Luận án về biểu hiện kháng nguyên gp5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Kháng Nguyên Gp5 Của Virus Gây Hội Chứng Hô Hấp Ở Lợn Trong Cây Thuốc Lá
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.2. Sơ lược tình hình dịch bệnh
• 1.3. Bệnh tích của PRRS
• 1.4. Vaccine phòng PRRS
• 1.5. Vaccine sống - nhược độc
• 1.6. Vaccine vô hoạt
• 1.7. Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV
• 1.8. Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium
• 1.9. Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium
• 1.10. Quá trình thẩm lọc nhờ A.
• 1.11. Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật
• 2.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS
• 2.6. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m phục vụ chuyển gen
• 2.7. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá N.
• 2.8. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá
• 2.9. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số
• 2.10. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot
• 2.11. Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
• 2.12. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5-ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP trên động vật thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng
• 3.2. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (M-ELP)
• 3.3. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP (GP5-ELP)
• 3.4. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP (GP5ectoM-ELP)
• 3.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M - ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N
• 3.5.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ
• 3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS
• 3.5.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A.
• 3.5.4. Ảnh hưởng của tuổi của lá
• 3.5.5. Ảnh hưởng của tuổi cây
• 3.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch
• 3.7. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
• 3.7.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên
• 3.7.2. Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC
• 3.8. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm
• 3.8.1. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
• 3.8.2. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên lợn
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium
• 4.2. Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện
• 4.3. Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.4. Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
• 4.5. Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
• 4.6. Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Virus gây bệnh này, được gọi là PRRSV, đã xuất hiện tại Việt Nam từ năm 2007 và gây ra nhiều ổ dịch. Việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để kiểm soát dịch bệnh. Các kháng nguyên như kháng nguyên gp5 và M của virus PRRS được xem là ứng viên tiềm năng cho vaccine tiểu đơn vị. Nghiên cứu này nhằm mục đích biểu hiện các kháng nguyên này trong cây thuốc lá, sử dụng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.

1.1. Tình hình dịch bệnh

Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam đã diễn biến phức tạp, với nhiều ổ dịch xuất hiện. Theo thống kê, từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2016, đã có 14 ổ dịch tại 4 tỉnh, ảnh hưởng đến hàng ngàn con lợn. Việc phòng chống dịch bệnh chủ yếu dựa vào vaccine, nhưng hiện tại vẫn còn nhiều hạn chế. Các vaccine hiện có chưa đáp ứng đủ yêu cầu về hiệu quả và an toàn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vaccine mới là rất cần thiết.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium để biểu hiện tạm thời các kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM trong cây thuốc lá. Các vector chuyển gen được thiết kế để mang các gen mã hóa kháng nguyên. Quá trình tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen được thực hiện để đạt được mức độ biểu hiện cao nhất. Các điều kiện như nồng độ AS, mật độ vi khuẩn và tuổi của lá được điều chỉnh để tối ưu hóa hiệu quả biểu hiện. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng phương pháp này có thể tạo ra kháng nguyên với số lượng lớn và chất lượng cao.

2.1. Thiết kế vector chuyển gen

Vector chuyển gen được thiết kế dựa trên promoter CaMV 35S, cho phép biểu hiện mạnh mẽ trong cây thuốc lá. Các gen mã hóa kháng nguyên được kết hợp với các yếu tố hỗ trợ để tăng cường hiệu quả biểu hiện. Việc tạo ra các chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng là bước quan trọng trong quy trình nghiên cứu này.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có thể được biểu hiện thành công trong cây thuốc lá. Mức độ biểu hiện của các kháng nguyên này đã được xác định thông qua các phương pháp như điện di SDS-PAGE và lai Western blot. Các kháng nguyên tái tổ hợp này đã cho thấy khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên động vật thí nghiệm, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phát triển vaccine mới cho PRRS.

3.1. Đánh giá tính sinh miễn dịch

Các thí nghiệm trên động vật cho thấy rằng kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Đặc biệt, kháng thể IgG đặc hiệu đã được phát hiện trong huyết thanh của chuột và lợn được tiêm kháng nguyên. Điều này chứng tỏ rằng các kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát triển vaccine hiệu quả chống lại virus PRRS.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện các kháng nguyên gp5 và M của virus PRRS trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả cho thấy tiềm năng của các kháng nguyên này trong việc phát triển vaccine mới cho PRRS. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá tính hiệu quả của vaccine trong điều kiện thực tế.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Đề xuất nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc thử nghiệm các kháng nguyên tái tổ hợp trên quy mô lớn hơn và đánh giá tính hiệu quả của vaccine trong điều kiện thực địa. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về các kháng nguyên khác của virus PRRS để phát triển các loại vaccine đa dạng và hiệu quả hơn.