Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps là loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng. Hơn 400 phân loài nấm thuộc chi Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể. Giống Cordyceps có hai loài hiên nay đang đươc nghiên cứu rất nhiều về chiết xuất và sản xuất do có giá tri dược liệu và giá trị kinh tế cao. Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis (C.
sinensis) là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tự nhiên và được nuôi trồng trong điều kiện hoang dại, loài nấm này hiện tại vẫn chưa đươc nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm thu được không đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường. Trong số những loài này, chỉ có loài Cordyceps militaris (C. militaris) đã được trồng thành công ở quy mô lớn và có chứa nhiều các chất có hoạt chất sinh học (Li & cs. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thảo dược có nguồn gốc thiên nhiên để phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến, trong đó phải kể đến Đông trùng hạ thảo, một loại thảo dược mang những giá trị dược liệu thần kỳ.
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng bổ thận, bổ khí điều trị các trường hợp mệt mỏi, đổ mồ hôi về đêm, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, bệnh phổi, bệnh thận, suy thận, loạn nhịp tim và bệnh gan, … Hoạt chất chính có trong Đông trùng hạ thảo được kể đến là adenosine và cordycepin, có nhiều tác dụng trong dược phẩm. Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo cho thấy những ứng dụng thần kỳ của nó trong y học, đồng thời cũng đã nghiên cứu xác định hàm lượng adenosine và cordycepin bằng phương pháp HPLC đối với hai loài Đông trùng hạ thảo phổ biến là C. Ngoài ra, còn có những nghiên cứu tách chiết và phân lập một số hợp chất từ Đông trùng hạ thảo nuôi cấy. Cũng nghiên cứu về phương pháp tách chiết Đông trùng hạ thảo.
Năm 2017, nhóm tác giả Lê Thị Huyền Trang đã nghiên cứu quy trình tách chiết adenosine và cordycepin từ Đông trùng hạ thảo được nuôi trồng bằng phương 1 pháp siêu âm, sử dụng dung môi tách chiết là nước. Bên cạnh đó, còn tách chiết Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp vi sóng của nhóm tác giả Li Deng & cộng sự năm 2013 thực hiện nghiên cứu tối ưu hóa ly trích axit cordyielic và codycepin bằng phương pháp phản ứng bề mặt từ Đông trùng hạ thảo được nuôi cấy bằng phương pháp có hỗ trợ vi sóng. Trong năm 2019, Zheng-Ming Qian và nhóm tác giả thực hiện nghiên cứu: xác định nhanh trong Đông trùng hạ thảo bằng cách ly trích trực tiếp bằng máy HPLC: Bột mẫu cordyceps cho vào cột bảo vệ và được ly trích bằng nước nóng ở 75°C và áp suất 150 bar trong 3 phút. Kết quả adenosine lần lượt là 0,24% và 0,94%.
Nhìn chung, nghiên cứu các phương pháp tách chiết hoạt chất từ Đông trùng hạ thảo cho hàm lượng adenosine và cordycepin thu được bằng các phương pháp tách chiết và tối ưu các thông số kỹ thuật trong quá trình tách chiết là khác nhau. Hàm lượng adenosine và cordycepin thu được được ứng dụng trong công tác nghiên cứu tạo sản phẩm chống ung thư đang là mối quan tâm hàng đầu trong giai đoạn dịch bệnh hiện nay. Do đó, việc nghiên cứu tạo bột cao Đông trùng hạ thảo giàu hợp chất thứ cấp (adenosine và cordycepin) là nghiên cứu cần thiết. Vậy nên, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu bào chế tạo cao chiết Đông trùng hạ thảo có hợp chất thứ cấp cao”.
Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Tạo cao khô Đông trùng hạ thảo có hàm lượng hợp chất adenosine và cordycepin cao. Yêu cầu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý và hóa học tới hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông trùng hạ thảo.
Đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp cao khô thu được. 2 P ẦN 2: TỔN QU N TÀ L ỆU 2. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo 2. iới thiệu chung Nấm C.
militaris thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps và loài Cordyceps militaris. Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris sau đó đươc đổi tên thành Cordyceps militaris (Kobayasi & cs. Nấm Đông trùng hạ thảo là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng. Đến nay, đã phát hiện được hơn 400 loài nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps nhưng chỉ có 2 loài được chú trọng nghiên cứu nhiều nhất là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris do có giá trị dược liệu cao.
Ngoài tự nhiên, nấm Đông trùng hạ thảo thường được tìm thấy vào mùa hè, loài nấm C. sinensis phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000 m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng Nepan và Butan; loài nấm C. militaris tìm thấy ở vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và các nước trong khu vực Đông Nam Á) (Wang, 1995). Đặc điểm hình thái đông trùng hạ thảo Loài nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, quả thể có màu cam, chiều dài 8 – 10 cm.
Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng. Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa. Các nang bào tử dài từ 300 – 510 µm, bề rộng 4 µm. Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3,5 – 6 x 1 – 1,5 µm.
Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp. Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc Mỹ, châu u và châu Á (Paul & cs. Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử (Christian & cs. ĩ thuật nuôi trồng và các phƣơng pháp nhân giống Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được trồng trong môi trường lỏng để thu hoạch sợi nấm đồng thời trên môi trường rắn để thu quả thể.
Các tác giả Kim và cộng sự đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chìm nấm C. militaris (Kim & cs. Để sản xuất quy mô lớn về số lượng quả thể nấm C. militaris hiện nay người ta chỉ sử dụng môi trường rắn chứa các cơ chất nhân tạo hoặc môi trường rắn chứa côn trùng (ví dụ, ấu trùng tằm B.
Tuy nhiên, viêc nuôi nấm lấy quả thể trên côn trùng rất tốn kém, do đó hiên nay nấm chủ yếu được nuôi trên môi trường có thành phần chính là gạo. Các môi trường dùng cho nuôi cấy bao gồm môi trường nhân giống, môi trường tiền nuôi cấy hê sợi và môi trường sản xuất. Thành phần các môi trường này khác nhau phù hơp với sự phát triển của nấm ở các giai đoạn. Có 4 giai đoan chính trong sự phát triển của nấm, bao gồm: giai đoan tạo hệ sợi, giai đoạn tạo sắc tố, giai đoan nảy chồi, và giai đoan tạo quả thể (Lu & cs.
Các quá trình này đòi hỏi việc kiểm soát chặt chẽ về nhiêt độ, độ ẩm và ánh sáng. Việc nuôi cấy các loài nấm trên môi trường rắn đã được nghiên cứu trong nhiều năm qua. So sánh với các loại môi trường khác, môi trường rắn hiệu quả hơn về các mặt như diện tích nuôi trồng nhỏ, giảm lương nước tiêu thụ so với nuôi cấy lỏng, đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải và tiêu thụ năng lượng trong quy trình nuôi nấm. Trong tự nhiên nấm C.
militaris sinh trưởng rất hạn chế ký sinh trên côn trùng. Khi nuôi trồng trong điều kiện 4 nhân tạo nấm có thể phát triển trong điều kiên tối ưu như độ thoáng khí giúp cho việc phát triển tơ nấm và quả thể, nhất là chủ yếu quả thể chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hơn. Quả thể đã được trồng thành công trên môi trường gạo lứt hoăc ấu trùng côn trùng. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng hạt kê có thể tạo ra nấm có hàm lượng adenosine cao.
Các nghiên cứu cũng cho thấy khi hat đậu nành được dùng làm môi trường rắn hàm lượng cordycepin tăng so với giá thể gạo (Lim & cs. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/g), vitamin B1 (13,0 mg/g), vitamin B6 (62,2 mg/g), vitamin B12 (70,3 mg/g), vitamin B3 (42,9 mg/g); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: Cordycepin (1,52%), Cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih & cs. Acid amin Kết quả nghiên cứu của Hur năm 2008 cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps militaris có chứa lương acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 – 15,06 mg/g và 0,36 – 2,99 mg/g.
Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) trong quả thể. Số liệu phân tích của Chang năm 2001 cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001). Polysaccharide Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đươc tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường 5 monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất.
Yan và cộng sự năm 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm (Yan & cs. cid b o Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lương acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 2. Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008) Phần trăm acid béo tổng (%) Quả thể Sinh khối Palmitic acid (C16:0) 24.