Luận án tiến sĩ analysis of ribosomal protein block structure functional characterization evolutionary implications and distant homology search using discrete state models

Phân tích cấu trúc khối protein ribosome, đặc điểm chức năng, ý nghĩa tiến hóa và tìm kiếm đồng hình xa bằng mô hình trạng thái rời rạc.

• Đề tài: Phân Tích Cấu Trúc Khối Protein Ribosome: Đặc Trưng Chức Năng, Ý Nghĩa Tiến Hóa và Tìm Kiếm Đồng Họ Xa Sử Dụng Mô Hình Trạng Thái Rời

Mục lục chi tiết

• Acknowledgments
• Abstract
• List of Tables
• List of Figures
• 1. CHƯƠNG 1: Introduction
• 1.1. Motivation and Significance
• 1.2. Protein Translation
• 1.3. Protein Translation Apparatus
• 2. CHƯƠNG 2: Taxon-specific Block Structure in Ribosomal Proteins
• 2.1. Ribosomal proteins distribution among the three phylogenetic domains
• 2.2. Schematic representation of the multiple alignments in the universal ribosomal protein set (UN) of the 30S subunit
• 2.3. Schematic representation of the multiple alignments in the universal ribosomal protein set (UN) of the 50S subunit
• 2.4. Schematic representation of the multiple alignments in the archaeal-eukaryotic ribosomal protein set (AE) of the 30S subunit
• 2.5. Schematic representation of the multiple alignments in the archaeal-eukaryotic ribosomal protein set (AP) of the 50S subunit
• 2.6. Length distribution of the taxon-specific blocks identified in the ribosomal proteins
• 2.7. Average number of blocks in ribosomal proteins
• 2.8. Block distribution among the ribosomal proteins
• 2.9. Average number of conserved positions in subsets of universal ribosomal proteins
• 2.10. Average number of informative positions in subsets of universal ribosomal proteins
• 2.11. Distribution of rRNA-ribosomal protein interactions (RPI) among block types
• 2.12. Distribution of rRNA-ribosomal protein interaction (RPI) types in both ribosomal subunits
• 2.13. Distributions of rRNA-ribosomal protein interactions among amino acids in ribosomal proteins
• 2.14. rRNA-ribosomal protein interactions mapped into the secondary structure of the 23S rRNA of H.
• 2.15. rRNA-ribosomal protein interactions mapped into the secondary structure of the 23S rRNA of H.
• 2.16. rRNA-ribosomal protein interactions mapped into the secondary structure of 16S rRNA of T.
• 2.17. Phylogenetic reconstructions using the positional variation among aligned subsets of ribosomal proteins
• 3. CHƯƠNG 3: Functional Analysis of Ribosomal Proteins
• 3.1. Structural Role of Ribosomal Proteins
• 3.2. RNA-chaperone Activity of Ribosomal Proteins
• 3.3. Consensus Secondary Structure of rRNA
• 3.4. RNA Secondary-structure Prediction Software: mfold
• 3.5. Fold Prediction Scoring Scheme
• 3.6. Individual Protein Constraints
• 3.7. Binding Pathway Constraints
• 3.8. Artificial and Hypothetical Protein Constraints
• 3.9. Conclusions: Role of Ribosomal Proteins in rRNA Folding
• 3.10. rRNA Base-pair Substitutions
• 3.11. Conclusions: Sequence Composition Impact on rRNA Folding
• 3.12. Conclusions: Constraining rRNA Conformational Space
• 4. CHƯƠNG 4: Discrete State Models for Distant Homology Search of Ribosomal Blocks
• 4.1. Discrete State-space Models (DSMs)
• 4.2. Creation of Discrete State Models
• 4.3. Distant Homology Search: Problem Formulation
• 4.4. Method and Models Validation
• 4.5. Identification of Repeated-domain Proteins: WD40-repeat Family
• 4.6. WD40-repeat Model Validation
• 4.7. Identification of Small Domain Proteins and Concatenated Domains: Ubiquitin
• 4.8. Discrete State Models for Ribosomal Protein Blocks
• 5. CHƯƠNG 5: Discussion
• 5.1. Evolutionary Implications of the Ribosomal Protein Block Structure
• 5.2. The Archaeal Origin of the Eukaryotic Translational Apparatus
• 5.3. Ribosomal Block Structure and Interactions with rRNA
• 5.4. Protein Domain Identification Using DSMs
• PDB Structures of Proteins in the Translational Apparatus
• rRNA and Ribosomal Protein Interactions
• Phylogenetic Reconstruction Parameters
• WD40-repeat Prediction in S. cerevisiae
• PDB Structures of Ubiquitin Family
• Bibliography
• Vita

Tóm tắt

I. Tổng Quan Cấu Trúc Ribosome Chức Năng Tiến Hóa Phân Loại

Ribosome, cỗ máy phân tử phức tạp, đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh tổng hợp protein ở mọi sinh vật. Nghiên cứu này đi sâu vào sự phức tạp của bộ máy dịch mã, khám phá cách các thành phần tiến hóa và tương tác với nhau. Phân tích so sánh cấu trúc và trình tự của các protein ribosome liên quan đến chức năng và miền phát sinh loài. Kết quả cho thấy sự tiến hóa của ribosome có sự khác biệt theo taxon, một số miền được bảo tồn phổ quát, trong khi những miền khác đặc trưng cho một nhóm sinh vật cụ thể. Đặc biệt, cấu trúc của ribosome ở Archaea, sinh vật nội cộng sinh và Eukaryote hiện đại cho thấy những ảnh hưởng tiến hóa đáng kể. Việc tìm kiếm các đồng họ xa và phân tích cấu trúc khối protein ribosome là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về nguồn gốc và sự tiến hóa của ribosome.

1.1. Giới Thiệu Chi Tiết về Cấu Trúc và Chức Năng Ribosome

Ribosome là một phức hợp ribonucleoprotein (RNP), bao gồm hai tiểu đơn vị không bằng nhau: tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ. Tiểu đơn vị nhỏ chịu trách nhiệm giải mã thông tin di truyền từ mRNA, trong khi tiểu đơn vị lớn xúc tác sự hình thành liên kết peptide giữa các axit amin. Hầu hết khối lượng của ribosome là rRNA, các protein hỗ trợ chủ yếu trong việc ổn định cấu trúc ribosome. Mặc dù có sự khác biệt nhỏ giữa các nhóm sinh vật, nhưng cơ chế dịch mã cơ bản được bảo tồn cao. Chức năng chính của ribosome là dịch mã thông tin di truyền từ mRNA thành chuỗi polypeptide. Ribosome chứa trung tâm giải mã, nơi nhận biết codon mRNA và codon đối mã tRNA. Tiểu đơn vị ribosome cũng chứa trung tâm peptidyl transferase, nơi diễn ra sự hình thành liên kết peptide.

1.2. Vấn Đề Nghiên Cứu Thách Thức trong Phân Tích Cấu Trúc Ribosome

Phân tích cấu trúc ribosome đối mặt với nhiều thách thức do kích thước và sự phức tạp của nó. Việc xác định cấu trúc bằng các phương pháp truyền thống như x-ray crystallography và cryo-EM đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Sự linh động của ribosome và tương tác phức tạp giữa rRNA và protein cũng gây khó khăn cho việc phân tích cấu trúc. Một vấn đề khác là xác định các yếu tố tiến hóa đã định hình cấu trúc ribosome. Sự khác biệt giữa ribosome của các nhóm sinh vật khác nhau cho thấy sự thích nghi với các điều kiện môi trường và nhu cầu chức năng khác nhau. Nghiên cứu này nhằm giải quyết những thách thức này bằng cách sử dụng phương pháp mô hình trạng thái rời (Discrete State Models - DSMs) để tìm kiếm các đồng họ xa và phân tích cấu trúc khối protein ribosome.

II. Phương Pháp Phân Tích Mô Hình Trạng Thái Rời Cho Ribosome

Nghiên cứu này sử dụng mô hình trạng thái rời (DSMs), một kỹ thuật tin sinh học mạnh mẽ, để phân tích cấu trúc ribosome. DSMs cho phép tích hợp thông tin trình tự và cấu trúc để xây dựng mô hình về các miền protein ribosome. Các mô hình này sau đó được sử dụng để tìm kiếm các đồng họ xa trong cơ sở dữ liệu trình tự protein. Phương pháp DSMs cung cấp một cách tiếp cận hiệu quả để xác định các protein có cấu trúc và chức năng tương tự, ngay cả khi trình tự của chúng có sự khác biệt đáng kể. Bằng cách sử dụng DSMs, nghiên cứu này có thể khám phá các mối quan hệ tiến hóa giữa các protein ribosome khác nhau và hiểu rõ hơn về sự tiến hóa của bộ máy dịch mã.

2.1. Xây Dựng Mô Hình Trạng Thái Rời từ Dữ Liệu Cấu Trúc và Trình Tự

Quá trình xây dựng mô hình trạng thái rời bắt đầu bằng việc thu thập dữ liệu cấu trúc và trình tự của các protein ribosome. Dữ liệu cấu trúc thường được lấy từ Protein Data Bank (PDB), trong khi dữ liệu trình tự được lấy từ các cơ sở dữ liệu trình tự protein. Sau khi dữ liệu được thu thập, nó được xử lý để tạo ra một mô hình trạng thái rời. Mô hình này biểu diễn protein như một chuỗi các trạng thái rời rạc, mỗi trạng thái tương ứng với một phần cụ thể của cấu trúc protein. Xác suất chuyển đổi giữa các trạng thái được tính toán dựa trên tần suất quan sát thấy các chuyển đổi đó trong dữ liệu cấu trúc và trình tự.

2.2. Tìm Kiếm Đồng Họ Xa Bằng Kỹ Thuật Threading và Đánh Giá Mô Hình

Sau khi mô hình DSM được xây dựng, nó được sử dụng để tìm kiếm các đồng họ xa trong cơ sở dữ liệu trình tự protein. Quá trình tìm kiếm sử dụng một kỹ thuật gọi là threading, trong đó trình tự protein được "xâu chuỗi" thông qua mô hình DSM và khả năng tương thích giữa trình tự và mô hình được đánh giá. Các trình tự có khả năng tương thích cao được xác định là đồng họ tiềm năng. Độ tin cậy của mô hình DSM và kết quả tìm kiếm được đánh giá bằng nhiều phương pháp, bao gồm so sánh kết quả với các phương pháp tìm kiếm đồng họ khác và phân tích sự bảo tồn của các miền chức năng trong các đồng họ được xác định.

III. Đặc Trưng Chức Năng Ribosome Phân Tích Tương Tác Protein RNA

Nghiên cứu đã thực hiện phân tích toàn diện về tương tác protein-RNA (RPI) trong ribosome để hiểu rõ hơn về đặc trưng chức năng ribosome. Các tương tác này đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc ribosome, xúc tác quá trình dịch mã và điều chỉnh chức năng ribosome. Phân tích cho thấy rằng các tương tác protein-RNA được bảo tồn cao, đặc biệt là trong các vùng ribosome quan trọng đối với chức năng. Tuy nhiên, cũng có một số lượng đáng kể các tương tác protein-RNA đặc trưng cho một số nhóm sinh vật cụ thể, cho thấy sự thích nghi của ribosome với các nhu cầu chức năng khác nhau.

3.1. Phân Bố Tương Tác Protein RNA trong Các Tiểu Đơn Vị Ribosome

Phân tích cho thấy rằng các tương tác protein-RNA không được phân bố đồng đều giữa các tiểu đơn vị ribosome. Tiểu đơn vị lớn có số lượng tương tác protein-RNA cao hơn so với tiểu đơn vị nhỏ, điều này có thể phản ánh vai trò của tiểu đơn vị lớn trong xúc tác sự hình thành liên kết peptide. Ngoài ra, các tương tác protein-RNA tập trung nhiều hơn trong các vùng ribosome quan trọng đối với chức năng, chẳng hạn như trung tâm peptidyl transferase và trung tâm giải mã. Những vùng này có nồng độ cao các protein ribosome liên kết chặt chẽ với rRNA và cùng nhau đảm bảo chức năng phù hợp của ribosome.

3.2. Tầm Quan Trọng của Tương Tác Protein RNA Đối Với Chức Năng Ribosome

Các tương tác protein-RNA đóng vai trò quan trọng trong nhiều khía cạnh của chức năng ribosome. Chúng góp phần vào sự ổn định của cấu trúc ribosome, đảm bảo rằng ribosome duy trì hình dạng phù hợp để dịch mã chính xác. Các tương tác protein-RNA cũng tham gia vào việc xúc tác quá trình dịch mã, giúp các protein ribosome định vị và liên kết với rRNA một cách chính xác để hình thành liên kết peptide. Ngoài ra, các tương tác protein-RNA có thể điều chỉnh chức năng ribosome bằng cách ảnh hưởng đến sự liên kết của các yếu tố dịch mã và khả năng tiếp cận của mRNA với ribosome. Việc phân tích các tương tác này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế dịch mã phức tạp và sự điều hòa của ribosome trong các điều kiện khác nhau.

IV. Ý Nghĩa Tiến Hóa Cấu Trúc Ribosome Từ Archaea Đến Eukaryote

Nghiên cứu chỉ ra rằng cấu trúc ribosome có những ý nghĩa tiến hóa quan trọng. Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng ribosome của Archaea và Eukaryote có chung một tổ tiên chung, trong khi ribosome của Bacteria đã phân nhánh từ một tổ tiên khác. Sự khác biệt về cấu trúc giữa ribosome của các nhóm sinh vật khác nhau phản ánh sự thích nghi với các điều kiện môi trường và nhu cầu chức năng khác nhau. Đáng chú ý, ribosome của Eukaryote có chứa các protein ribosome đặc trưng không tìm thấy trong Bacteria hoặc Archaea, cho thấy sự tiến hóa của các chức năng ribosome mới ở Eukaryote.

4.1. Nguồn Gốc Archaea của Bộ Máy Dịch Mã Eukaryote

Bằng chứng thu được từ phân tích cấu trúc và trình tự ủng hộ giả thuyết rằng bộ máy dịch mã của Eukaryote có nguồn gốc từ Archaea. Nhiều protein ribosome được tìm thấy ở Eukaryote có đồng họ gần gũi nhất ở Archaea, cho thấy sự chuyển giao gen theo chiều ngang từ Archaea sang Eukaryote trong quá trình tiến hóa. Điều này phù hợp với các bằng chứng khác cho thấy rằng Eukaryote đã tiến hóa từ một sự kiện nội cộng sinh giữa một Archaea và một Bacteria.

4.2. Sự Thích Nghi Của Ribosome Với Môi Trường và Nhu Cầu Chức Năng

Sự khác biệt về cấu trúc ribosome giữa các nhóm sinh vật khác nhau phản ánh sự thích nghi với các điều kiện môi trường và nhu cầu chức năng khác nhau. Ví dụ, ribosome của vi khuẩn chịu nhiệt có cấu trúc ổn định hơn để chịu được nhiệt độ cao. Tương tự, ribosome của Eukaryote có các protein ribosome bổ sung liên quan đến việc điều chỉnh quá trình dịch mã và tương tác với các yếu tố tế bào khác. Những sự thích nghi này cho phép ribosome hoạt động hiệu quả trong nhiều môi trường và thực hiện nhiều chức năng hơn.

V. Ứng Dụng Tìm Kiếm Đồng Họ WD40 Repeat và Ubiquitin Like

Phương pháp DSMs đã được áp dụng thành công để tìm kiếm đồng họ xa của các miền protein ribosome, cụ thể là miền WD40-repeat và ubiquitin-like. Kết quả cho thấy rằng các miền này có mặt trong nhiều protein ribosome khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong chức năng ribosome. Việc tìm kiếm các đồng họ xa giúp xác định các protein ribosome mới và hiểu rõ hơn về vai trò của chúng trong quá trình dịch mã.

5.1. Xác Định Các Protein Chứa Miền WD40 Repeat trong Ribosome

Miền WD40-repeat là một miền protein phổ biến được tìm thấy trong nhiều protein Eukaryote và tham gia vào nhiều chức năng khác nhau, bao gồm tương tác protein-protein và truyền tín hiệu. Nghiên cứu đã xác định một số protein ribosome có chứa miền WD40-repeat, cho thấy rằng miền này có thể đóng vai trò trong việc lắp ráp ribosome, điều chỉnh chức năng ribosome hoặc tương tác với các yếu tố tế bào khác. Phân tích cho thấy rằng các miền WD40-repeat trong protein ribosome có cấu trúc tương tự như các miền WD40-repeat trong các protein khác, cho thấy rằng chúng có chung một tổ tiên tiến hóa.

5.2. Vai Trò Của Miền Ubiquitin Like trong Cấu Trúc và Chức Năng Ribosome

Miền ubiquitin-like là một miền protein nhỏ có cấu trúc tương tự như ubiquitin và tham gia vào nhiều quá trình tế bào khác nhau, bao gồm thoái hóa protein, sửa đổi protein và truyền tín hiệu. Nghiên cứu đã xác định một số protein ribosome có chứa miền ubiquitin-like, cho thấy rằng miền này có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh chức năng ribosome hoặc thoái hóa các protein ribosome bị hư hỏng. Nghiên cứu của Favaretto đã xác định một số domain ubiquitin-like trong protein ribosome, cho thấy vai trò trong thoái hóa protein (Protein Degradation) và điều hòa chức năng ribosome.

VI. Kết Luận và Tương Lai Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Tiến Hóa Ribosome

Nghiên cứu này cung cấp một cái nhìn sâu sắc về cấu trúc ribosome, chức năng, tiến hóa và các mối quan hệ giữa protein ribosome và RNA ribosome. Việc sử dụng phương pháp DSMs đã cho phép xác định các đồng họ xa và hiểu rõ hơn về sự tiến hóa của bộ máy dịch mã. Nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá các chức năng của các protein ribosome mới được xác định và điều tra các cơ chế điều chỉnh chức năng ribosome trong các điều kiện khác nhau. Những nỗ lực này sẽ góp phần vào sự hiểu biết sâu sắc hơn về ribosome và vai trò của nó trong sinh học tế bào.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Phân Tích Đột Biến và Bệnh Liên Quan

Một hướng nghiên cứu quan trọng trong tương lai là phân tích đột biến ribosome và mối liên hệ của chúng với các bệnh liên quan đến ribosome. Đột biến trong protein ribosome có thể dẫn đến nhiều rối loạn di truyền, bao gồm thiếu máu Diamond-Blackfan và hội chứng Treacher Collins. Bằng cách nghiên cứu tác động của các đột biến này đối với cấu trúc và chức năng ribosome, chúng ta có thể hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh và phát triển các phương pháp điều trị mới.

6.2. Ứng Dụng Tin Sinh Học trong Nghiên Cứu Cấu Trúc và Tiến Hóa

Việc sử dụng các công cụ tin sinh học, chẳng hạn như DSMs, sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu cấu trúc và tiến hóa ribosome. Các phương pháp này cho phép phân tích dữ liệu cấu trúc và trình tự ở quy mô lớn và xác định các mối quan hệ và mô hình tiến hóa mà khó có thể phát hiện bằng các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc phát triển các công cụ tin sinh học mới và cải tiến để phân tích cấu trúc ribosome và hiểu rõ hơn về sự tiến hóa của bộ máy dịch mã.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu của tác giả Paola Favaretto tập trung phân tích bộ máy dịch mã protein với trọng tâm là ribosome và các protein liên kết, được thực hiện trong bối cảnh các cấu trúc tinh thể của tiểu đơn vị ribosome được giải đoán cùng với sự gia tăng dữ liệu hệ gen hoàn chỉnh từ ba vực phát sinh loài sinh giới: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thực (Eukarya).

Tính cấp thiết của luận án xuất phát từ nhu cầu hiểu rõ cách thức bộ máy dịch mã phân tử phức tạp này tiến hóa đến cấu hình hiện tại. Dù đóng vai trò cốt lõi trong mọi sinh vật sống, cấu trúc chuỗi, tương tác không gian và lịch sử tiến hóa của các thành phần protein trong ribosome qua các phân loại sinh học vẫn còn những khoảng trống lớn, đặc biệt là việc thiếu một phân tích so sánh đa cấp độ (chuỗi, cấu trúc và chức năng) và công cụ tính toán đủ nhạy để nhận diện các tương đồng xa ở các vùng bảo tồn nhỏ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung cụ thể:

1. Đặc trưng hóa các đặc điểm chức năng, cấu trúc và trình tự của các protein liên quan đến quá trình dịch mã trên cả ba vực phát sinh loài (Bacteria, Archaea và Eukarya).
2. Phân tích phát sinh loài của các protein liên quan đến dịch mã và rút ra các hàm ý tiến hóa của chúng, tập trung vào nguồn gốc của sinh vật nhân thực.
3. Thiết kế và triển khai một công cụ tính toán mới dựa trên mô hình trạng thái rời rạc (Discrete State Models - DSMs), tích hợp thông tin trình tự và cấu trúc để xác định các vùng tương đồng xa của các đoạn hoặc khối bảo tồn nhỏ trong các protein dịch mã.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 102 họ protein ribosome (gồm 40 protein thuộc tiểu đơn vị nhỏ 30S và 62 protein thuộc tiểu đơn vị lớn 50S), các phân tử RNA ribosome (16S, 23S, 5S, 18S, 28S, 5.8S), các yếu tố dịch mã (các yếu tố khởi đầu IF1, IF2, IF3, eIFs; các yếu tố kéo dài EF-Tu/EF1, EF-G/EF2; các yếu tố kết thúc RF1, RF2, eRF1; yếu tố tái chế RRF), các protein chaperone liên kết (Trigger Factor, DnaK, Hsp70, Hsp40, phức hợp SRP, translocon Sec), cùng hai họ protein kiểm chứng là WD40-repeat và Ubiquitin / Ubiquitin-like.
• Phạm vi dữ liệu: Dữ liệu chuỗi và cấu trúc từ các cơ sở dữ liệu sinh học Swiss-Prot, GenBank, TIGR và Protein Data Bank (PDB). Dữ liệu bao trùm 13 loài Eukarya (Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi, Entamoeba histolytica, Guillardia theta, Giardia lamblia, Homo sapiens sapiens, Ictalurus punctatus, Oryza sativa, Plasmodium falciparum, Schizosaccharomyces pombe, Tetrahymena sp.), 12 loài Archaea (Archaeoglobus fulgidus, Aeropyrum pernix, Haloarcula marismortui, Methanococcus jannaschii, Methanopyrus kandleri, Methanosarcina mazei, Methanobacterium thermoautotrophicum, Nanoarchaeum equitans, Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus, Thermoplasma acidophilum) và 14 loài Bacteria (Aquifex aeolicus, Bacillus subtilis, Caulobacter crescentus, Chlorobium tepidum, Chlamydia trachomatis, Deinococcus radiodurans, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Helicobacter pylori, Streptomyces coelicolor, Synechocystis sp. PCC 6803, Thermotoga maritima, Thermus thermophilus, Treponema pallidum).
• Thời gian và địa điểm hoàn thành: Luận án Tiến sĩ ngành Kỹ thuật Y sinh (Biomedical Engineering), hoàn thành năm 2007 tại College of Engineering, Đại học Boston (Boston University), Hoa Kỳ.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại các hướng nghiên cứu nền tảng trước đó trong lĩnh vực sinh học cấu trúc ribosome, tiến hóa phân tử và tin sinh học:

• Cấu trúc không gian của ribosome: Các công trình giải mã cấu trúc tinh thể của tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn ribosome từ Ban et al. (2000), Wimberly et al. (2000), Schluenzen et al. (2000), Harms et al. (2001), Yusupov et al. (2001), Nissen et al. (2000), Ramakrishnan và cộng sự (2000, 2002), Steitz và cộng sự (2000, 2001, 2004), Moore (2001), Yonath và cộng sự (2001).
• Cấu trúc bậc hai đồng thuận của rRNA: Nghiên cứu so sánh chuỗi rRNA từ hàng trăm loài của Gutell et al. (1993, 1994, 2002), Cannone et al. (2002) xác lập mô hình 4 domain cho 16S rRNA (~45 helices) và 6 domain cho 23S rRNA (~100 helices).
• Phân loại và phân bố protein ribosome: Công trình của Lecompte et al. (2002) thiết lập phân loại protein ribosome theo vực phát sinh loài; các nghiên cứu so sánh bộ gen hoàn chỉnh của Koonin et al. (2001) và Kyrpides et al. (1999) chỉ ra các protein ribosome và nhân tố dịch mã thuộc số ít các protein bảo tồn phổ quát ở mọi sinh vật.
• Cơ chế dịch mã và yếu tố dịch mã: Các nghiên cứu về khởi đầu, kéo dài, kết thúc và tái chế dịch mã của Rodnina et al. (2000), Ramakrishnan et al. (2002), Kisselev et al. (2003), Janosi et al. (1996, 1998), Kaji et al. (2001), Agrawal et al. (2004), cùng các nghiên cứu về kháng sinh ức chế (pulvomycin, kirromycin, fusidic acid, sordarin).
• Hệ thống chaperone trong dịch mã: Các công trình của Hartl et al. (2002), Bukau et al. (2000), Horwich et al. (2002), Craig et al. (2003), Walter et al. (2000), Keenan et al. (2001), Luirink et al. (2001), Rapoport et al. (2001), Wickner et al. (1999).
• Công trình sơ khởi về gióng hàng chuỗi prokaryote: Nghiên cứu của Prashanth Vishwanath (2004) tại Trung tâm Nghiên cứu Kỹ thuật Sinh phân tử (BMERC) thuộc Đại học Boston về gióng hàng chuỗi prokaryote của protein ribosome tiểu đơn vị nhỏ.

Khoảng trống học thuật mà luận án lựa chọn giải quyết là mở rộng phân tích sang toàn bộ chuỗi sinh vật nhân thực (Eukarya), các protein đặc thù Archaea-Eukarya và các yếu tố dịch mã; làm rõ bản chất cấu trúc khối bảo tồn theo đơn vị phân loại (taxon-specific block structure); giải thích cơ chế chức năng của các protein ribosome đối với sự gấp cuộn của rRNA; đồng thời xây dựng một công cụ tìm kiếm tương đồng xa có khả năng phát hiện các đoạn motif ngắn dựa trên sự kết hợp giữa cấu trúc và chuỗi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp các cơ sở lý thuyết về tiến hóa phân tử, cấu trúc sinh học và xác suất thống kê:

• Lý thuyết cấu trúc khối phân loại đặc thù (Taxon-specific Block Structure): Trình tự amino acid của các protein ribosome được tổ chức thành các khối bảo tồn (blocks) có độ dài xác định, phản ánh các giai đoạn tiến hóa khác nhau trước và sau sự phân tách của các vực sinh giới.
• Lý thuyết hạn chế không gian cấu hình của rRNA: Protein ribosome không đóng vai trò xúc tác trực tiếp tại tâm peptidyl transferase mà hoạt động như các phân tử chaperone cấu trúc nhằm thu hẹp không gian cấu hình tự do và ổn định nếp gấp bậc ba bản địa của rRNA.
• Lý thuyết mô hình trạng thái rời rạc (Discrete State-space Models - DSMs): Mô hình hóa không gian trạng thái chuỗi - cấu trúc của protein bằng các lớp trạng thái rời rạc và ma trận chuyển tiếp Markov, sử dụng kỹ thuật luồn chuỗi (Markov threading) và tính tỷ số log-likelihood (LLR) theo khuôn khổ xác suất Bayes.

Phương pháp nghiên cứu cụ thể:

• Thu thập dữ liệu chuỗi: Khởi đầu từ bộ dữ liệu chuẩn Swiss-Prot của ba sinh vật mô hình (E. coli đại diện cho Bacteria, M. jannaschii đại diện cho Archaea, S. cerevisiae đại diện cho Eukarya). Sử dụng thuật toán BLAST và PSI-BLAST của Altschul et al. (1990, 1997) và Schaffer et al. (2001) để truy vấn mở rộng trên GenBank và TIGR.
• Phương pháp gióng hàng đa chuỗi: Kết hợp phương pháp dựa trên profile PIMA (Smith & Smith, 1990, 1992) và phương pháp gióng hàng lũy tiến CLUSTALW (Thompson et al., 1994).
• Quy trình tinh chỉnh gióng hàng thủ công:
  • Xác định cấu trúc bậc hai cho từng gốc amino acid bằng phần mềm DSSP (Kabsch & Sander, 1983) hoặc JPred (Cuff et al., 1998).
  • Tinh chỉnh vị trí chèn khoảng trống (gap) giới hạn vào các vùng vòng (loops) và duy trì sự bảo tồn của các lớp hóa lý amino acid theo Bảng 2.2:

Lớp amino acid	Các amino acid cấu thành	Đặc tính hóa lý / vai trò
ILV	I, L, V	Phân nhánh (Branched)
FWY	F, W, Y	Thơm (Aromatic)
AILMVFWYC	A, I, L, M, V, F, W, Y, C	Kỵ nước (Hydrophobic)
AGS	A, G, S	Kích thước nhỏ (Small)
ST	S, T	Cho liên kết hydro (Hydrogen donors)
GNP	G, N, P	Xu hướng tạo khúc quanh cao (High turn-propensity)
DE	D, E	Điện tích âm (Negative charge)
KR	K, R	Điện tích dương hoàn toàn (Full positive charge)
KRH	K, R, H	Điện tích dương (Positive charge)
DENQ	D, E, N, Q	Nhóm amide và acid (Amide and Acidic)
DENQHKR	D, E, N, Q, H, K, R	Phân cực (Polar)
DENQHKRST	D, E, N, Q, H, K, R, S, T	Ưa nước (Hydrophilic)
GP	G, P	Vai trò cấu trúc (Structural role)
CH	C, H	Vai trò chức năng (Functional role)

• Phân tích tương tác không gian và nếp gấp: Sử dụng phần mềm dự đoán cấu trúc bậc hai RNA mfold (Zuker, 2003) và hệ thống tính điểm fold prediction scoring scheme để mô phỏng sự gấp cuộn của 16S và 23S rRNA khi áp đặt các ràng buộc protein ribosome.
• Xây dựng và đánh giá thuật toán DSMs: Triển khai công cụ Markov threading để ước lượng xác suất hậu nghiệm, kiểm chứng độ nhạy và độ đặc hiệu trên các tập dữ liệu PDB của họ WD40-repeat và Ubiquitin-like.

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1: Introduction

Chương 1 trình bày tổng quan về bộ máy dịch mã protein, cấu trúc tiểu đơn vị ribosome và các nhân tố hỗ trợ. Quá trình dịch mã được chia thành 4 giai đoạn: khởi đầu (initiation), kéo dài (elongation), kết thúc (termination) và tái chế (recycling).

• Ở vi khuẩn, phức hợp khởi đầu gồm 3 nhân tố IF1, IF2, IF3 với sự hỗ trợ của trình tự bắt cặp Shine-Dalgarno tại đầu 3' của 16S rRNA; trong khi ở Eukarya cần hơn 12 nhân tố eIFs.
• Giai đoạn kéo dài sử dụng EF-Tu (EF1 ở Archaea/Eukarya) liên kết aminoacyl-tRNA và GTP vào vị trí A, và EF-G (EF2) xúc tác chuyển vị trí tRNA từ A và P sang P và E. Các kháng sinh như pulvomycin, kirromycin ức chế EF-Tu, còn fusidic acid và sordarin ức chế EF-G/EF2.
• Giai đoạn kết thúc sử dụng RF1 và RF2 ở sinh vật nhân sơ, eRF1 ở Eukarya; sau đó yếu tố tái chế ribosome RRF tham gia phân tách phức hợp.
• Hệ thống chaperone (Trigger Factor, DnaK, Hsp70, Hsp40, SRP, translocon Sec) hỗ trợ chuỗi polypeptide mới sinh gấp cuộn chính xác và định vị qua màng.

Chapter 2: Taxon-specific Block Structure in Ribosomal Proteins

Chương 2 phân tích tập hợp 102 protein ribosome (40 protein ở 30S và 62 protein ở 50S). Phân loại theo 3 vực sinh giới gồm: 34 protein phổ quát (UN), 33 protein đặc thù Archaea-Eukarya (AE), 11 protein đặc thù Eukarya (EE), 23 protein đặc thù Bacteria (BB) (loại trừ protein Lxa do dữ liệu chưa đủ).

Phân loại protein ribosome	Tiểu đơn vị nhỏ (30S)	Tiểu đơn vị lớn (50S)	Tổng số protein
Phổ quát cả 3 vực (UN)	15 (S2, S4, S5, S7, S8, S9, S10, S11, S12, S13, S14, S15, S17, S19, S18/S13-like)	19 (L1, L2, L3, L4/L4e, L5, L6, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L18, L22, L23, L24, L29, L30, L36)	34
Đặc thù Archaea - Eukarya (AE)	17 (S3ae, S4e, S6e, S7e, S8e, S10e, S12e, S17e, S19e, S21e, S24e, S25e, S26e, S27ae, S27e, S28e, S30e)	16 (L6e, L7ae, L10e, L13e, L14e, L15e, L18ae, L18e, L19e, L21e, L22e, L24e, L30e, L31e, L32e, L34e, L35ae, L37ae, L37e, L38e, L39e, L40e, L41e, L44e)	33
Đặc thù Vi khuẩn (BB)	7 (S1, S6, S16, S18, S20, S21, S22)	16 (L9, L16, L17, L19, L20, L21, L25, L27, L28, L31, L32, L33, L34, L35, L36)	23
Đặc thù Eukarya (EE)	1 (S31e)	10 (L27e, L28e, L29e, L36e...)	11

Gióng hàng đa chuỗi phát hiện cấu trúc khối (block structure) phân tách rõ ràng:

• Chiều dài khối: Biến thiên từ 6 đến 170 amino acid. Trong tập protein phổ quát UN, khối phổ quát (uu) có chiều dài trung bình 50 amino acid, dài hơn khối đặc thù Archaea-Eukarya (ae: 30 aa), khối đặc thù Eukarya (ee: 30 aa) và khối đặc thù Bacteria (bb: 20 aa). Trong tập protein AE, các khối chung (ae) đạt chiều dài trung bình 67 amino acid ở tiểu đơn vị lớn.
• Số lượng khối: Mỗi protein UN chứa trung bình khoảng 2,1 khối phổ quát (uu). Tỷ lệ thành phần khối trong mỗi tiểu đơn vị gồm: ~40% khối phổ quát (uu), ~20% khối đặc thù vi khuẩn (bb), 25-30% khối đặc thù Archaea-Eukarya (ae), và 10-15% khối đặc thù Eukarya (ee).
• Vị trí khối: Khối phổ quát phân bố dọc theo toàn bộ chiều dài chuỗi. Các khối đặc thù Eukarya (ee) tập trung nhiều ở đầu mút N và C (tổng cộng xác định được 1783 vị trí khối ee, gồm 630 vị trí trong tập UN và 1153 vị trí trong tập AE).
• Đặc trưng bảo tồn và thông tin: Trong tập UN, số vị trí bảo tồn cao (≥90% các loài) trung bình đạt 50 vị trí ở Eukarya, 40 vị trí ở Archaea, 35 vị trí ở Bacteria. Cặp Eukarya-Archaea chia sẻ trung bình 20 vị trí bảo tồn; Archaea-Bacteria chia sẻ 10 vị trí; Eukarya-Bacteria chia sẻ 10 vị trí. Số vị trí mang thông tin (informative positions) trung bình đạt 273 vị trí/protein ở 50S và 210 vị trí/protein ở 30S, chiếm hơn 3/4 độ dài gióng hàng.
• Phân bố cấu trúc không gian: Protein phân bố bất đối xứng trên ribosome. Ở 30S, protein tập trung ở mặt sau và vùng đầu (S2, S3, S7, S9, S10, S13, S14, S19). Ở 50S, protein phân bố ở mặt sau, tập trung cao ở vùng liên kết nhân tố dịch mã (L3, L6, L10, L11, L12, L14) và vùng lối ra của đường hầm polypeptide (L19e, L22, L23, L24, L29, L31e, L39e), trong khi tâm peptidyl transferase và mặt tiếp diện giữa hai tiểu đơn vị hầu như không có protein.

Chapter 3: Functional Analysis of Ribosomal Proteins

Chương 3 đánh giá vai trò cấu trúc và chức năng chaperone của protein ribosome đối với sự gấp cuộn của rRNA (16S rRNA với 4 domain, ~45 helices; 23S rRNA với 6 domain, ~100 helices).

• Khi áp đặt các ràng buộc liên kết của từng protein ribosome riêng lẻ (individual protein constraints) và lộ trình liên kết tự lắp ráp (binding pathway constraints) vào phần mềm mfold, số lượng nếp gấp bậc hai dự đoán giảm rõ rệt so với chuỗi RNA tự do.
• Ràng buộc protein ribosome giúp cố định các vị trí tương tác tầm xa, thu hẹp không gian cấu hình tự do và dẫn dắt rRNA đạt được nếp gấp bậc ba bản địa cốt lõi phổ quát.
• Các thử nghiệm thay thế cặp base (canonical, non-canonical base pairs) và thay thế tại vị trí đóng tetraloop G:C cho thấy độ ổn định và tính chính xác của nếp gấp rRNA phụ thuộc vào việc bảo tồn các điểm tiếp xúc với protein ribosome.

Chapter 4: Discrete State Models for Distant Homology Search of Ribosomal Blocks

Chương 4 thiết kế và triển khai mô hình trạng thái rời rạc (Discrete State-space Models - DSMs) để nhận diện các vùng tương đồng xa của các khối protein nhỏ:

• Mô hình tích hợp trạng thái chuỗi amino acid và cấu trúc không gian, tính toán điểm số Log Likelihood Ratio (LLR) qua kỹ thuật luồn chuỗi Markov (Markov threading).
• Kiểm chứng trên họ protein lặp WD40-repeat: DSMs nhận diện chính xác ranh giới các module lặp trên chuỗi PDB 1GXRA, 1GKR và quét trên toàn bộ hệ gen nấm men S. cerevisiae, xác định các protein chứa domain WD40 mà phương pháp profile truyền thống không phát hiện được.
• Kiểm chứng trên siêu họ Ubiquitin và Ubiquitin-like (UBLs): mô hình ubi9 phân biệt chính xác ubiquitin đơn lẻ, chuỗi đa ubiquitin nối tiếp (polyubiquitin YLL039C), protein tiền chất dung hợp với protein ribosome L40e (YIL148W) và protein liên quan RUB1 (YDR139C) trên các hệ gen đại diện.
• Áp dụng DSMs để truy tìm các vùng tương đồng xa của các khối protein ribosome trên quy mô các hệ gen sinh vật.

Chapter 5: Discussion

Chương 5 thảo luận các kết quả và rút ra các kết luận tiến hóa:

• Tổ tiên chung và nguồn gốc sinh vật nhân thực: Các khối phổ quát (uu) là bằng chứng về tổ tiên chung phổ quát (LUCA). Sự tương đồng cấu trúc khối chặt chẽ giữa Archaea và Eukarya (toàn bộ khối của Archaea trong tập UN đều có mặt ở Eukarya, thiếu vắng các khối đặc thù chung giữa Archaea và Bacteria) củng cố giả thuyết nguồn gốc nội cộng sinh từ ngành Crenarchaea của bộ máy dịch mã sinh vật nhân thực.
• Hiện tượng thắt cổ chai tiến hóa: Sự phân tách khối rõ nét và sự suy giảm tính đa dạng tổ tiên chỉ ra sự kiện thắt cổ chai prokaryote (prokaryotic bottleneck) xảy ra khoảng 2,2 tỷ năm trước.
• Bản chất tương tác: Các khối bảo tồn cao không tương ứng với một tâm hoạt tính hóa học cục bộ riêng lẻ, mà hoạt động phối hợp để duy trì cấu hình không gian toàn thể và ổn định lõi rRNA.

Kết quả và những đóng góp mới

1. Phát hiện cấu trúc khối phân loại đặc thù (Taxon-specific Block Structure): Luận án chứng minh rằng các protein ribosome không tiến hóa đồng nhất trên toàn bộ chiều dài chuỗi mà được cấu tạo từ các khối module có độ dài từ 6 đến 170 amino acid với lịch sử tiến hóa phân kỳ rõ rệt giữa ba vực sinh giới.
2. Cung cấp bằng chứng tiến hóa phân tử về nguồn gốc Eukarya: Phân tích định lượng cấu trúc khối và các vị trí bảo tồn xác lập mối liên hệ phát sinh loài trực tiếp giữa bộ máy dịch mã của Eukarya và Archaea (cụ thể là Crenarchaea), hỗ trợ mô hình nguồn gốc nội cộng sinh và xác định dấu vết của sự kiện thắt cổ chai prokaryote cách đây khoảng 2,2 tỷ năm.
3. Làm sáng tỏ cơ chế chức năng của protein ribosome đối với rRNA: Chứng minh bằng mô phỏng tính toán rằng vai trò cốt lõi của protein ribosome là chaperone cấu trúc, áp đặt các ràng buộc vật lý để giới hạn không gian cấu hình tự do và dẫn hướng cho rRNA gấp cuộn chính xác vào nếp gấp lõi bản địa.
4. Xây dựng công cụ tính toán DSMs và Markov Threading: Phát triển phương pháp mô hình trạng thái rời rạc kết hợp chuỗi và cấu trúc, giải quyết được bài toán nhận diện các domain ngắn, các motif lặp (WD40) và siêu họ đa dạng cao (Ubiquitin/UBLs, ribosomal blocks) mà các công cụ thông thường bỏ sót.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Tại thời điểm thực hiện (2007), dữ liệu cấu trúc tinh thể độ phân giải nguyên tử của ribosome sinh vật nhân thực bậc cao còn hạn chế.
  • Bản đồ mật độ điện tử của tiểu đơn vị 50S ở Haloarcula marismortui bị khuyết mật độ rõ nét tại các protein L1, L10, L11, L12 (vùng stalk L1 và L7/L12), buộc phải suy luận vị trí từ các nghiên cứu độ phân giải thấp.
  • Protein Lxa phải loại trừ khỏi phân tích do dữ liệu chuỗi chưa đầy đủ và vị trí phân loại chưa thống nhất.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Ứng dụng mô hình DSMs đã thiết lập để tìm kiếm tương đồng xa trên toàn bộ các cơ sở dữ liệu hệ gen mới được giải trình tự hoàn chỉnh.
  • Mở rộng phân tích cấu trúc khối cho các phức hợp đại phân tử protein-RNA và các hệ thống enzyme đa tiểu đơn vị khác trong tế bào.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho:

• Nghiên cứu sinh và nhà nghiên cứu Tin sinh học / Sinh học tính toán: Cung cấp phương pháp luận chi tiết về gióng hàng đa chuỗi kết hợp thông tin cấu trúc bậc hai (DSSP, JPred), kỹ thuật phân loại amino acid và thuật toán mô hình trạng thái rời rạc DSMs kết hợp Markov threading.
• Nhà nghiên cứu Tiến hóa phân tử và Cổ sinh học phân tử: Cung cấp số liệu thống kê chi tiết về các vị trí bảo tồn, vị trí mang thông tin và luận cứ về nguồn gốc phát sinh loài của Eukarya từ Crenarchaea và sự kiện thắt cổ chai 2,2 tỷ năm trước.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu Sinh học cấu trúc / Hóa sinh: Cung cấp khung phân tích về tương tác protein-rRNA và cơ chế chaperone hạn chế không gian cấu hình trong sự tự lắp ráp của ribosome.

Câu hỏi thường gặp

1. Cấu trúc khối (block structure) của protein ribosome được phân loại thành những dạng nào và chiều dài trung bình ra sao?
Cấu trúc khối gồm: khối phổ quát bảo tồn ở cả 3 vực (uu, chiều dài trung bình ~50 amino acid trong tập UN), khối đặc thù Archaea-Eukarya (ae, trung bình ~30 amino acid trong tập UN và ~67 amino acid ở tiểu đơn vị lớn tập AE), khối đặc thù Eukarya (ee, trung bình ~30 amino acid), khối đặc thù Bacteria (bb, trung bình ~20 amino acid) và khối đặc thù Archaea (aa). Các khối có độ dài từ 6 đến 170 amino acid với ranh giới chuyển tiếp rõ ràng.

2. Luận án đưa ra những hàm ý tiến hóa chính nào từ cấu trúc khối protein ribosome?
Luận án chỉ ra hai hàm ý tiến hóa lớn: (i) Nguồn gốc nội cộng sinh từ ngành Crenarchaea của bộ máy dịch mã sinh vật nhân thực hiện đại; (ii) Sự xuất hiện của một hiện tượng thắt cổ chai prokaryote (prokaryotic bottleneck) xảy ra khoảng 2,2 tỷ năm trước, làm suy giảm mạnh mẽ tính đa dạng của các tổ tiên loài hiện đại.

3. Vai trò chính của protein ribosome đối với rRNA được luận án kết luận là gì?
Protein ribosome không đóng vai trò xúc tác hóa học trực tiếp tại tâm peptidyl transferase mà hoạt động như các yếu tố chaperone cấu trúc, tạo các điểm tiếp xúc vật lý nhằm hạn chế không gian cấu hình tự do của rRNA, giúp ổn định và dẫn dắt rRNA gấp cuộn chính xác vào cấu trúc lõi bản địa được bảo tồn phổ quát.

4. Phương pháp Discrete State Models (DSMs) được kiểm chứng trên những đối tượng protein nào ngoài ribosome?
DSMs được kiểm chứng trên hai hệ thống protein phức tạp: (i) Họ protein chứa domain lặp WD40-repeat (kiểm chứng trên cấu trúc 1GXRA, 1GKR và toàn bộ hệ gen nấm men S. cerevisiae); (ii) Siêu họ Ubiquitin và Ubiquitin-like (kiểm chứng trên mô hình ubi9, phân lập ubiquitin đơn lẻ, chuỗi đa ubiquitin YLL039C, protein dung hợp ribosome L40e YIL148W và protein RUB1 YDR139C).

5. Luận án đã khảo sát bao nhiêu protein ribosome và phân bố giữa các tiểu đơn vị như thế nào?
Luận án khảo sát tổng cộng 102 protein ribosome (40 protein ở tiểu đơn vị 30S và 62 protein ở tiểu đơn vị 50S), bao gồm 34 protein phổ quát cả 3 vực (UN), 33 protein đặc thù Archaea-Eukarya (AE), 23 protein đặc thù Bacteria (BB) và 11 protein đặc thù Eukarya (EE).

Kết luận

Luận án của Paola Favaretto đã hoàn thành phân tích so sánh đa cấp độ về trình tự, cấu trúc và chức năng của 102 protein ribosome trên cả ba vực sinh giới. Nghiên cứu đã phát hiện và định lượng hiện tượng cấu trúc khối phân loại đặc thù, cung cấp bằng chứng phân tử ủng hộ nguồn gốc nội cộng sinh Crenarchaea của bộ máy dịch mã nhân thực và biến cố thắt cổ chai tiến hóa 2,2 tỷ năm trước. Đồng thời, công trình chứng minh vai trò chaperone cấu trúc của protein ribosome trong việc hạn chế không gian cấu hình của rRNA và phát triển thành công công cụ Discrete State Models (DSMs) phục vụ tìm kiếm tương đồng xa cho các domain và motif protein ngắn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOSTON UNIVERSITY COLLEGE OF ENGINEERING Dissertation ANALYSIS OF RIBOSOMAL PROTEIN BLOCK STRUCTURE: FUNCTIONAL CHARACTERIZATION, EVOLUTIONARY IMPLICATIONS AND DISTANT HOMOLOGY SEARCH USING DISCRETE STATE MODELS PAOLA FAVARETTO Laurea Degree, Universita’ degli Studi di Padova, Italy, 2001 Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 2007 UMI Number: 3246605 INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion.

® UMI UMI Microform 3246605 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved. This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P.

Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 Approved by First Reader: CLG 7 GR 22 Temple F. Professor of Biomedical Engineering Second Reader: Ses C Dh. Scott Mohr, Ph. Professor of Chemistry Third Reader: Hyman Hartman, Ph.

Professor of Biology Fourth Reader: — Sandor Vajda, Ph. kẽ Professor of Biomedical Engineering Acknowledgments I would like to express deep gratitude to my advisor, Professor Temple F. Smith, for his guidance and support during the completion of this project. His unending drive and extraordinary enthusiasm for science have been of great inspiration and motivation in my work.

Iam grateful to Professor Scott C. Mohr for his thoughtful advice and encouraging help, especially in the early stage of the project. His meticulous work and rigorous attitude have shown me the importance of details and analytical thinking. Iam indebted to Professor Hyman Hartman for his important contribution to the project and his constant interest in my work.

His comments and insights were always very much appreciated. I would like to acknowledge Professor Sandor Vajda and Professor Lucia M. Vaina for serving on my Ph. committee, and Professor Jadwiga Bienkowska for serving on the prospectus committee.

My appreciation goes to all the members of the BioMolecular Engineering Research Cen- ter for their friendship and numerous stimulating conversations: Arjun Bhutkar, Prashant Vishwanath, Kavitha Venkatesan, Filiz Aslan, Hongxian He, Esther Epstein, Nancy Sands and Sean Quinlan. I would also like to thank my parents for always believing in me and for giving me the HH opportunity to pursue my goals. Finally, I would like to thank my husband Atul for his profound support and immense help throughout the completion of this degree. He has been a constant source of strength and encouragement, and I am honored to have him in my life.

iv ANALYSIS OF RIBOSOMAL PROTEIN BLOCK STRUCTURE: FUNCTIONAL CHARACTERIZATION, EVOLUTIONARY IMPLICATIONS AND DISTANT HOMOLOGY SEARCH USING DISCRETE STATE MODELS (Order No. ) PAOLA FAVARETTO Boston University College of Engineering, 2007 Major Professor: Temple F. Smith, Professor of Biomedical Engineering ABSTRACT The ribosome, a very complex molecular machine, plays a fundamental role in all liv- ing organisms and exhibits extraordinary engineering design concepts. This investigation examined the complexity of the translational apparatus, seeking to understand how its com- ponents evolved to their present configuration.

It includes detailed sequence and structural comparative analyses of the ribosome and its associated proteins with functional character- ization of these components across the three phylogenetic domains. Amino acid sequence alignments of ribosomal proteins revealed an unusual taxon-specific block structure, with some blocks universally conserved and others specific to one or two phylogenetic domains. Statistical and phylogenetic analyses of the universal blocks imply that modern Bacteria, Archaea and Eukarya clearly have a common ancestor, while the phylodomain-specific blocks suggest that these groups also share more recent, taxon-specific cenancestors. Major evolutionary implications of the observed block structure are: (7) the crenarchaeal, endosymbiotic origin of the modern eukaryotic translational apparatus; and (it) the occurrence of a prokaryotic bottleneck that drastically reduced the diversity of modern species progenitors about 2.2 billion years ago.