vi khuẩn được tối ưu nhằm kích hoạt hệ thống vir của Agrobacterium.
   • Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn ($OD_{600}$): Mật độ quang thích hợp của dịch huyền phù A. tumefaciens được xác định giúp đạt hiệu suất biểu hiện cao nhất mà không gây hoại tử mô lá sớm.
   • Ảnh hưởng của tuổi lá và tuổi cây: Lá ở tầng phát triển bánh tẻ trên cây thuốc lá 6–8 tuần tuổi cho mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao và ổn định nhất.
   • Định lượng biểu hiện: Mức độ biểu hiện tạm thời của 3 protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được so sánh và định lượng bằng Western blot thông qua đường chuẩn protein H5-pII.
3. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng mITC:
   • Xác định nồng độ PEG 8000 tối ưu cho từng loại protein (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) để kết tủa chọn lọc chuỗi ELP.
   • Phân tích qua SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue và lai Western blot xác nhận các phân tử protein thu được có độ sạch cao, bảo toàn kích thước phân tử dự kiến và giữ nguyên tính đặc hiệu với kháng thể kháng c-Myc.
4. Tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm:
   • Trên chuột nhắt: Huyết thanh chuột được tiêm kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đều sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng lại virus PRRS (phát hiện qua ELISA và Western blot).
   • Trên lợn: Cả hai kháng nguyên GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đều kích thích tạo đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu cao trong huyết thanh lợn. Phân tích qua xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA) và ELISA cho thấy kháng nguyên dung hợp GP5ectoM-ELP kích thích tạo đáp ứng kháng thể mạnh và nhận diện hạt virus PRRS rõ rệt hơn so với kháng nguyên đơn lẻ.

Chương 4. Bàn luận kết quả nghiên cứu

Tác giả biện luận việc lựa chọn cấu trúc kháng nguyên dung hợp GP5ectoM: Vùng ngoại bào GP5ecto chứa các epitope trung hòa chủ chốt, khi được nối liền với protein màng M (vốn có tính bảo thủ cao) đã tạo nên cấu trúc mô phỏng phức hợp heterodimer tự nhiên của hạt virion, khắc phục tính kỵ nước của các vùng xuyên màng trên GP5 toàn phần.

Việc dung hợp chuỗi 100xELP không chỉ bảo vệ kháng nguyên khỏi sự phân hủy của protease nội bào thực vật mà còn tạo điều kiện áp dụng phương pháp tinh sạch mITC đơn giản, chi phí thấp, không cần dùng cột sắc ký ái lực đắt tiền. Sự kết hợp giữa promoter CaMV 35S và các yếu tố hỗ trợ ức chế câm gen (HC-Pro/2b) khẳng định tính khả thi của hệ thống biểu hiện tạm thời trên N. benthamiana trong việc sản xuất nhanh sinh khối kháng nguyên tiểu đơn vị phục vụ ứng phó dịch bệnh thú y.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả và đóng góp khoa học chính:

• Đóng góp về mặt khoa học và lý luận:
  • Là công trình nghiên cứu toàn diện đầu tiên tại Việt Nam thực hiện thành công từ khâu thiết kế vector chuyển gen, biểu hiện tạm thời các gen m, gp5opt, gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng PRRSV thể độc lực cao đang lưu hành trong lá cây thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.
  • Cung cấp cơ sở khoa học về việc thiết kế cấu trúc dung hợp epitope vùng ngoại bào GP5 với protein M (GP5ectoM) gắn đuôi ELP, chứng minh cấu trúc này nâng cao tính sinh miễn dịch và tạo kháng thể đặc hiệu nhận diện virus PRRS.
  • Chứng minh tính hiệu quả của phương pháp mITC kết hợp chuỗi peptide ELP trong biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên từ mô thực vật.
• Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng:
  • Tạo ra bộ 3 cấu trúc vector chuyển gen thực vật (pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP) và các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tương ứng, sẵn sàng phục vụ nghiên cứu và phát triển vaccine.
  • Xây dựng quy trình tối ưu biểu hiện tạm thời quy mô lá thuốc lá nhờ Agrobacterium bằng phương pháp thẩm lọc chân không và quy trình tinh sạch mITC thu hồi kháng nguyên đạt độ tinh sạch cao.
  • Khẳng định kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng chống bệnh lợn tai xanh tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án:
  • Quy mô nghiên cứu dừng lại ở mức độ phòng thí nghiệm trên mô lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana, chưa mở rộng sang quy mô bán công nghiệp.
  • Đánh giá miễn dịch trên động vật thí nghiệm mới tập trung vào đáp ứng miễn dịch dịch thể (hiệu giá kháng thể IgG đặc hiệu qua ELISA, Western blot, IPMA), chưa thực hiện thử nghiệm công cường độc (challenge test) với virus PRRS sống trên lợn để xác định tỷ lệ bảo hộ lâm sàng thực tế và chưa khảo sát sâu đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tiến hành thử nghiệm công cường độc chủng PRRSV thể độc lực cao trên lợn đã được tiêm kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP phối hợp tá dược để đánh giá tỷ lệ bảo hộ sống sót và mức độ giảm tổn thương phổi.
  • Tối ưu hóa quy trình nuôi trồng sinh khối thực vật và công nghệ thẩm lọc chân không quy mô lớn nhằm nâng cao năng suất thu hồi kháng nguyên.
  • Nghiên cứu công thức phối trộn tá dược hoàn chỉnh và đánh giá độ ổn định của chế phẩm kháng nguyên theo thời gian bảo quản.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật và thực tiễn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Hóa sinh học, Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật, Thú y học và Miễn dịch học; cung cấp phương pháp luận chi tiết về kỹ thuật agroinfiltration, thiết kế cassette biểu hiện thực vật và công nghệ tinh sạch protein qua chu trình chuyển pha ELP/mITC.
• Các viện nghiên cứu và phòng thí nghiệm công nghệ sinh học: Tham khảo hệ thống vector biểu hiện pCB301/pRTRA dung hợp ELP, quy trình thẩm lọc hút chân không trên N. benthamiana và quy trình tinh sạch kháng nguyên không dùng sắc ký cột.
• Các cơ sở sản xuất sinh phẩm và vaccine thú y: Sử dụng các dẫn liệu thực nghiệm về cấu trúc kháng nguyên GP5ectoM và các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp làm nguồn vật liệu khởi đầu để nghiên cứu phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRSV.

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng nguyên GP5ectoM-ELP được thiết kế dựa trên cơ sở cấu trúc nào của virus PRRS?
Kháng nguyên GP5ectoM-ELP được thiết kế bằng cách dung hợp đoạn peptit vùng ngoại bào của glycoprotein 5 (GP5ecto, chứa các epitope trung hòa) với protein màng M (protein bảo thủ cao), kết hợp với đuôi 100xELP ở đầu C. Cấu trúc này mô phỏng phức hợp heterodimer tự nhiên giữa GP5 và M trên vỏ virus PRRS, giúp loại bỏ các vùng xuyên màng kỵ nước của GP5 toàn phần, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự biểu hiện trong tế bào thực vật và tăng cường đáp ứng miễn dịch.

2. Đuôi dung hợp ELP và phương pháp mITC có ưu điểm gì trong quy trình sản xuất kháng nguyên?
Chuỗi Elastin-like polypeptide (100xELP) giúp nâng cao mức độ tích lũy và ổn định của protein tái tổ hợp trong mô lá thực vật. Đồng thời, ELP cho phép áp dụng phương pháp chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng (mITC) với sự hỗ trợ của chất gây tủa PEG 8000, giúp thu hồi và tinh sạch kháng nguyên nhanh chóng, hiệu quả mà không cần sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực tốn kém.

3. Các yếu tố nào đã được khảo sát để tối ưu hóa biểu hiện tạm thời trong lá cây thuốc lá?
Luận án đã tối ưu hóa 5 yếu tố công nghệ chính: (1) vector hỗ trợ mang gen ức chế câm gen (pIBT-35S-HC-Pro PVY và pBI-35S-2bCMV); (2) nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone (AS); (3) mật độ quang học của vi khuẩn Agrobacterium ($OD_{600}$); (4) tuổi sinh lý của lá trên cây (tầng lá bánh tẻ); và (5) tuổi sinh trưởng của cây thuốc lá N. benthamiana (6–8 tuần tuổi).

4. Kết quả thử nghiệm tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm cho thấy điều gì?
Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng và lợn chứng minh các kháng nguyên tái tổ hợp đều kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng virus PRRS. Trong đó, kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP kích thích đáp ứng kháng thể IgG mạnh mẽ; đặc biệt cấu trúc GP5ectoM-ELP cho hiệu quả nhận diện kháng nguyên vượt trội trong các xét nghiệm ELISA, Western blot và xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA).

Kết luận

Luận án đã thiết kế thành công các cấu trúc vector chuyển gen và thiết lập quy trình công nghệ biểu hiện tạm thời kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP của virus PRRS thể độc lực cao trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp tinh sạch mITC dựa trên chuỗi peptide ELP đã thu hồi được kháng nguyên tái tổ hợp đạt độ tinh sạch cao và giữ nguyên tính kháng nguyên đặc hiệu. Các thử nghiệm trên động vật xác nhận GP5ectoM-ELP và GP5-ELP kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh, tạo cơ sở khoa học và nguồn vật liệu quan trọng cho việc phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1. Sơ lược tình hình dịch bệnh Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện bệnh ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ cuối, thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động dục trở lại.

Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô hấp nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác bao gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp (1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được xác định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước trên thế giới.

Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng được gọi là PRRSV. Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn bệnh.

Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 - 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, dịch lại tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000 con, tiêu huỷ 175. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh.

Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines, PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1. Sau đó PRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y, 2008). 7 Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 bao gồm hai chủng thuộc dòng châu Âu và Bắc Mỹ.

Các báo cáo cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các Châu lục trên thế giới đều có PRRSV lưu hành (ngoại trừ châu Úc và Newzeland) đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới (Han et al. Ở Mỹ, hàng năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 664 triệu USD/năm (Holtkamp et al. Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Từ cuối 1996 đến đầu năm 2007, không có các thông báo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do PRRSV gây ra mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một số mẫu khi kiểm tra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 2007).

Cuối tháng 2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác định do nhiễm PRRSV thể độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% với các chủng của Trung Quốc (Feng et al.