Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo 1.1 Nguồn gốc và phân bố Dạ yến thảo vốn là loài đặc hữu của Nam Mỹ, phân bồ chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới với nhiệt độ từ 22°C - 39°C. Sự đa dạng về loài chủ yếu tìm thấy ở vùng Serra của Brazil, nơi tìm thấy loài Petunia integrifolia và Petunia axillaris được xem là nguồn gốc của Petunia hybrida (Dạ yến thảo), ngoài ra Petunia còn được tìm thay ở nhiều Argentia, Uruguay, Paraguay va Bolivia (Joao và ctv, 2009). Ngày nay, các loài thuộc chi nay đã có nhiều phân hóa về đặc điểm hình thái va điều kiện thích nghi. Nhiều loài có thể sống tốt ở các điều kiện khí hậu khác hoàn toàn so với tổ tiên nó.
Do quá trình thuần hóa của con người và di thực nên các loài thuộc chi Petunia đã phân bố ngày càng rộng rãi tiêu biểu như loài Petunia hybrida (Joao và ctv, 2009).2 Phân loại Phân loại thực vật Giới: Plantea (Thực vat) Bộ: Solanales Họ: Solanaceae (Họ Cà) Chi: Petunia Loài: P. hybrida Tên tiếng anh: Petunia Tên khoa học: Petunia hybrida 1.3 Đặc điểm thực vật học Dạ yến thảo là cây hang năm, ưa sáng, thân cao từ 15 - 30 cm có lông min bao quanh, phân nhánh từ nách lá. Lá đơn hình oval, mọc đối hay luân phiên, có phủ lớp lông mịn mềm mại, mép lá không có răng cưa. Hoa lưỡng tính , hình phễu.
Ngày nay, do sự lai tạo đã cho ra đời nhiều dạng hoa như cánh đơn, cánh kép với mép có viền và gon sóng hoặc mép đúng có hình cung nhọn ở giữa. Hoa có đa dang mau tím, trang, đỏ, cam, xanh nhạt pha đỏ, có mùi thơm dịu (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006). Dạ yến thảo thích nghi được với hầu hết các loại đất, pH từ 6,0 - 7,0. Cây thích hợp với khí hậu ôn hòa, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng, không chiu được ngập lụt hay khô han, đa số các loài thuộc chi này ưa nhiệt độ lạnh, ưa độ ẩm nhưng không được ngập, cây nhạy cảm với ánh nắng trực tiếp (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006).4 Một số loại hoa Dạ yến thảo Dựa vào hình dạng hoa có thể chia hoa Dạ yến thảo thành 2 loại: Dạ yến thảo hoa đơn (Multiflora): loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam, cũng là loại phố biến nhất.
Hoa đơn sắc, có hình đáng giống như chiếc loa nhỏ, hoa nở dày và liên tục. Cây thân thảo chiều dai được khoảng 80 - 100 cm, phát triển bò ngang, thích lên đến 5 - 7,5 cm. Dạ yến thảo kép (Grandiflora): có màu sắc sặc sỡ, hoa to gồm nhiều lớp cánh xếp chồng lên nhau, có sự hòa trộn màu sắc trên cùng một hoa. Cây thân bụi, cứng cáp hơn dạ yến thảo đơn, phát triển thang đứng, chiều cao từ 30 - 50 cm.2 Tình hình trồng và nhân giống Dạ yến thảo ở Việt Nam Cây Dạ yến thảo với màu sắc và kiêu dáng hoa đa dạng, bắt mắt nên đã được ưa chuộng dùng làm hoa cảnh trang trí trong nhiều kiêu không gian khác nhau như phòng khách, ban công, vườn hoa, tiểu cảnh sân vườn.
Trong những năm gan đây, các nhà vườn trồng cây cảnh đặc biệt quan tâm đến loại cây này vì nó mang lại hiệu quả kinh tế cao, được thị trường ưa chuộng. Ở Việt Nam, Dạ yến thảo được trồng nhiều nơi như Đà Lạt, Thành phố Hồ Chí Minh, Sa Déc (Đồng Tháp). chủ yếu là các giống có thé thích nghi với điều kiện khi hậu ở nước ta. Tuy nhiên, để có giống hoa đẹp các nhà vườn 4 thường nhập các giống mới từ các nước như Trung Quốc, Đức, Nga hoặc Ba Lan có hoa nhiều loại màu.
Mặc khác người dân cùng nhân giống cây hoa này bằng cách giâm cành và sử dụng cây con từ quá trình nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, trồng được cây Dạ yến thảo dé cây khỏe mạnh đến khi ra hoa yêu cầu nhà vườn có nhiều kinh nghiệm. Da số các giống Dạ yên thảo trên thị trường rất khó dé canh tác, khâu xử lý hạt giống cho nay mầm khá khó, phương pháp giâm cành thì đòi hỏi nhiều kĩ thuật của người trồng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006). Dạ yến thảo là cây ưa mát, ưa ẩm, những không ưa được ngập úng, cây không chịu được khi thời tiết khô nóng, cây sau khi mất nước có tưới lại cũng khó hồi phục do thân cây rỗng xốp, lá mỏng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006).
Dé phục vụ cho nhu cầu thưởng hoa cũng như phát triển ngành trồng hoa cảnh ở Việt Nam, cần có những giống Dạ yến thảo đa dang về màu sắc với khả năng thích nghỉ tốt, dé chăm sóc hon.3 Tổng quan về nuôi cay mô tế bào thực vật 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Nuôi cây mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp (Bùi Bá Bồng, 1995). Tế bao nuôi cấy phải là các tế bào có nhân hoàn chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích hợp có thé phân hóa thành cây hoản chỉnh. Các hệ thống nuôi cay mô thực vật thường được dùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa, di truyền học và cấu trúc thực vật. Hiện nay, kỹ thuật này cũng được sử dụng nhiều trong nhân giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh, đặc biệt là các loài thực vật quý, có giá trị cao (Bùi Bá Bồng, 1995; Nguyễn Đức Thành, 2000; Nguyễn Quang Thạch, 2009).
Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm một số phương pháp như sau: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chéi bên. Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 5 thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chéi hay nhiều chồi. Chi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ dé trở thành một cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, phát triển nhanh trên môi trường giàu auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cây trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ, gọi là tế bào đơn. Sau đó, tế bao đơn được chọn lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp dé phát triển, tăng sinh khối.
Nuôi cấy Protoplast Protoplast (tế bao tran) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp Protoplast có khả năng tái sinh màng tế bảo, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật). Khi tế bào mắt vách và tiến hành dung hợp, hai Protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp Protoplast có thé được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. Nuôi cấy bao phan va hạt phan Kỹ thuật nuôi cay bao phan và hạt phan là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH, double haploid).
Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra biến đị đi truyền như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật có hiệu quả cao trong chọn giống cây trông, nhất là với cấy trồng cho hạt như lúa.2 Tính toàn năng của tế bào Haberlandt G. (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé 6 hoàn chỉnh. Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bảo riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thé sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bao thực vật in vitro thực chat là kết quả của sự phân hóa và phản phân hóa tế bao. Quá trình phân hóa tế bào gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào, giai đoạn giãn và giai đoạn phân hóa. Sự phân hóa tế bào là sự chuyên các tế bảo phôi sinh thành các tê bao mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau cua cơ thê.
Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy tế bao thực vật là các tế bào đã phân hóa chức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo. Sau đó, các tế bào mô sẹo tái sinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó tái tạo thành cây hoàn chỉnh. - Tế bào phân hóa chức năng > Tế bào giãn —> Tế bảo mô sẹo (Nguyễn Bao Toản, 2004).4 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cây mô thực vật gồm các sự kiện nôi bật như: Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật dé chứng minh tính toàn năng của tế bao thực vật. Tuy nhiên, ông đã gặp thất bại khi cố găng nuôi cây các tê bao đã chuyên hóa được tách ra từ lá một sô cây một lá mâm.
Năm 1922, Kotte và Robins đã lập lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong việc nuôi cay đỉnh sinh trường của rễ một cây họ hòa thảo. Năm 1934, White nuôi cây thành công đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nam men trong một thời gian dai. Sau đó, ông đã thay thé hoàn toàn phù hợp dịch chiết nam men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridxin (B6) va Nicotinic acid. Kê từ đó, việc nuôi cay dau ré trong thời gian vô hạn đã được thực hiện ở nhiều cây khác nhau.
7 Trong cùng khoảng thời gian này, Went và Thimann đã phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid).