Khóa luận tốt nghiệp nông học ảnh hưởng của nồng độ 2 4d nước dừa iba ba đến sự tạo sẹo nhân nhanh chồi và tạo rễ cây hoa dạ yến thảo petuinia hybrida trong nuôi cấy mô in vitro

Khóa luận nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D, nước dừa, IBA, BA đến tạo sẹo, nhân chồi, tạo rễ cây hoa dạ yến thảo trong nuôi cấy mô in vitro.

• Tác giả: Khưu Thị Tú Trinh
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thanh Duyên
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Nông học
• Đề tài: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, nước dừa, IBA, BA đến sự tạo sẹo, nhân nhanh chồi và tạo rễ cây hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida) trong nuôi cấy mô in vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về cây Dạ yến thảo
• 1.2. Tình hình trồng và nhân giống Dạ yến thảo ở Việt Nam
• 1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm
• 2.3. Điều kiện nuôi cấy in vitro
• 2.4. Thiết bị và dụng cụ
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo mô sẹo của mẫu cây Dạ yến thảo
• 2.5.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Dạ yến thảo in vitro
• 2.5.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến khả năng ra rễ của cây Dạ yến thảo
• 2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo mô sẹo của mẫu cây Dạ yến thảo
• 3.2. Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi
• 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến khả năng ra rễ của cây Dạ yến thảo in vitro
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Ảnh hưởng của nồng độ 2 4 D đến quá trình tạo mô sẹo

Nồng độ 2,4-D là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình tạo mô sẹo của cây Dạ yến thảo. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L mang lại tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất, đạt 98,7% với khối lượng mô sẹo lên đến 489,1 mg. Mô sẹo hình thành có màu vàng xanh, cứng chắc, cho thấy sự phát triển tốt của tế bào. Việc sử dụng hormon thực vật như 2,4-D không chỉ kích thích sự phân chia tế bào mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành mô sẹo. Điều này khẳng định vai trò của 2,4-D trong kỹ thuật nuôi cấy mô và mở ra hướng đi mới cho việc nhân giống cây hoa này.

1.1 Tác động của nồng độ 2 4 D

Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ 2,4-D có tác động rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo. Mô sẹo được hình thành từ các tế bào có khả năng phân chia mạnh mẽ dưới tác động của 2,4-D. Kết quả cho thấy, nồng độ này không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo mô sẹo mà còn đến chất lượng mô sẹo, với khối lượng và hình thái đồng nhất. Việc tối ưu hóa nồng độ 2,4-D là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong quá trình nhân giống cây hoa Dạ yến thảo.

II. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã cho thấy hiệu quả tích cực trong việc nhân nhanh chồi của cây Dạ yến thảo. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 150 ml/L nước dừa mang lại số chồi tối ưu, đạt 4,2 chồi mỗi mẫu. Chiều cao chồi cũng tăng lên 4,4 cm, số lá trên mỗi cụm chồi đạt 22,3 lá. Nước dừa không chỉ cung cấp dinh dưỡng mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của cây. Điều này cho thấy rằng việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô là một phương pháp hiệu quả và tiết kiệm.

2.1 Tác động của nước dừa

Nước dừa chứa nhiều vitamin và khoáng chất, giúp tăng cường sức sống cho cây. Sự kết hợp giữa nước dừa và các chất điều hòa sinh trưởng như IBA và BA có thể tạo ra môi trường lý tưởng cho sự phát triển của chồi. Nghiên cứu cho thấy rằng nước dừa không chỉ giúp tăng số lượng chồi mà còn cải thiện chất lượng chồi, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống cây hoa Dạ yến thảo.

III. Ảnh hưởng của IBA và BA đến khả năng ra rễ

Nồng độ IBA và BA có ảnh hưởng lớn đến khả năng ra rễ của cây Dạ yến thảo. Kết quả cho thấy, sự kết hợp giữa 0,7 mg/L IBA và 0,3 mg/L BA mang lại tỷ lệ ra rễ cao nhất, đạt 95,6%. Chiều cao cây đạt 6,0 cm, số lá trên mỗi cây đạt 25,8 lá, và số rễ đạt 28,1 rễ. Điều này cho thấy rằng việc sử dụng hormon thực vật trong quá trình nuôi cấy mô là rất quan trọng để tạo ra cây con khỏe mạnh.

3.1 Tác động của IBA và BA

Sự kết hợp giữa IBA và BA không chỉ kích thích sự hình thành rễ mà còn thúc đẩy sự phát triển tổng thể của cây. Nghiên cứu cho thấy rằng IBA có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự hình thành rễ, trong khi BA giúp tăng cường sự phát triển của chồi. Việc tối ưu hóa nồng độ của hai loại hormon này là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong quá trình nhân giống cây hoa Dạ yến thảo.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida), thuộc họ Cà (Solanaceae), là loài hoa cảnh có giá trị thẩm mỹ và kinh tế cao tại Việt Nam nhờ sự phong phú về kiểu dáng và màu sắc hoa. Trong thực tế sản xuất tại các vùng chuyên canh hoa cảnh như Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt và Sa Đéc (Đồng Tháp), việc nhân giống Dạ yến thảo chủ yếu được thực hiện bằng hai phương pháp truyền thống: gieo hạt và giâm cành. Tuy nhiên, phương pháp gieo hạt gặp nhiều hạn chế do giá hạt giống nhập khẩu cao (từ 1.000 đồng/hạt), hạt kích thước nhỏ, tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt từ 60% đến 65% và tỷ lệ cây con chết cao. Phương pháp giâm cành lại đòi hỏi diện tích cây mẹ lớn, hệ số nhân giống thấp, cây con sinh trưởng kém đồng đều và rất dễ nhiễm sâu bệnh hại. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) là giải pháp kỹ thuật cần thiết nhằm nâng cao hệ số nhân giống, tạo ra số lượng lớn cây con sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Khưu Thị Tú Trinh (ngành Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh) được thực hiện nhằm giải quyết các mắt xích kỹ thuật quan trọng trong quy trình vi nhân giống cây hoa Dạ yến thảo. Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể qua ba nhiệm vụ:

1. Xác định nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hoa Dạ yến thảo.
2. Xác định công thức môi trường khoáng và liều lượng nước dừa thích hợp đến khả năng nhân nhanh chồi Dạ yến thảo in vitro.
3. Xác định nồng độ phối hợp giữa IBA và BA tối ưu cho khả năng cảm ứng ra rễ của cây Dạ yến thảo in vitro.

Đối tượng nghiên cứu là giống hoa Dạ yến thảo kép (Petunia hybrida Grandiflora) đã phân cành, chiều dài cành đạt từ 10 cm đến 15 cm, chưa ra hoa, được thu nhận từ Công ty Cổ phần Sài Gòn Hoa. Nghiên cứu được giới hạn thực hiện tại Phòng nuôi cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Di truyền - Giống, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 05/2023 đến tháng 10/2023. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào ba giai đoạn sinh trưởng in vitro gồm: cảm ứng tạo mô sẹo, nhân nhanh chồi và tạo rễ hoàn chỉnh.

Cơ sở khoa học và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nguyên lý về tính toàn năng của tế bào thực vật (Haberlandt, 1902) và quá trình phân hóa, phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toản, 2004). Khi tế bào mô lá trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhóm auxin, các tế bào này sẽ trải qua quá trình phản phân hóa để tạo thành khối mô sẹo (callus). Cơ chế điều khiển sự phát sinh hình thái cơ quan (tạo chồi hoặc tạo rễ) dựa trên tỷ lệ cân bằng sinh lý giữa auxin và cytokinin theo học thuyết của Skoog và Miller (1957): tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích sự hình thành rễ, tỷ lệ auxin/cytokinin thấp kích thích phát sinh chồi, và tỷ lệ cân bằng thuận lợi cho sự sinh trưởng của khối mô sẹo.

Hệ thống môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) nguyên nồng độ và môi trường 1/2 MS (giảm một nửa hàm lượng muối khoáng đa lượng và vi lượng). Môi trường được bổ sung 30 g/L đường saccarose làm nguồn cacbon hữu cơ, 8 g/L agar làm chất làm đông, hiệu chỉnh pH về mức 5,8 trước khi khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 121°C, áp suất hơi bão hòa 13,4 kPa (1 atm) trong 15 phút. Nước dừa non từ giống dừa Xiêm xanh Bến Tre (pH 5,6 - 5,8) được sử dụng như một hợp chất hữu cơ tự nhiên giàu khoáng chất, vitamin và các phytohormone nội sinh. Các chất điều hòa sinh trưởng tinh khiết gồm 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, độ tinh khiết > 99%), BA (6-Benzyladenine, độ tinh khiết > 99%) và IBA (3-Indolebutyric acid, độ tinh khiết > 98%) từ hãng Biobasic (Canada). Điều kiện phòng nuôi cấy được kiểm soát ổn định ở nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 50% - 60%, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối với cường độ ánh sáng 2000 lux.

Phương pháp thực nghiệm được thiết kế qua ba thí nghiệm độc lập:

• Thí nghiệm 1 (Tạo mô sẹo): Mẫu lá Dạ yến thảo được khử trùng tuần tự bằng cồn ethanol 70% trong 1 phút, dung dịch NaOCl 5% kết hợp chất bám dính Tween-20 trong 5 phút, sau đó rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng và cắt thành miếng vuông kích thước 1,0 cm x 1,0 cm. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) đơn yếu tố với 5 nghiệm thức nồng độ 2,4-D (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L) trên nền môi trường MS, lặp lại 3 lần, quy mô 25 chai/nghiệm thức, 1 mẫu/chai (tổng cộng 375 mẫu).
• Thí nghiệm 2 (Nhân nhanh chồi): Đoạn chồi cao 1,5 cm tạo ra từ thí nghiệm 1 được cấy chuyển vào môi trường nhân chồi. Thí nghiệm bố trí theo kiểu CRD hai yếu tố với 3 lần lặp lại; Yếu tố A gồm 2 nền môi trường (MS và 1/2 MS); Yếu tố B gồm 4 liều lượng nước dừa (0; 100; 150; 200 ml/L). Quy mô thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức, 15 chai/nghiệm thức, 2 mẫu/chai (tổng cộng 720 mẫu).
• Thí nghiệm 3 (Tạo rễ in vitro): Chồi sinh trưởng từ thí nghiệm 2 đạt chiều cao 1,5 cm có từ 4 - 5 lá được sử dụng làm vật liệu tạo rễ. Thí nghiệm bố trí kiểu CRD hai yếu tố với 3 lần lặp lại; Yếu tố A gồm 3 nồng độ IBA (0,3; 0,5; 0,7 mg/L); Yếu tố B gồm 3 nồng độ BA (0,1; 0,3; 0,5 mg/L). Quy mô gồm 9 nghiệm thức, 15 chai/nghiệm thức, 2 mẫu/chai (tổng cộng 810 mẫu).

Số liệu thí nghiệm được thu thập định kỳ 7 ngày/lần. Dữ liệu tỷ lệ phần trăm (%) được chuyển đổi theo công thức $\arcsin\sqrt{x}$ trước khi xử lý thống kê. Các phần mềm được áp dụng gồm Microsoft Excel (tổng hợp dữ liệu) và phần mềm R (chạy phân tích phương sai ANOVA và kiểm định phân hạng Duncan/LSD ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ và $p < 0,01$).

Nội dung chi tiết theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu xác định tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của ngành sản xuất hoa kiểng đô thị tại Việt Nam. Tác giả phân tích những hạn chế cố hữu của kỹ thuật nhân giống hạt và giâm cành đối với hoa Dạ yến thảo, thiết lập 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể, quy định các yêu cầu theo dõi chỉ tiêu hình thái - sinh trưởng, đồng thời xác lập giới hạn không gian tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền - Giống thuộc Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM trong khung thời gian 4 tháng thực nghiệm.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tư liệu khoa học về cây hoa Dạ yến thảo: nguồn gốc bản địa tại Nam Mỹ (vùng Serra, Brazil), vị trí phân loại học thuộc chi Petunia, họ Solanaceae, các đặc điểm hình thái thực vật của hai nhóm hình thái chính gồm Dạ yến thảo hoa đơn (Multiflora) và Dạ yến thảo kép (Grandiflora). Chương này tổng thuật toàn diện lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới và tại Việt Nam, phân tích 5 giai đoạn tiêu chuẩn của quy trình vi nhân giống, thành phần dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn đường, vitamin, agar và vai trò của các chất bổ sung hữu cơ tự nhiên như nước dừa. Đồng thời, tác giả tổng hợp các công trình nghiên cứu đi trước về nuôi cấy mô Dạ yến thảo của Thenmozhi (2011), Phạm Văn Lộc (2010), Bùi Thị Cúc và cộng tác viên (2017), Vũ Thị Thu Trang (2019, 2021) để làm cơ sở xây dựng dải nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cho nghiên cứu.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết xuất xứ vật liệu thực vật (cây hoa Dạ yến thảo kép từ Công ty Cổ phần Sài Gòn Hoa); bảng danh mục thành phần môi trường khoáng MS cải tiến và 1/2 MS; quy chuẩn hoạt động của các thiết bị chuyên dụng như tủ cấy vô trùng, máy đo pH, cân phân tích, nồi hấp khử trùng. Tác giả mô tả chi tiết quy trình vô trùng mẫu lá gồm 6 bước thao tác nghiêm ngặt; cấu trúc sơ đồ bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và phương thức phân bố nghiệm thức của 3 thí nghiệm (Thí nghiệm 1 khảo sát 2,4-D; Thí nghiệm 2 khảo sát môi trường và nước dừa; Thí nghiệm 3 khảo sát tương tác IBA và BA); danh mục các chỉ tiêu định lượng (tỷ lệ tạo sẹo, khối lượng mô sẹo, số chồi, chiều cao chồi, số lá, trọng lượng cụm chồi, tỷ lệ ra rễ, số rễ, chiều dài rễ) và phương pháp phân tích thống kê phương sai bằng phần mềm R.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận phản ánh chi tiết diễn biến sinh trưởng của mẫu cấy qua từng giai đoạn:

• Quá trình tạo mô sẹo: Sự hiện diện của 2,4-D là yếu tố bắt buộc để cảm ứng sự phân chia tế bào tạo mô sẹo từ phiến lá Dạ yến thảo; nghiệm thức đối chứng không bổ sung 2,4-D hoàn toàn không hình thành mô sẹo (0,0%). Nồng độ 2,4-D gia tăng từ 0,5 mg/L đến 1,5 mg/L làm tăng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo và sinh khối sẹo. Sau 28 ngày sau cấy (NSC), nồng độ 1,5 mg/L 2,4-D cho kết quả cao nhất với tỷ lệ tạo sẹo đạt 98,7%, khối lượng mô sẹo đạt 489,1 mg; khối sẹo cứng, chắc, có màu vàng xanh đặc trưng cho mô có khả năng tái sinh cao. Ngược lại, khi nâng nồng độ 2,4-D lên 2,0 mg/L, khối lượng mô sẹo giảm mạnh xuống 345,0 mg, mô sẹo chuyển sang trạng thái chai cứng, xuất hiện hiện tượng hóa nâu ở vùng trung tâm và rìa mô bị bở xốp, màu trắng đục.
• Quá trình nhân nhanh chồi: Môi trường khoáng MS nguyên nồng độ kích thích chồi sinh trưởng tốt hơn đáng kể so với môi trường 1/2 MS. Việc bổ sung nước dừa non thể hiện hiệu quả kích thích tăng sinh chồi rõ rệt. Sau 42 NSC, tương tác giữa môi trường MS và 150 ml/L nước dừa mang lại hiệu quả vượt trội nhất: số chồi đạt 4,2 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình đạt 4,4 cm, số lá đạt 22,3 lá/cụm chồi và trọng lượng tươi cụm chồi đạt 1,4 g. Cụm chồi ở nghiệm thức này phát triển xanh đậm, thân mập mạp và lá mở rộng. Khi tăng liều lượng nước dừa lên mức 200 ml/L, các chỉ tiêu sinh trưởng đều có xu hướng giảm sút ở cả hai nền môi trường khoáng.
• Quá trình tạo rễ in vitro: Sự kết hợp giữa nồng độ IBA (auxin) và BA (cytokinin) tạo ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng kích thích rễ bất định hình thành từ gốc chồi. Nghiệm thức kết hợp 0,7 mg/L IBA và 0,3 mg/L BA đạt kết quả tối ưu nhất sau 42 NSC: tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 95,6%, chiều cao cây đạt 6,0 cm, số lá đạt 25,8 lá/cây, số lượng rễ đạt 28,1 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình đạt 7,8 cm. Rễ tạo ra đồng đều, bám chắc vào môi trường thạch. Nghiệm thức có nồng độ 0,3 mg/L IBA + 0,3 mg/L BA cho phản ứng tạo rễ chậm nhất, ở thời điểm 14 và 21 NSC hoàn toàn chưa ghi nhận sự xuất hiện của rễ (tỷ lệ 0,0%), đến 28 NSC mới đạt 28,9% và kết thúc ở 42 NSC chỉ đạt 50,0%.

Kết luận và đề nghị

Khóa luận đúc kết các công thức môi trường chuyên biệt cho từng chặng phát triển in vitro của cây hoa Dạ yến thảo kép. Đồng thời, tác giả kiến nghị mở rộng nghiên cứu sang giai đoạn huấn luyện, thuần dưỡng cây giống in vivo trên các loại giá thể vườn ươm khác nhau nhằm hoàn thiện trọn vẹn quy trình công nghệ đưa ra sản xuất đại trà.

Kết quả và đóng góp của đề tài

Nghiên cứu đã xây dựng được bộ thông số kỹ thuật chuẩn xác cho ba giai đoạn vi nhân giống cây hoa Dạ yến thảo kép, được tổng hợp cụ thể qua bảng số liệu sau:

Giai đoạn nuôi cấy	Công thức môi trường tối ưu	Thời gian theo dõi	Các chỉ tiêu sinh trưởng - hình thái đạt được
Cảm ứng tạo mô sẹo	Nền MS + 30 g/L đường + 8 g/L agar + 1,5 mg/L 2,4-D	28 ngày	- Tỷ lệ tạo mô sẹo: 98,7% - Khối lượng mô sẹo: 489,1 mg - Trạng thái mô sẹo: Cứng, chắc, màu vàng xanh
Nhân nhanh chồi	Nền MS + 30 g/L đường + 8 g/L agar + 150 ml/L nước dừa	42 ngày	- Số chồi: 4,2 chồi/mẫu - Chiều cao chồi: 4,4 cm - Số lá: 22,3 lá/cụm chồi - Trọng lượng cụm chồi: 1,4 g (chồi khỏe, lá xanh đậm)
Tạo rễ in vitro	Nền MS + 30 g/L đường + 8 g/L agar + 0,7 mg/L IBA + 0,3 mg/L BA	42 ngày	- Tỷ lệ ra rễ: 95,6% - Chiều cao cây: 6,0 cm - Số lá: 25,8 lá/cây - Số rễ: 28,1 rễ/cây - Chiều dài rễ: 7,8 cm

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài thể hiện ở việc chứng minh khả năng sử dụng nguồn phụ phẩm hữu cơ tự nhiên là nước dừa non (150 ml/L) trên nền khoáng MS đầy đủ để nhân nhanh chồi Dạ yến thảo kép với hệ số nhân chồi và sinh khối cao, thay thế việc lạm dụng các hóa chất điều hòa sinh trưởng đắt tiền, từ đó hạ giá thành sản xuất cây giống. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác, tái lập được cho công tác sản xuất giống hoa Dạ yến thảo quy mô phòng thí nghiệm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có giới hạn rõ ràng về mặt phạm vi nghiên cứu khi chỉ tập trung đánh giá các chỉ tiêu sinh học trong điều kiện vô trùng in vitro qua ba giai đoạn (tạo sẹo, nhân nhanh chồi và kích thích ra rễ) trong thời gian thực nghiệm 4 tháng tại phòng thí nghiệm. Đề tài chưa triển khai giai đoạn 5 của quy trình vi nhân giống, tức là giai đoạn đưa cây con hoàn chỉnh ra ngôi thuần dưỡng tại vườn ươm (in vivo). Do đó, các chỉ tiêu về tỷ lệ sống sau khi ra ngôi, khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên, tốc độ phân cành và chất lượng hoa nở thương phẩm của cây con nuôi cấy mô vẫn chưa được khảo sát và ghi nhận.

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung khảo sát các loại giá thể ra ngôi (như xơ dừa, tro trấu, phân trùn quế), xác định ẩm độ và chế độ che sáng thích hợp trong nhà màng để tối ưu hóa tỷ lệ sống của cây con Dạ yến thảo sau khi rời bình nuôi cấy mô.

Giá trị tham khảo và đối tượng thụ hưởng

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Nông học, Công nghệ sinh học thực vật, Di truyền và Chọn giống cây trồng, cũng như kỹ thuật viên tại các trung tâm ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao và các cơ sở sản xuất giống hoa cấy mô thương mại.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao nhất bao gồm:

• Quy trình 6 bước khử trùng mẫu phiến lá Dạ yến thảo bằng cồn 70% và NaOCl 5% kết hợp Tween-20 đạt độ vô trùng cao và tỷ lệ sống tốt.
• Bảng công thức định lượng chi tiết nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D, IBA, BA) và liều lượng nước dừa non ứng dụng cho từng giai đoạn nuôi cấy.
• Hệ thống dữ liệu theo dõi động thái tăng trưởng định kỳ (7, 14, 21, 28, 35, 42 ngày) cung cấp các mốc thời gian chuẩn xác cho việc can thiệp kỹ thuật và đảo môi trường cấy chuyển.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình khử trùng mẫu lá hoa Dạ yến thảo kép trong khóa luận được tiến hành như thế nào? Mẫu lá sau khi được rửa sạch dưới vòi nước máy và dung dịch xà phòng được chuyển vào tủ cấy vô trùng. Quy trình khử trùng gồm: rửa mẫu bằng nước cất vô trùng; lắc mẫu trong cồn ethanol 70% trong 1 phút; rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng; lắc mẫu trong dung dịch NaOCl 5% có bổ sung 2 giọt Tween-20/100 ml trong 5 phút; rửa lại từ 3 đến 5 lần bằng nước cất vô trùng; cuối cùng thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và cắt miếng kích thước 1,0 cm x 1,0 cm.

2. Nồng độ 2,4-D nào cho hiệu quả tạo mô sẹo tốt nhất và hình thái mô sẹo đạt được có đặc điểm gì? Nồng độ 2,4-D tối ưu nhất là 1,5 mg/L bổ sung trên nền môi trường MS. Sau 28 ngày sau cấy, công thức này đạt tỷ lệ tạo mô sẹo 98,7% với khối lượng mô sẹo tươi cao nhất là 489,1 mg. Khối mô sẹo thu được có đặc tính vật lý cứng, chắc và màu vàng xanh – trạng thái mô sẹo lý tưởng cho quá trình phân hóa và tái sinh chồi.

3. Tại sao môi trường MS bổ sung 150 ml/L nước dừa lại được chọn cho giai đoạn nhân nhanh chồi thay vì mức 200 ml/L? Ở liều lượng 150 ml/L nước dừa kết hợp nền khoáng MS, các chỉ tiêu nhân chồi đạt cực đại sau 42 ngày sau cấy: số chồi đạt 4,2 chồi/cụm, chiều cao chồi đạt 4,4 cm, số lá đạt 22,3 lá/cụm và trọng lượng cụm chồi đạt 1,4 g. Khi nâng nồng độ nước dừa lên 200 ml/L, các chỉ tiêu đều bị suy giảm (chỉ đạt 3,4 chồi; chiều cao đạt 3,8 cm; số lá đạt 19,6 lá và trọng lượng cụm chồi giảm còn 0,9 g). Do đó, liều lượng 150 ml/L là ngưỡng sinh lý tối ưu.

4. Mẫu đối chứng không bổ sung 2,4-D (0 mg/L) có khả năng hình thành mô sẹo từ lá Dạ yến thảo hay không? Mẫu đối chứng (0 mg/L 2,4-D) hoàn toàn không có khả năng tạo mô sẹo (tỷ lệ tạo sẹo đạt 0,0% qua tất cả các thời điểm theo dõi từ 7 đến 28 ngày sau cấy). Điều này chứng minh rằng tế bào mô lá Dạ yến thảo bắt buộc phải có sự kích thích của auxin ngoại sinh (cụ thể là 2,4-D) để xảy ra hiện tượng phản phân hóa tế bào hình thành mô sẹo.

5. Công thức nào cho kết quả tạo rễ in vitro cao nhất sau 42 ngày sau cấy? Công thức kích thích ra rễ tối ưu nhất là môi trường MS bổ sung kết hợp 0,7 mg/L IBA và 0,3 mg/L BA. Sau 42 ngày sau cấy, nghiệm thức này đạt tỷ lệ ra rễ 95,6%, chiều cao cây đạt 6,0 cm, số lá đạt 25,8 lá/cây, số rễ đạt 28,1 rễ/cây và chiều dài rễ đạt 7,8 cm, hình thành cây con hoàn chỉnh khỏe mạnh trong ống nghiệm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Khưu Thị Tú Trinh đã xác định thành công các thông số kỹ thuật môi trường tối ưu cho ba giai đoạn nuôi cấy in vitro cây hoa Dạ yến thảo kép (Petunia hybrida Grandiflora) tại Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Nghiên cứu đã chứng minh vai trò thiết yếu của 1,5 mg/L 2,4-D trong cảm ứng tạo sẹo lá, hiệu quả của 150 ml/L nước dừa non trên nền khoáng MS trong tăng sinh chồi, và sự phối hợp giữa 0,7 mg/L IBA cùng 0,3 mg/L BA trong kích thích tạo hệ rễ hoàn chỉnh. Đây là công trình thực nghiệm nông học có phương pháp luận chặt chẽ, số liệu thống kê rõ ràng, đóng góp cơ sở dữ liệu thực tiễn cho kỹ thuật vi nhân giống cây hoa cảnh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo 1.1 Nguồn gốc và phân bố Dạ yến thảo vốn là loài đặc hữu của Nam Mỹ, phân bồ chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới với nhiệt độ từ 22°C - 39°C. Sự đa dạng về loài chủ yếu tìm thấy ở vùng Serra của Brazil, nơi tìm thấy loài Petunia integrifolia và Petunia axillaris được xem là nguồn gốc của Petunia hybrida (Dạ yến thảo), ngoài ra Petunia còn được tìm thay ở nhiều Argentia, Uruguay, Paraguay va Bolivia (Joao và ctv, 2009). Ngày nay, các loài thuộc chi nay đã có nhiều phân hóa về đặc điểm hình thái va điều kiện thích nghi. Nhiều loài có thể sống tốt ở các điều kiện khí hậu khác hoàn toàn so với tổ tiên nó.

Do quá trình thuần hóa của con người và di thực nên các loài thuộc chi Petunia đã phân bố ngày càng rộng rãi tiêu biểu như loài Petunia hybrida (Joao và ctv, 2009).2 Phân loại Phân loại thực vật Giới: Plantea (Thực vat) Bộ: Solanales Họ: Solanaceae (Họ Cà) Chi: Petunia Loài: P. hybrida Tên tiếng anh: Petunia Tên khoa học: Petunia hybrida 1.3 Đặc điểm thực vật học Dạ yến thảo là cây hang năm, ưa sáng, thân cao từ 15 - 30 cm có lông min bao quanh, phân nhánh từ nách lá. Lá đơn hình oval, mọc đối hay luân phiên, có phủ lớp lông mịn mềm mại, mép lá không có răng cưa. Hoa lưỡng tính , hình phễu.

Ngày nay, do sự lai tạo đã cho ra đời nhiều dạng hoa như cánh đơn, cánh kép với mép có viền và gon sóng hoặc mép đúng có hình cung nhọn ở giữa. Hoa có đa dang mau tím, trang, đỏ, cam, xanh nhạt pha đỏ, có mùi thơm dịu (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006). Dạ yến thảo thích nghi được với hầu hết các loại đất, pH từ 6,0 - 7,0. Cây thích hợp với khí hậu ôn hòa, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng, không chiu được ngập lụt hay khô han, đa số các loài thuộc chi này ưa nhiệt độ lạnh, ưa độ ẩm nhưng không được ngập, cây nhạy cảm với ánh nắng trực tiếp (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006).4 Một số loại hoa Dạ yến thảo Dựa vào hình dạng hoa có thể chia hoa Dạ yến thảo thành 2 loại: Dạ yến thảo hoa đơn (Multiflora): loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam, cũng là loại phố biến nhất.

Hoa đơn sắc, có hình đáng giống như chiếc loa nhỏ, hoa nở dày và liên tục. Cây thân thảo chiều dai được khoảng 80 - 100 cm, phát triển bò ngang, thích lên đến 5 - 7,5 cm. Dạ yến thảo kép (Grandiflora): có màu sắc sặc sỡ, hoa to gồm nhiều lớp cánh xếp chồng lên nhau, có sự hòa trộn màu sắc trên cùng một hoa. Cây thân bụi, cứng cáp hơn dạ yến thảo đơn, phát triển thang đứng, chiều cao từ 30 - 50 cm.2 Tình hình trồng và nhân giống Dạ yến thảo ở Việt Nam Cây Dạ yến thảo với màu sắc và kiêu dáng hoa đa dạng, bắt mắt nên đã được ưa chuộng dùng làm hoa cảnh trang trí trong nhiều kiêu không gian khác nhau như phòng khách, ban công, vườn hoa, tiểu cảnh sân vườn.

Trong những năm gan đây, các nhà vườn trồng cây cảnh đặc biệt quan tâm đến loại cây này vì nó mang lại hiệu quả kinh tế cao, được thị trường ưa chuộng. Ở Việt Nam, Dạ yến thảo được trồng nhiều nơi như Đà Lạt, Thành phố Hồ Chí Minh, Sa Déc (Đồng Tháp). chủ yếu là các giống có thé thích nghi với điều kiện khi hậu ở nước ta. Tuy nhiên, để có giống hoa đẹp các nhà vườn 4 thường nhập các giống mới từ các nước như Trung Quốc, Đức, Nga hoặc Ba Lan có hoa nhiều loại màu.

Mặc khác người dân cùng nhân giống cây hoa này bằng cách giâm cành và sử dụng cây con từ quá trình nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, trồng được cây Dạ yến thảo dé cây khỏe mạnh đến khi ra hoa yêu cầu nhà vườn có nhiều kinh nghiệm. Da số các giống Dạ yên thảo trên thị trường rất khó dé canh tác, khâu xử lý hạt giống cho nay mầm khá khó, phương pháp giâm cành thì đòi hỏi nhiều kĩ thuật của người trồng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006). Dạ yến thảo là cây ưa mát, ưa ẩm, những không ưa được ngập úng, cây không chịu được khi thời tiết khô nóng, cây sau khi mất nước có tưới lại cũng khó hồi phục do thân cây rỗng xốp, lá mỏng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006).

Dé phục vụ cho nhu cầu thưởng hoa cũng như phát triển ngành trồng hoa cảnh ở Việt Nam, cần có những giống Dạ yến thảo đa dang về màu sắc với khả năng thích nghỉ tốt, dé chăm sóc hon.3 Tổng quan về nuôi cay mô tế bào thực vật 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Nuôi cây mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp (Bùi Bá Bồng, 1995). Tế bao nuôi cấy phải là các tế bào có nhân hoàn chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích hợp có thé phân hóa thành cây hoản chỉnh. Các hệ thống nuôi cay mô thực vật thường được dùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa, di truyền học và cấu trúc thực vật. Hiện nay, kỹ thuật này cũng được sử dụng nhiều trong nhân giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh, đặc biệt là các loài thực vật quý, có giá trị cao (Bùi Bá Bồng, 1995; Nguyễn Đức Thành, 2000; Nguyễn Quang Thạch, 2009).

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm một số phương pháp như sau: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chéi bên. Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 5 thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chéi hay nhiều chồi. Chi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ dé trở thành một cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, phát triển nhanh trên môi trường giàu auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cây trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ, gọi là tế bào đơn. Sau đó, tế bao đơn được chọn lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp dé phát triển, tăng sinh khối.

Nuôi cấy Protoplast Protoplast (tế bao tran) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp Protoplast có khả năng tái sinh màng tế bảo, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật). Khi tế bào mắt vách và tiến hành dung hợp, hai Protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp Protoplast có thé được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. Nuôi cấy bao phan va hạt phan Kỹ thuật nuôi cay bao phan và hạt phan là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH, double haploid).

Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra biến đị đi truyền như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật có hiệu quả cao trong chọn giống cây trông, nhất là với cấy trồng cho hạt như lúa.2 Tính toàn năng của tế bào Haberlandt G. (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé 6 hoàn chỉnh. Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bảo riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thé sinh vật đó.

Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bao thực vật in vitro thực chat là kết quả của sự phân hóa và phản phân hóa tế bao. Quá trình phân hóa tế bào gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào, giai đoạn giãn và giai đoạn phân hóa. Sự phân hóa tế bào là sự chuyên các tế bảo phôi sinh thành các tê bao mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau cua cơ thê.

Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy tế bao thực vật là các tế bào đã phân hóa chức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo. Sau đó, các tế bào mô sẹo tái sinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó tái tạo thành cây hoàn chỉnh. - Tế bào phân hóa chức năng > Tế bào giãn —> Tế bảo mô sẹo (Nguyễn Bao Toản, 2004).4 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cây mô thực vật gồm các sự kiện nôi bật như: Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật dé chứng minh tính toàn năng của tế bao thực vật. Tuy nhiên, ông đã gặp thất bại khi cố găng nuôi cây các tê bao đã chuyên hóa được tách ra từ lá một sô cây một lá mâm.

Năm 1922, Kotte và Robins đã lập lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong việc nuôi cay đỉnh sinh trường của rễ một cây họ hòa thảo. Năm 1934, White nuôi cây thành công đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nam men trong một thời gian dai. Sau đó, ông đã thay thé hoàn toàn phù hợp dịch chiết nam men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridxin (B6) va Nicotinic acid. Kê từ đó, việc nuôi cay dau ré trong thời gian vô hạn đã được thực hiện ở nhiều cây khác nhau.

7 Trong cùng khoảng thời gian này, Went và Thimann đã phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid).