Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là chi nấm ký sinh trên ấu trùng, nhộng hoặc sâu trưởng thành của các loài côn trùng. Dù có hơn 400 loài đã được ghi nhận, chỉ có khoảng 36 loài có thể nuôi trồng nhân tạo để thu quả thể. Hai loài có giá trị dược liệu và kinh tế tiêu biểu nhất là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Trong đó, C. sinensis chỉ phân bố ở vùng núi cao trên 4.000 m (dãy Himalaya, Tây Tạng, Nepal, Bhutan) và chưa thể nuôi cấy nhân tạo trên quy mô công nghiệp. Ngược lại, C. militaris đã được nuôi trồng thành công ở quy mô lớn trên các cơ chất nhân tạo (gạo lứt, hạt đậu nành, nhộng tằm) và chứa hàm lượng hoạt chất sinh học tương đương.
Hai hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học quan trọng nhất trong C. militaris là cordycepin và adenosine. Các nghiên cứu dược lý cho thấy các hợp chất này có tác dụng ức chế khối u, chống viêm, giảm đường huyết, tăng cường miễn dịch, điều hòa tim mạch và bảo vệ chức năng gan, thận, phổi. Trước nhu cầu sử dụng các chế phẩm thảo dược tự nhiên ngày càng gia tăng, việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình trích ly và bào chế cao khô giàu hoạt chất thứ cấp nhằm nâng cao chất lượng dược liệu là vấn đề thực tiễn cần giải quyết.
Khóa luận xác định mục tiêu và 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
- Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình bào chế tạo cao khô Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) có hàm lượng hợp chất adenosine và cordycepin cao.
- Nhiệm vụ nghiên cứu:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố vật lý và hóa học (loại dung môi, thời gian chiết) đến hiệu suất tách chiết nấm Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp Soxhlet.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp sấy (sấy thăng hoa và sấy nhiệt) đến khối lượng, cảm quan và hàm lượng hoạt chất của cao khô thu được.
- Định tính và định lượng hàm lượng hai hợp chất thứ cấp adenosine và cordycepin trong mẫu cao khô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Sinh khối sợi nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) gồm hai dạng nguyên liệu: sợi tươi và sợi khô.
- Phạm vi không gian: Thực nghiệm được tiến hành tại Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam; phân tích kiểm định độc lập tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
- Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2021 đến tháng 05/2022.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và cơ sở khoa học
- Đặc điểm sinh học và thành phần hóa học của Cordyceps militaris: Nấm thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae. Quả thể chứa protein (40,69%), polysaccharide (30%), acid cordycepic (11,8%), acid béo không no (axit linoleic chiếm 61,3% tổng acid béo quả thể), khoáng chất (Zn, Cu, Se) và các vitamin (A, B1, B6, B12, B3).
- Đặc tính hóa lý và cấu trúc của Cordycepin và Adenosine:
- Cordycepin (9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl)adenin; C10H13N5O3; M = 251,24 g/mol): Cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường 3-deoxyribose, nhiệt độ nóng chảy 228–231°C, tan trong DMSO, methanol, ethanol, bước sóng hấp thụ cực đại UV ở 259,0 nm.
- Adenosine (9-β-D-ribofuranosyl adenin; C10H13N5O4; M = 267,24 g/mol): Cấu tạo từ adenin gắn với ribofuranose, nhiệt độ nóng chảy 234–235°C, độ tan trong ethanol là 13 mg/ml, methanol là 6 mg/ml, nước là 5 mg/ml, bước sóng hấp thụ cực đại UV ở 259,0 nm.
- Nguyên lý các phương pháp chiết và làm khô:
- Phương pháp Soxhlet: Chiết hồi lưu liên tục mẫu rắn với dung môi bay hơi ở nhiệt độ sôi, giúp tiết kiệm dung môi và trích kiệt hoạt chất.
- Phương pháp sấy thăng hoa (Freeze Drying): Nước được tách ra khỏi vật liệu bằng sự thăng hoa trực tiếp từ thể rắn (băng) sang thể hơi trong điều kiện áp suất chân không thấp, giúp bảo toàn cấu trúc xốp và các hoạt chất kém bền nhiệt.
- Phương pháp sấy nhiệt đối lưu: Làm bốc hơi ẩm bề mặt bằng luồng không khí nóng, dễ làm suy giảm hoạt chất nhạy cảm với nhiệt độ.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Xử lý nguyên liệu: Mẫu tươi được nghiền nhỏ và bảo quản ở -18°C; mẫu khô được sấy ở 40°C, nghiền mịn thành bột và đóng gói hút chân không.
- Quy trình trích ly Soxhlet: Cân chính xác 10,0 g bột mẫu vào túi lọc giấy, đặt vào tháp trích ly của bộ Soxhlet. Thể tích dung môi sử dụng là 300 ml (tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:30 g/ml). Đun sôi hồi lưu trên bếp từ cách cát ở nhiệt độ sôi 100°C.
- Khảo sát các thông số trích ly:
- Yếu tố loại dung môi: Khảo sát 3 hệ dung môi gồm nước cất, ethanol 70% và ethanol 96% trong thời gian chiết cố định 10 giờ.
- Yếu tố thời gian chiết: Khảo sát 4 mức thời gian: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ và 10 giờ trên hệ dung môi tối ưu (ethanol 70%).
- Quy trình tạo cao khô: Dịch chiết sau Soxhlet được chia thể tích để sấy theo 2 phương pháp:
- Sấy thăng hoa (máy Harvest Right HR3): Cấp đông sâu tại -30°C, hút chân không ở áp suất 500 mTorr, chuyển sang sấy khan nâng nhiệt độ lên 50°C; tổng chu kỳ sấy 24 giờ.
- Sấy nhiệt (tủ sấy MSD500 - Mactech): Sấy ở nhiệt độ 50°C trong thời gian 3 giờ.
- Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
- Chuẩn bị dung dịch thử: Hòa tan 0,50 g cao khô trong methanol, siêu âm 30 phút, ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút, lọc qua màng lọc nylon 0,45 µm vào bình định mức 25 ml.
- Điều kiện vận hành HPLC: Cột pha đảo C18 (250 × 4,6 mm; kích thước hạt 5 µm); Pha động: Methanol (15%) – Nước (85%); Nhiệt độ cột: 25°C; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 20 µL; Detector PAD phát hiện tại bước sóng 260 nm. Thứ tự rửa giải ghi nhận: adenosine xuất hiện trước, cordycepin xuất hiện sau.
- Nguồn dữ liệu: Dữ liệu định lượng thực nghiệm thu nhận từ các mẻ lặp lại 3 lần (tính giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn TB ± SD) và phiếu kết quả kiểm nghiệm từ Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc nghiên cứu dược liệu nấm Cordyceps militaris, phân tích hạn chế về nguồn cung tự nhiên của C. sinensis và tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất C. militaris. Chương này xác định rõ mục đích nghiên cứu, 3 yêu cầu cụ thể và phạm vi đề tài tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Tổng hợp hệ thống lý thuyết về nguồn gốc phân loại, đặc điểm hình thái, chu kỳ sinh trưởng của C. militaris. Trình bày cơ chế sinh tổng hợp và dược lý học của adenosine và cordycepin. Đánh giá tình hình nghiên cứu chiết xuất trong nước (các nghiên cứu của Đoàn Thị Phương Thùy, Đỗ Thị Gấm, Nguyễn Thu Quỳnh) và quốc tế (Lei Huang, Hsiu-Ju Wang, Zheng-Ming Qian). Phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp chiết (Soxhlet, vi sóng MAE, ngấm kiệt), các kỹ thuật làm khô (sấy thăng hoa, sấy nhiệt) và nguyên lý phân tích HPLC.
Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết danh mục thiết bị, hóa chất chuẩn (cordycepin và adenosine từ Shanghai Tauto Biotech), nguồn gốc vật liệu nấm thu tại Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm. Mô tả chi tiết quy trình xử lý mẫu tươi và mẫu khô, các bước vận hành hệ thống Soxhlet, quy trình cài đặt máy sấy thăng hoa HR3, máy sấy nhiệt MSD500 và các thông số cài đặt trên hệ thống sắc ký HPLC pha đảo C18.
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm qua 4 nội dung chính:
1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu suất chiết và hàm lượng hoạt chất
Kết quả thực nghiệm trên 10 g mẫu chiết Soxhlet trong 10 giờ với 300 ml dung môi:
| Loại vật liệu |
Dung môi |
Khối lượng cao khô (g) (TB ± SD) |
Hiệu suất chiết (%) |
Hàm lượng Adenosine (mg/g) |
Hàm lượng Cordycepin (mg/g) |
| Sợi tươi |
Nước |
0,981 ± 0,014 |
9,81 |
2,53 |
3,38 |
|
Ethanol 70% |
1,339 ± 0,038 |
13,39 |
2,91 |
6,14 |
|
Ethanol 96% |
1,230 ± 0,019 |
12,30 |
0,96 |
4,75 |
| Sợi khô |
Nước |
1,128 ± 0,039 |
11,28 |
0,038 |
1,87 |
|
Ethanol 70% |
1,424 ± 0,048 |
14,24 |
0,051 |
4,46 |
|
Ethanol 96% |
1,359 ± 0,021 |
13,59 |
0,019 |
3,09 |
Ethanol 70% cho hiệu suất trích ly và hàm lượng cordycepin, adenosine cao nhất trên cả hai loại mẫu do độ phân cực của hỗn hợp dung môi tương thích tối ưu với độ phân cực của hai hợp chất này.
2. Ảnh hưởng của thời gian chiết Soxhlet
Khảo sát trên dung môi ethanol 70% ở các mốc thời gian 4, 6, 8 và 10 giờ:
| Thời gian (giờ) |
Khối lượng cao khô sợi tươi (g) |
Hiệu suất chiết sợi tươi (%) |
Adenosine sợi tươi (mg/g) |
Cordycepin sợi tươi (mg/g) |
Hiệu suất chiết sợi khô (%) |
| 4 |
1,045 ± 0,055 |
10,45 |
1,93 |
4,23 |
11,38 |
| 6 |
1,224 ± 0,022 |
12,24 |
2,37 |
5,17 |
- |
| 8 |
1,339 ± 0,038 |
13,39 |
2,79 |
5,56 |
14,24 |
| 10 |
1,398 ± 0,031 |
13,98 |
2,91 |
6,14 |
14,96 |
Hiệu suất tăng nhanh từ 4 đến 8 giờ và đạt mức tiệm cận tối đa ở 10 giờ (13,98% ở mẫu tươi và 14,96% ở mẫu khô).
3. Ảnh hưởng của phương pháp sấy đến chất lượng cao khô
| Dạng mẫu |
Phương pháp sấy |
Khối lượng cao khô (g) (TB ± SD) |
Adenosine (mg/g) |
Cordycepin (mg/g) |
Cảm quan / Màu sắc |
| Sợi tươi |
Sấy thăng hoa |
0,104 ± 0,011 |
2,89 |
6,11 |
Cao khô, màu cam tươi |
|
Sấy nhiệt |
0,095 ± 0,008 |
2,30 |
4,05 |
Cao khô, màu cam nâu |
| Sợi khô |
Sấy thăng hoa |
0,165 ± 0,009 |
0,047 |
4,45 |
Cao khô, màu cam tươi |
|
Sấy nhiệt |
0,147 ± 0,009 |
0,031 |
3,49 |
Cao khô, màu cam nâu |
Phương pháp sấy thăng hoa bảo toàn tốt hơn hàm lượng hoạt chất và giữ được màu sắc tự nhiên của cao chiết so với sấy nhiệt.
4. Định lượng hoạt chất trong cao khô bằng HPLC
| Mẫu cao khô |
Hàm lượng Cordycepin (mg/100g) |
Hàm lượng Adenosine (mg/100g) |
| Cao khô từ sợi tươi ĐTHT |
680 |
290 |
| Cao khô từ sợi khô ĐTHT |
474 |
5,44 |
Hàm lượng hoạt chất trong cao khô sợi tươi cao vượt trội so với sợi khô. Nguyên nhân do mẫu sợi khô đã bị suy giảm đáng kể hàm lượng hoạt chất trong quá trình sấy nhiệt sơ bộ sau thu hoạch.
Phần 5: Kết luận và kiến nghị
Tóm tắt các thông số tối ưu của quy trình chiết xuất và sấy cao; đưa ra các kiến nghị mở rộng quy mô nghiên cứu.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xác định được điều kiện trích ly Soxhlet tối ưu cho sợi nấm Cordyceps militaris: Dung môi ethanol 70%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:30 (g/ml), thời gian chiết 10 giờ. Hiệu suất chiết đạt 13,98% (sợi tươi) và 14,96% (sợi khô).
- Chứng minh phương pháp sấy thăng hoa vượt trội so với sấy nhiệt thông thường trong việc duy trì hàm lượng hoạt chất thứ cấp (cordycepin đạt 6,11 mg/g so với 4,05 mg/g ở sợi tươi; 4,45 mg/g so với 3,49 mg/g ở sợi khô) và giữ được màu sắc cam tươi tự nhiên.
- Định lượng sản phẩm cao khô hoàn thiện bằng HPLC ghi nhận hàm lượng hoạt chất cao nhất ở mẫu cao khô sợi tươi: Cordycepin đạt 680 mg/100g và Adenosine đạt 290 mg/100g (cao hơn đáng kể so với mẫu cao khô sợi khô với 474 mg/100g cordycepin và 5,44 mg/100g adenosine).
So sánh hàm lượng hoạt chất trong cao khô với một số nguồn công bố trong văn bản (mg/100g):
- Cao khô sợi tươi (Nghiên cứu này): Cordycepin = 680 mg/100g | Adenosine = 290 mg/100g
- ĐTHT tự nhiên (Công bố tổng quan): Cordycepin = 169 - 250 mg/100g | Adenosine = 100 - 120 mg/100g
- ĐTHT nuôi cấy trung bình: Cordycepin = 100 - 150 mg/100g
- Mẫu ĐTHT Vietfarm: Cordycepin = 122 mg/100g | Adenosine = 1,06 mg/100g
- Mẫu ĐTHT ĐH Tân Trào: Cordycepin = 105 mg/100g | Adenosine = 22,3 mg/100g
Đề xuất và giải pháp
- Sử dụng trực tiếp sợi tươi Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu đầu vào cho quy trình tách chiết nhằm tránh tổn thất hoạt chất do nhiệt trong khâu sấy khô nguyên liệu ban đầu.
- Áp dụng kết hợp phương pháp chiết Soxhlet với ethanol 70% và phương pháp sấy thăng hoa để sản xuất cao khô dược liệu chất lượng cao.
Đóng góp thực tiễn
Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm có đối chứng rõ ràng về sự biến thiên hàm lượng cordycepin và adenosine qua từng công đoạn xử lý (dung môi, thời gian chiết, kỹ thuật sấy, dạng nguyên liệu tươi/khô), đóng góp quy trình chiết xuất có thể ứng dụng trong chế biến sâu nấm dược liệu.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Nghiên cứu chỉ được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm (dung tích mẻ chiết 10 g nguyên liệu trong 300 ml dung môi).
- Chưa tiến hành khảo sát so sánh mở rộng với các kỹ thuật chiết hiện đại khác như chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết siêu âm hoặc chiết lỏng siêu tới hạn (SFE) do giới hạn về thời gian và thiết bị.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Thử nghiệm tối ưu hóa thêm các thông số sấy và nâng cao hiệu suất thu hồi dịch chiết.
- Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất thử nghiệm (quy mô pilot và công nghiệp) để đánh giá tính khả thi kinh tế - kỹ thuật trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng sử dụng tài liệu:
- Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa dược, Dược học, Công nghệ thực phẩm và Khoa học cây trồng.
- Cán bộ kỹ thuật và các đơn vị sản xuất, chế biến các sản phẩm từ nấm dược liệu Cordyceps militaris.
- Các nội dung có giá trị tham khảo cao:
- Quy trình chi tiết định lượng đồng thời adenosine và cordycepin trên hệ thống HPLC pha đảo C18 sử dụng pha động Methanol : Nước (15:85 v/v) ở bước sóng 260 nm.
- Các số liệu so sánh thực nghiệm giữa phương pháp sấy thăng hoa và sấy nhiệt đối với độ ổn định của các hợp chất nucleoside tự nhiên.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao dung môi ethanol 70% lại cho hiệu suất chiết cordycepin và adenosine cao hơn nước và ethanol 96%?
Trả lời: Mức độ phân cực của dung môi phụ thuộc vào hằng số điện môi và khả năng tạo liên kết hydro. Phân tử nước có độ phân cực cao, trong khi ethanol 96% có độ phân cực thấp hơn. Hỗn hợp ethanol 70% tạo ra hệ dung môi có độ phân cực tương đồng nhất với độ phân cực của phân tử adenosine và cordycepin (vốn chứa khung purin và các nhóm hydroxyl phân cực), giúp tăng cường khả năng hòa tan và lôi kéo hoạt chất ra khỏi sinh khối nấm.
2. Vì sao cao khô điều chế từ sợi tươi lại có hàm lượng adenosine và cordycepin cao hơn nhiều so với sợi khô?
Trả lời: Mẫu sợi khô trong quá trình sơ chế sau thu hoạch đã trải qua công đoạn sấy nhiệt (ở 40°C hoặc sấy nhiệt thương phẩm). Quá trình gia nhiệt kéo dài đã gây phân hủy và nhiệt phân một lượng lớn các hợp chất sinh học kém bền nhiệt. Sợi tươi được giữ đông ở -18°C và chiết trực tiếp nên bảo toàn nguyên vẹn hàm lượng hoạt chất ban đầu.
3. Phương pháp sấy thăng hoa thể hiện ưu thế gì so với sấy nhiệt trong nghiên cứu này?
Trả lời: Sấy thăng hoa thực hiện ở nhiệt độ âm (-30°C) và áp suất chân không (500 mTorr), giúp nước thăng hoa mà không làm biến tính các hợp chất nhạy cảm nhiệt độ. Kết quả là cao khô giữ được hàm lượng cordycepin (6,11 mg/g ở sợi tươi so với 4,05 mg/g khi sấy nhiệt) và giữ được màu sắc cam tươi tự nhiên, không bị chuyển sang màu cam nâu như sấy nhiệt đối lưu ở 50°C.
4. Điều kiện vận hành HPLC để định lượng đồng thời adenosine và cordycepin trong khóa luận là gì?
Trả lời: Phép phân tích sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm), detector PAD cài đặt tại bước sóng 260 nm, nhiệt độ cột 25°C, thể tích tiêm 20 µL, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha động đẳng dòng gồm Methanol (15%) và Nước (85%). Thứ tự rửa giải ghi nhận pic adenosine xuất hiện trước pic cordycepin.
5. Hàm lượng cordycepin và adenosine trong sản phẩm cao khô của nghiên cứu đạt mức nào so với các mẫu công bố khác?
Trả lời: Cao khô sợi tươi của nghiên cứu đạt hàm lượng cordycepin 680 mg/100g và adenosine 290 mg/100g. Mức này cao hơn mẫu tự nhiên công bố trong tổng quan (cordycepin 169–250 mg/100g, adenosine 100–120 mg/100g), cao hơn mức nuôi cấy nhân tạo thông thường (100–150 mg/100g) và cao hơn các mẫu thương phẩm được kiểm nghiệm như Đông trùng hạ thảo Vietfarm (cordycepin 122 mg/100g, adenosine 1,06 mg/100g) hay mẫu từ Đại học Tân Trào (cordycepin 105 mg/100g, adenosine 22,3 mg/100g).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Diễm đã xây dựng thành công quy trình thực nghiệm bào chế cao khô nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giàu hoạt chất thứ cấp ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình tối ưu xác định sử dụng nguyên liệu sợi tươi, chiết hồi lưu Soxhlet với dung môi ethanol 70% trong 10 giờ và làm khô bằng phương pháp sấy thăng hoa. Sản phẩm cao khô thu được đạt chất lượng cảm quan màu cam tươi với hàm lượng cordycepin đạt 680 mg/100g và adenosine đạt 290 mg/100g, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất dược liệu.
