Xây Dựng Quy Trình Xác Định Genotype Của Virus Viêm Gan C

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Xây dựng quy trình xác định genotype hcv của hepatitis c virus bằng kỹ thuật giải trình tự, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Ts. Nguyễn Đăng Quân
• Trường học: Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Xác Định Genotype Của Hepatitis C Virus Bằng Kỹ Thuật Giải Trình Tự Nucleotide
• Loại tài liệu: Báo Cáo Nghiệm Thu
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỤC LỤC
• 1. DANH MỤC HÌNH
• 2. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 3. TÓM TẮT
• 4. THÔNG TIN CHUNG
• 5. MỤC TIÊU NHIỆM VỤ
• 6. NỘI DUNG KHOA HỌC
• 6.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 6.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.2.1. Vòng đời (life cycle) của HCV
• 6.2.2. Dịch tễ học viêm gan virus C
• 6.2.3. Đặc điểm bệnh lý của viêm gan virus C
• 6.2.4. Sự đa dạng di truyền của HCV
• 6.2.5. Chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan virus C
• 6.2.6. Các phương pháp xác định genotype HCV
• 6.3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.3.1. Phương pháp
• 6.4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
• 6.5. ĐÁNH GIÁ CHUNG
• 6.6. SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Xác Định Genotype Virus Viêm Gan C HCV

Viêm gan virus C (HCV) là một bệnh truyền nhiễm do Hepatitis C Virus gây ra, thường tiến triển thầm lặng trong thời gian dài, dẫn đến việc chẩn đoán và điều trị muộn. Hiện nay, chưa có vaccine phòng ngừa, nên điều trị là phương pháp chủ yếu để ngăn chặn sự lây lan. Việc xác định genotype HCV là yếu tố quan trọng trước khi điều trị, ảnh hưởng đến phác đồ, thời gian và tiên lượng. Phương pháp giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B được xem là lựa chọn tối ưu để xác định genotype chính xác. Đề tài “Xây dựng quy trình xác định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B” hướng đến mục tiêu điều trị hiệu quả bệnh viêm gan virus C. Nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn trong việc cung cấp một quy trình chính xác và hiệu quả để xác định genotype của HCV dựa trên phương pháp giải trình tự nucleotide. Quy trình này có thể được sử dụng trong điều trị lâm sàng và nghiên cứu dịch tễ học HCV. "Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải là một yếu tố cần phải được xác định trước khi điều trị vì nó ảnh hưởng đến quyết định phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị."

1.1. Tầm Quan Trọng Của Genotype HCV Trong Điều Trị

Xác định genotype HCV giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, từ đó tối ưu hóa hiệu quả và giảm thiểu tác dụng phụ. Mỗi genotype có thể đáp ứng khác nhau với các loại thuốc kháng virus, do đó việc xác định chính xác genotype giúp tăng khả năng thành công của điều trị. Thời gian điều trị cũng phụ thuộc vào genotype, với một số genotype cần thời gian điều trị dài hơn so với những genotype khác. Việc xác định genotype HCV cho phép dự đoán tiên lượng đáp ứng điều trị, giúp bệnh nhân và bác sĩ có những kỳ vọng thực tế hơn. "Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải là một yếu tố cần phải được xác định trước khi điều trị vì nó ảnh hưởng đến quyết định phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị."

1.2. Các Phương Pháp Xác Định Genotype HCV Hiện Nay

Hiện nay, có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, bao gồm real-time PCR, lai phân tử và giải trình tự nucleotide. Real-time PCR là phương pháp nhanh chóng và tiện lợi, nhưng độ chính xác có thể thấp hơn so với giải trình tự nucleotide. Lai phân tử là một phương pháp khác, nhưng cũng có những hạn chế về độ chính xác và khả năng phát hiện các biến thể mới của virus. Giải trình tự nucleotide được coi là phương pháp tiêu chuẩn vàng vì nó cung cấp thông tin chi tiết về trình tự gen của virus, cho phép xác định chính xác genotype HCV và phát hiện các biến thể mới. "Có rất nhiều phương pháp để xác định genotype HCV phục vụ trong điều trị, tuy nhiên phương pháp giải trình tự kỹ thuật mới là lựa chọn tối ưu để có kết quả định genotype chính xác."

II. Thách Thức Trong Xác Định Genotype HCV và Giải Pháp

Sự đa dạng di truyền của HCV tạo ra thách thức lớn trong việc xác định genotype. Virus này có nhiều genotype khác nhau (1-6), và mỗi genotype lại có các subtype khác nhau. Sự biến đổi liên tục của virus đòi hỏi các phương pháp xác định genotype phải đủ nhạy và đặc hiệu để phát hiện các biến thể mới. Ngoài ra, chi phí và thời gian thực hiện các xét nghiệm genotype cũng là một vấn đề cần quan tâm. Giải pháp là sử dụng phương pháp giải trình tự nucleotide, kết hợp với các công cụ phân tích tin sinh học mạnh mẽ để xác định chính xác genotype và phát hiện các biến thể mới. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu về các genotype HCV phổ biến tại Việt Nam cũng rất quan trọng để hỗ trợ việc chẩn đoán và điều trị.

2.1. Sự Đa Dạng Di Truyền Của Virus Viêm Gan C HCV

Sự đa dạng di truyền của HCV là một trong những yếu tố khiến việc điều trị bệnh trở nên khó khăn. Có sáu genotype HCV chính, được đánh số từ 1 đến 6, và mỗi genotype lại có nhiều subtype khác nhau. Sự phân bố của các genotype HCV khác nhau trên toàn cầu cũng khác nhau, với genotype 1 là phổ biến nhất ở nhiều khu vực, trong khi genotype 6 lại phổ biến hơn ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. "HCV có sự đa dạng di truyền cao đặc trưng bởi sự lưu hành của nhiều genotype."

2.2. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Độ Chính Xác Xét Nghiệm Genotype

Độ chính xác của xét nghiệm genotype có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng mẫu bệnh phẩm, phương pháp xét nghiệm được sử dụng và kinh nghiệm của kỹ thuật viên. Mẫu bệnh phẩm phải được thu thập và bảo quản đúng cách để đảm bảo rằng RNA của virus không bị phân hủy. Phương pháp xét nghiệm phải đủ nhạy và đặc hiệu để phát hiện các genotype và subtype khác nhau. Kỹ thuật viên phải có kinh nghiệm trong việc thực hiện và phân tích kết quả xét nghiệm. "Giải trình tự nucleotide được xem như một phương pháp tiêu chuẩn vì nó xác định chính xác genotype HCV dựa trên phân tích trình tự các vùng gen đặc trưng của virus này."

III. Phương Pháp Giải Trình Tự Nucleotide Vùng Core và NS5B

Giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B là phương pháp xác định genotype HCV dựa trên việc phân tích trình tự gen của virus. Vùng core và NS5B là hai vùng gen có tính biến đổi cao giữa các genotype HCV, do đó chúng được sử dụng làm mục tiêu để phân biệt các genotype khác nhau. Quy trình bao gồm các bước: tách chiết RNA virus từ mẫu bệnh phẩm, nhân bản vùng core và NS5B bằng kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR, và phân tích trình tự để xác định genotype HCV. Phương pháp này có độ chính xác cao và cho phép phát hiện các biến thể mới của virus. Tuy nhiên, nó cũng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có chuyên môn.

3.1. Chi Tiết Quy Trình Tách Chiết RNA Từ Mẫu Bệnh Phẩm

Tách chiết RNA virus là bước đầu tiên và quan trọng trong quy trình giải trình tự nucleotide. RNA virus phải được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm một cách hiệu quả và đảm bảo tính toàn vẹn để đảm bảo độ chính xác của kết quả. Có nhiều phương pháp tách chiết RNA khác nhau, bao gồm phương pháp sử dụng cột silica và phương pháp sử dụng phenol-chloroform. Phương pháp sử dụng cột silica thường được ưa chuộng hơn vì nó đơn giản, nhanh chóng và ít độc hại hơn so với phương pháp sử dụng phenol-chloroform. "Nhóm nghiên cứu đã xây dựng được quy trình tách chiết các mẫu huyết thanh bằng phương pháp silica, nhân bản vùng core và NS5B nhằm tiến hành giải trình tự xác định genotype của HCV."

3.2. Kỹ Thuật RT PCR Nhân Bản Vùng Core và NS5B Của HCV

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân bản đoạn gen mong muốn từ RNA virus. Đầu tiên, RNA virus được chuyển đổi thành cDNA (complementary DNA) bằng enzyme phiên mã ngược. Sau đó, cDNA được nhân bản bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu cho vùng core và NS5B của HCV. Kỹ thuật nested RT-PCR (RT-PCR lồng) có thể được sử dụng để tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng. Sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi tiến hành giải trình tự. "Nhân bản vùng core và NS5B bằng nested RT-PCR."

3.3 Giải Trình Tự Sanger Để Xác Định Genotype HCV

Giải trình tự Sanger là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự nucleotide của DNA. Sau khi nhân bản thành công vùng Core và NS5B bằng RT-PCR, sản phẩm PCR được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự Sanger. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng để xác định trình tự nucleotide. Trình tự nucleotide thu được sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu trình tự HCV đã biết để xác định genotype HCV của mẫu bệnh phẩm.

IV. Ứng Dụng Kết Quả Xác Định Genotype HCV Trong Điều Trị

Kết quả xác định genotype HCV có vai trò quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân. Trước đây, phác đồ điều trị chuẩn cho viêm gan C thường dựa trên interferon và ribavirin, và hiệu quả điều trị khác nhau tùy thuộc vào genotype HCV. Ngày nay, với sự ra đời của các thuốc kháng virus tác dụng trực tiếp (DAAs), việc điều trị viêm gan C đã trở nên hiệu quả hơn và ít tác dụng phụ hơn. Tuy nhiên, việc xác định genotype HCV vẫn cần thiết để lựa chọn phác đồ DAA phù hợp và tối ưu hóa kết quả điều trị. Ngoài ra, kết quả genotype HCV cũng có thể giúp dự đoán khả năng đáp ứng điều trị và thời gian điều trị cần thiết.

4.1. Lựa Chọn Phác Đồ Điều Trị Dựa Trên Genotype HCV

Việc lựa chọn phác đồ điều trị dựa trên genotype HCV là rất quan trọng để đạt được hiệu quả điều trị tối ưu. Các thuốc DAA có hiệu quả khác nhau đối với các genotype HCV khác nhau. Ví dụ, một số thuốc có hiệu quả cao đối với genotype 1 nhưng lại ít hiệu quả đối với genotype 3. Do đó, việc xác định chính xác genotype HCV giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ DAA phù hợp nhất cho bệnh nhân. "Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải là một yếu tố cần phải được xác định trước khi điều trị vì nó ảnh hưởng đến quyết định phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị."

4.2. Dự Đoán Khả Năng Đáp Ứng Điều Trị Viêm Gan C HCV

Kết quả xác định genotype HCV có thể giúp dự đoán khả năng đáp ứng điều trị của bệnh nhân. Một số genotype có xu hướng đáp ứng tốt hơn với các thuốc DAA so với các genotype khác. Ví dụ, bệnh nhân nhiễm genotype 2 hoặc 3 thường có khả năng đáp ứng tốt hơn với các thuốc DAA so với bệnh nhân nhiễm genotype 1. Thông tin này có thể giúp bác sĩ tư vấn cho bệnh nhân về kỳ vọng điều trị và theo dõi sát sao hơn những bệnh nhân có khả năng đáp ứng kém. "Xét nghiệm genotype/ subtype được dùng phổ biến cho người đang cân nhắc điều trị HCV và chỉ tiến hành một lần bởi vì genotype HCV không thay đổi trong suốt quá trình bệnh, trừ khi người đó tái nhiễm một genotype khác."

V. Kết Quả Nghiên Cứu Xác Định Genotype HCV Tại Việt Nam

Nghiên cứu đã xác định được genotype của 48 mẫu bệnh phẩm, chủ yếu là genotype 1 và 6. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về phân bố genotype HCV tại Việt Nam, cho thấy genotype 1 và 6 là phổ biến nhất. Nghiên cứu này cung cấp thêm thông tin quan trọng về dịch tễ học HCV tại Việt Nam, giúp các nhà hoạch định chính sách và bác sĩ lâm sàng có thêm cơ sở để đưa ra các quyết định điều trị và phòng ngừa bệnh hiệu quả hơn. Việc tiếp tục nghiên cứu và theo dõi sự thay đổi của phân bố genotype HCV tại Việt Nam là rất cần thiết để ứng phó với bệnh viêm gan C một cách hiệu quả.

5.1. Phân Bố Genotype HCV Tại Việt Nam Theo Nghiên Cứu

Theo kết quả nghiên cứu, genotype HCV phổ biến nhất tại Việt Nam là genotype 1 và 6. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về phân bố genotype HCV tại Việt Nam. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa để có được bức tranh đầy đủ và chính xác về phân bố genotype HCV tại các vùng miền khác nhau của Việt Nam. "Kết quả đã xác định được genotype của 48 mẫu bệnh phẩm gồm 1, 2 và 6; trong đó chủ yếu là genotype 1 và 6."

5.2. So Sánh Kết Quả Với Các Nghiên Cứu Trước Đó Về HCV

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước đó về phân bố genotype HCV tại Việt Nam, cho thấy genotype 1 và 6 là phổ biến nhất. Tuy nhiên, tỷ lệ của các genotype HCV khác có thể khác nhau giữa các nghiên cứu, tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu và phương pháp xét nghiệm được sử dụng. Việc so sánh kết quả với các nghiên cứu trước đó giúp xác định xu hướng và thay đổi trong phân bố genotype HCV tại Việt Nam. "Tính đến năm 2014, chỉ có 7 nghiên cứu về HCV genotype ở Việt Nam được công bố, trong nghiên cứu của Messina và cộng sự, sự lưu hành các genotype ở Việt Nam là 86 ngàn người mắc genotype 1 (60,56%), 8 ngàn người mắc genotype 2 (5,9%), 7 ngàn người mắc genotype 3 (4,79%), 41 ngàn người mắc genotype 6 (28,57%) và không có trường hợp nhiễm genotype 4 và 5 [6].2: Sự lưu hành virus hepatitis C giữa người lớn và phân bố genotype".

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Xác Định Genotype HCV

Việc xác định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide là phương pháp chính xác và hiệu quả, đóng vai trò quan trọng trong điều trị viêm gan C. Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình tách chiết, nhân bản và giải trình tự vùng core và NS5B, góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp xác định genotype HCV nhanh chóng và chi phí thấp hơn, đồng thời xây dựng cơ sở dữ liệu về các biến thể mới của virus tại Việt Nam. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh viêm gan C trong cộng đồng.

6.1. Ưu Điểm Của Phương Pháp Giải Trình Tự Genotype

Phương pháp giải trình tự genotype mang lại độ chính xác cao trong việc xác định genotype HCV, từ đó giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp nhất. Nó cũng cho phép phát hiện các biến thể mới của virus, giúp theo dõi sự thay đổi và tiến hóa của HCV trong cộng đồng. Ngoài ra, phương pháp này có thể được sử dụng để nghiên cứu dịch tễ học HCV và theo dõi hiệu quả của các chương trình phòng ngừa và điều trị. "Trong số các phương pháp xác định genotype HCV thì giải trình tự nucleotide được xem như một phương pháp tiêu chuẩn vì nó xác định chính xác genotype HCV dựa trên phân tích trình tự các vùng gen đặc trưng của virus này."

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Các Phương Pháp Genotype HCV

Trong tương lai, cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp xác định genotype HCV nhanh chóng, chi phí thấp và dễ thực hiện hơn, phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam. Các phương pháp dựa trên real-time PCR và giải trình tự thế hệ mới (NGS) có tiềm năng lớn trong việc đáp ứng nhu cầu này. Ngoài ra, cần xây dựng cơ sở dữ liệu về các biến thể mới của virus tại Việt Nam để hỗ trợ việc chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn. "Bên cạnh đó, thông qua việc thực hiện đề tài quy trình kỹ thuật giải trình tự gen xác định genotype HCV sẽ được thiết lập ở Trung tâm Công nghệ Sinh học tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu và ứng dụng có liên quan."

Nội dung chính

Nghiên Cứu Xác Định Genotype Virus Viêm Gan C (HCV) Bằng Kỹ Thuật Giải Trình Tự Nucleotide Vùng Core Và NS5B

---

Tóm tắt nghiên cứu

• Câu hỏi nghiên cứu chính (Research Question): Làm thế nào để thiết lập một quy trình chẩn đoán phân tử chuẩn xác, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm phân lập và định danh chính xác các kiểu gen (genotype) cùng phân nhóm (subtype) của virus viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV) lưu hành tại Việt Nam dựa trên phân tích đa vùng gen?
• Phương pháp tổng quan (Methodology Snapshot): Nhóm tác giả tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM đã tối ưu hóa quy trình tách chiết RNA virus bằng phương pháp hạt silica tự phối chế, kết hợp kỹ thuật Nested RT-PCR hai bước sử dụng các cặp mồi thoái hóa đặc hiệu cho vùng core (473 bp) và NS5B (392 bp). Sản phẩm khuếch đại sau tinh sạch được giải trình tự Sanger tự động trên hệ thống ABI 3500, sau đó phân tích phát sinh loài (phylogenetic tree) qua các thuật toán Clustal Omega, MEGA và đối chiếu đa cơ sở dữ liệu quốc tế (NCBI, Oxford HCV, Los Alamos).
• Kết quả then chốt (Key Findings): Thử nghiệm trên 100 mẫu huyết thanh lâm sàng ghi nhận 60 mẫu dương tính ở bước sàng lọc Real-time PCR 5’UTR và 48 mẫu được định type thành công qua giải trình tự. Phân bố ghi nhận gồm genotype 1 (chiếm 37,5%), genotype 2 (12,5%) và chiếm ưu thế cao nhất là genotype 6 (50%) với độ đa dạng biến chủng rất phong phú (1a, 1b, 1n, 2a, 2i, 2m, 6a, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l). Đặc biệt, đề tài phát hiện 3 ca dị biệt mang hai genotype khác nhau giữa hai vùng gen (core và NS5B), phản ánh hiện tượng đồng nhiễm hoặc tái tổ hợp di truyền.
• Ý nghĩa thực tiễn (Implications): Quy trình cung cấp giải pháp kỹ thuật "tiêu chuẩn vàng" có độ tin cậy vượt trội so với các phương pháp Real-time PCR đơn thuần hay lai mẫu dò (LiPA), hỗ trợ bác sĩ lâm sàng cá thể hóa phác đồ điều trị bằng thuốc kháng virus tác động trực tiếp (DAAs) và phục vụ hiệu quả công tác giám sát dịch tễ học phân tử HCV tại Việt Nam.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng

Thực trạng dịch tễ học và thách thức lâm sàng

Viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm mạn tính nguy hiểm hàng đầu gây tổn thương nhu mô gan, tiến triển âm thầm dẫn đến xơ gan (10–20%) và ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát (HCC, khoảng 5%). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), toàn cầu có khoảng 170 triệu người mang mầm bệnh mạn tính. Tại Việt Nam, dịch tễ học ghi nhận hơn 2 triệu ca nhiễm với tỷ lệ tử vong lên đến gần 6%. Do HCV chưa có vaccine phòng ngừa đặc hiệu, can thiệp điều trị triệt để nhằm loại trừ tải lượng virus là biện pháp duy nhất giúp cắt đứt chuỗi lây truyền cộng đồng.

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap)

Sự đa dạng di truyền của HCV vô cùng phức tạp với 6 genotype chính và hàng chục subtype khác nhau. Trong kỷ nguyên thuốc kháng virus tác động trực tiếp (DAAs) như Sofosbuvir, Daclatasvir, Simeprevir hay Ledipasvir, việc xác định chính xác genotype và subtype mang tính quyết định đến lựa chọn hoạt chất, thời gian điều trị cũng như nguy cơ đột biến kháng thuốc. Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán phổ biến hiện nay như Real-time PCR hay lai phân tử thường nhắm vào vùng 5’UTR – một vùng gen có tính bảo tồn cao nhưng lại không đủ độ biến động để phân biệt chuẩn xác các phân nhóm phức tạp, đặc biệt là các biến thể của genotype 6 lưu hành đặc thù tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam.

       Cấu trúc Genome của Hepatitis C Virus (HCV)

Tính cấp thiết và tác động kỳ vọng

Việc phát triển một quy trình chẩn đoán giải trình tự nucleotide đồng thời trên hai vùng gen biến động cao là core (mã hóa protein capsid) và NS5B (mã hóa enzyme RNA-dependent RNA polymerase) trở thành đòi hỏi cấp thiết. Nghiên cứu không chỉ lấp đầy khoảng trống dữ liệu giải trình tự HCV bản địa mà còn làm chủ công nghệ giải trình tự chuỗi Sanger nội địa hóa, giảm phụ thuộc vào sinh phẩm ngoại nhập đắt đỏ, tạo tiền đề vững chắc cho công tác y học chính xác trong điều trị viêm gan C.

---

Methodology và approach

Thiết kế nghiên cứu và quy trình thao tác chuẩn

Nghiên cứu được thiết kế theo hướng thực nghiệm ứng dụng công nghệ sinh học phân tử, chia thành 5 giai đoạn liên hoàn khép kín:

[Mẫu huyết thanh (500 µl)]
[Tách chiết RNA (Hạt Silica / Đệm L6-L2)]
[Tổng hợp cDNA (RT-PCR với Random Hexamer)]
[Sàng lọc sơ bộ (Real-time PCR 5'UTR)]
[Khuếch đại mục tiêu (Nested RT-PCR 2 bước cho Core & NS5B)]
[Tinh sạch cột lọc & Đo mật độ quang OD 260/280]
[Giải trình tự Sanger chuỗi kép (BigDye v3.1 / ABI 3500)]
[Phân tích Tin sinh học & Dựng cây phát sinh loài (MEGA 7.0)]

Thu thập mẫu và quy trình tách chiết hóa sinh

• Nguồn mẫu: 100 mẫu huyết thanh nghi ngờ nhiễm HCV thu thập từ các đơn vị y tế và đối tác chẩn đoán tại TP.HCM, bảo quản nghiêm ngặt ở nhiệt độ -80°C.
• Tối ưu hóa tách chiết: Khảo sát đối chứng giữa 3 phương pháp: bộ kit thương mại High Pure RNA Tissue Kit (Roche), phương pháp Phenol-Chloroform truyền thống và phương pháp hạt Silica (Boom et al., cải tiến). Kết quả chứng minh phương pháp Silica sử dụng đệm ly giải L6 (Guanidine thiocyanate + Triton X-100) và đệm rửa L2 cho hiệu suất thu hồi RNA cao nhất, loại bỏ triệt để chất ức chế với chi phí tiết kiệm tối ưu.

Kỹ thuật Nested RT-PCR và thiết kế mồi thoái hóa

Hệ thống mồi được thiết kế chứa các nucleotide thoái hóa (degenerate) nhằm bắt cặp bao phủ toàn bộ các biến chủng HCV:

• Vùng Core (Kích thước sản phẩm 473 bp):
  • Mồi vòng 1: Co-f (5’-GCA ACA GGG AAY YTD CCY GGT TGC TC-3’) và C-r (5’-TTC ATC ATC ATR TCC CAN GCC AT-3’).
  • Mồi vòng 2: Ci-f (5’-AAY YTD CCC GGT TGC TCY TTY TCT AT-3’) và C-r.
• Vùng NS5B (Kích thước sản phẩm 392 bp):
  • Mồi vòng 1: NS5Bo-f (5’-TGG GGT TYT CNT ATG AYA CCC GMT G-3’) và NS5B-r (5’-GGN GCN GAR TAC CTV GTC ATA GCY TCC GTG AA-3’).
  • Mồi vòng 2: NS5Bi-f (5’-TAT GAY ACC CGC TGY TTT GAC TC-3’) và NS5B-r.
• Điều kiện nhiệt tối ưu: Phản ứng khuếch đại bước 1 đạt hiệu quả cao nhất ở nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) là 60°C; bước 2 là 55°C.

                  Sơ đồ vị trí bắt cặp Nested-PCR
  Vùng Core:

  Vùng NS5B:

Kỹ thuật giải trình tự và kiểm soát chất lượng dữ liệu

Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch qua cột lọc GeneAll Expin™ PCR SV, kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (đạt chuẩn 1,8 – 2,0). Phản ứng đọc trình tự chu kỳ sử dụng BigDye® Terminator v3.1 và phân tích mao quản trên hệ thống tự động ABI 3500. Dữ liệu sóng sắc ký đồ (chromatogram) được tinh chỉnh bằng phần mềm ATGC v7.0 để loại bỏ tín hiệu nhiễu đầu/cuối đọc, xuất file FASTA và gióng hàng bằng Clustal Omega. Cây phát sinh loài được thiết lập bằng thuật toán Neighbor-Joining với 1.000 lần lặp bootstrap trên phần mềm MEGA 7.0.

---

Phát hiện chính

Nghiên cứu mang lại nhiều phát hiện có giá trị khoa học và dịch tễ học thực tiễn cao:

1. Phân bố kiểu gen phản ánh đặc thù dịch tễ phía Nam Việt Nam

Trong số 48 mẫu bệnh phẩm được giải trình tự và định danh thành công, cấu trúc kiểu gen phân bố như sau:

• Genotype 6 chiếm tỷ lệ áp đảo (50,0%): Bao gồm 18 mẫu với tính đa dạng di truyền cực kỳ cao, trải rộng trên các phân nhóm: 6a, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l. Điều này củng cố các báo cáo dịch tễ học quốc tế rằng Việt Nam là một trong những trung tâm tiến hóa và lưu hành phức tạp nhất của genotype 6.
• Genotype 1 đứng thứ hai (37,5%): Gồm 27 mẫu định type phân nhóm chủ yếu là 1a, 1b và subtype hiếm 1n.
• Genotype 2 chiếm tỷ lệ nhỏ (12,5%): Gồm 7 mẫu với các subtype 2a, 2i, 2m.
• Hoàn toàn không phát hiện genotype 3, 4, 5 trong tập mẫu khảo sát.

Genotype	Số lượng mẫu	Tỷ lệ (%)	Các Subtype phát hiện
Genotype 1	27	37,5%	1a, 1b, 1n
Genotype 2	7	12,5%	2a, 2i, 2m
Genotype 6	18	50,0%	6a, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l

2. Phát hiện hiện tượng lệch kiểu gen giữa vùng Core và NS5B

Một trong những phát hiện đáng chú ý nhất là sự hiện diện của 3 mẫu bệnh phẩm có kết quả genotype không đồng nhất giữa hai vùng gen:

• Mẫu HCV01: Vùng core xác định là 6a, nhưng vùng NS5B lại mang trình tự đặc trưng của 1a.
• Mẫu HCV19: Vùng core là 6a, trong khi vùng NS5B là 6h.
• Mẫu HCV49: Vùng core thuộc 1b, vùng NS5B thuộc 6h.
• Mẫu HCV72: Vùng core xác định 6a, vùng NS5B xác định 1a.

Hiện tượng này minh chứng cho tình trạng đồng nhiễm nhiều chủng virus cùng lúc ở các nhóm nguy cơ cao hoặc sự hình thành biến chủng tái tổ hợp tự nhiên (intergenotypic recombinant), điều mà các phương pháp xét nghiệm đơn vùng gen (như chỉ phân tích 5’UTR) chắc chắn sẽ bỏ sót hoặc kết luận sai lệch.

3. Nhận diện các biến thể đột biến né mồi

Nghiên cứu ghi nhận 3 mẫu bệnh phẩm (CR05, CR49, CR50) cho tín hiệu huỳnh quang rất cao trong phản ứng Real-time PCR vùng 5’UTR ($C_q$ thấp, nồng độ bản sao virus lớn) nhưng hoàn toàn thất bại trong phản ứng nhân bản vùng core và NS5B. Hiện tượng này chỉ ra sự tồn tại của các đột biến nucleotide nghiêm trọng tại vị trí bám của mồi trên bộ gen HCV, gợi mở về các biến thể mới chưa từng công bố tại Việt Nam.

4. Độ chuẩn xác và tính tương đồng với các cơ sở dữ liệu quốc tế

Kết quả phân loại kiểu gen dựa trên cây phát sinh loài từ quy trình nghiên cứu tương thích 100% khi đối chiếu chéo với 3 hệ thống dữ liệu hàng đầu thế giới: NCBI Genotyping Tool, Oxford HCV Automated Subtyping Tool v2.0 và Los Alamos HCV BLAST. Thêm vào đó, quy trình chứng minh độ chính xác vượt trội khi phân giải thành công các mẫu mà các kỹ thuật xét nghiệm thường quy tại phòng khám lâm sàng (điển hình như mẫu CR28 và CR80) không thể phân loại rõ ràng hoặc cho kết quả nhầm lẫn.

---

Đóng góp khoa học

Giá trị học thuật và tiến bộ phương pháp

• Về mặt phương pháp luận: Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật tích hợp khép kín từ khâu ly giải hạt silica tự điều chế, phản ứng RT-PCR mồi ngẫu nhiên, Nested-PCR đa vùng gen đến giải trình tự Sanger và tin sinh học phân tử. Quy trình đạt hiệu suất nhân bản thành công 94% (48/51 mẫu đủ tiêu chuẩn bản mẫu).
• Khắc phục hạn chế vùng 5’UTR: Chứng minh trên thực nghiệm rằng việc sử dụng phối hợp hai vùng gen biến động core và NS5B là giải pháp tối ưu nhất để định danh các subtype khó tách biệt thuộc genotype 6 – vốn rất dễ bị nhầm thành genotype 1 nếu chỉ dựa trên 5’UTR.

Ứng dụng thực tiễn trong y học chính xác

• Cung cấp công cụ chẩn đoán phân tử có giá trị định hướng phác đồ thuốc DAAs thế hệ mới. Việc biết chính xác subtype (ví dụ 1a so với 1b, hoặc các biến chủng 6h, 6l) giúp bác sĩ tiên lượng nguy cơ thất bại điều trị, cá thể hóa thời gian dùng thuốc và chỉ định phác đồ phối hợp kháng protease/polymerase chuẩn xác.
• Chuyển giao công nghệ cho các bệnh viện, trung tâm xét nghiệm y khoa lớn trong nước nhằm thiết lập dịch vụ xét nghiệm định genotype tiêu chuẩn vàng với chi phí hợp lý.

---

Đối tượng quan tâm

                               ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI
[Bác sĩ Lâm sàng & Truyền nhiễm] [Nhà Dịch tễ học & Nhà Khoa học] [Phòng Xét nghiệm & Đơn vị Y tế]
 - Cá thể hóa phác đồ DAAs       - Giám sát tiến hóa HCV         - Ứng dụng quy trình chuẩn vàng
 - Dự phòng kháng thuốc          - Phát hiện biến chủng tái tổ hợp - Tối ưu chi phí xét nghiệm

• Bác sĩ Lâm sàng & Chuyên khoa Truyền nhiễm / Tiêu hóa Gan mật: Sử dụng kết quả định danh subtype chi tiết làm căn cứ khoa học vững chắc để chỉ định phác đồ điều trị DAAs, đặc biệt trên các ca nhiễm phức tạp, bệnh nhân đồng nhiễm hoặc có tiền sử thất bại điều trị.
• Các nhà Dịch tễ học và Nhà nghiên cứu Vi sinh - Virus học: Sở hữu bộ công cụ giải trình tự phân tử chuẩn xác để theo dõi biến động các cụm dịch tễ, nghiên cứu tỷ lệ lưu hành của genotype 6 và phát hiện kịp thời các biến chủng tái tổ hợp mới tại Đông Nam Á.
• Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Tiếp nhận quy trình kỹ thuật đã được chuẩn hóa để triển khai dịch vụ chẩn đoán chất lượng cao, từng bước làm chủ công nghệ giải mã gen thế hệ mới phục vụ y tế dự phòng.

---

FAQ (Câu hỏi thường gặp)

1. Phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là gì?

Phát hiện nổi bật nhất là genotype 6 chiếm tỷ lệ chi phối tuyệt đối (50%) với phổ subtype rất phong phú tại miền Nam Việt Nam, đồng thời phát hiện các trường hợp dị biệt genotype giữa vùng core và vùng NS5B (hiện tượng đồng nhiễm hoặc tái tổ hợp di truyền chủng virus).

2. Phương pháp giải trình tự của đề tài có điểm gì ưu việt hơn xét nghiệm thường quy?

Các xét nghiệm thương mại phổ biến (như Real-time PCR đầu dò TaqMan hay Real-time PCR vùng 5'UTR) thường chỉ phân biệt được genotype ở mức độ nhóm lớn và rất dễ nhầm lẫn các phân nhóm genotype 6. Kỹ thuật giải trình tự Sanger kết hợp phân tích đa vùng (core + NS5B) là "tiêu chuẩn vàng", cho phép đọc trực tiếp từng nucleotide, dựng cây phân loại chính xác tuyệt đối đến từng subtype vi mô.

3. Phương pháp tách chiết hạt Silica trong nghiên cứu có ưu thế gì?

Phương pháp Silica tự pha chế trong nghiên cứu sử dụng Guanidine thiocyanate kết hợp hạt Silicon dioxide tinh khiết hóa, giúp thu nhận RNA chất lượng cao từ thể tích huyết thanh 500 µl, cho độ nhạy vượt trội so với Phenol-Chloroform và có chi phí hóa chất rẻ hơn nhiều lần so với các kit cột lọc thương mại nhập khẩu.

4. Kết quả của nghiên cứu có thể khái quát hóa (generalize) cho toàn quốc không?

Kết quả phản ánh rất chính xác đặc điểm dịch tễ học khu vực phía Nam Việt Nam. Để khái quát hóa trên phạm vi toàn quốc, quy trình cần được mở rộng áp dụng trên các cỡ mẫu lớn hơn tại nhiều vùng địa lý miền Bắc và miền Trung.

5. Hướng phát triển tiếp theo của đề tài là gì?

Nhóm nghiên cứu định hướng thiết kế thêm các mồi phiên mã ngược đặc hiệu cho từng vùng gen để nâng cao độ nhạy trên các mẫu có tải lượng virus cực thấp (< $10^4$ IU/ml), đồng thời cập nhật dữ liệu đột biến kháng thuốc trên vùng gen NS3/4A và NS5A.

---

Kết luận

Đề tài nghiên cứu khoa học cơ sở do Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM thực hiện đã xây dựng thành công quy trình chẩn đoán phân tử chuẩn hóa xác định genotype và subtype của virus viêm gan C (HCV) thông qua kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B. Công trình không chỉ khẳng định năng lực tự chủ công nghệ giải mã gen trong nước mà còn mang lại bộ dữ liệu khoa học quý giá về sự phổ biến áp đảo của genotype 6 tại Việt Nam. Đây là nền tảng kỹ thuật vững chắc cần được tiếp tục nhân rộng, tích hợp vào hệ thống xét nghiệm lâm sàng và y tế dự phòng nhằm tối ưu hóa hiệu quả điều trị và kiểm soát bền vững bệnh viêm gan virus C.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virus C là một bệnh nhiễm do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Đặc điểm nổi bật của bệnh này là bệnh tiến triển rất thầm lặng trong một thời gian dài nên người bệnh không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc không điều trị đúng lúc có thể dẫn đến các biến chứng như xơ gan (khoảng 10 – 20% số bệnh nhân nhiễm HCV) hoặc nguy hiểm hơn là ung thư gan (khoảng 5% số bệnh nhân nhiễm HCV). Quan trọng hơn là cho đến nay chưa có vaccine phòng bệnh viêm gan virus C nên điều trị là phương thức duy nhất giúp ngăn ngừa việc lan truyền HCV trong cộng đồng cũng như đem lại những ích lợi cho sức khỏe của bệnh nhân.

Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải là một yếu tố cần phải được xác định trước khi điều trị vì nó ảnh hưởng đến quyết định phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị. Có nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển để xác định genotype HCV phục vụ trong điều trị bao gồm real-time PCR, lai phân tử, giải trình tự nucleotide. Trong số các phương pháp xác định genotype HCV thì giải trình tự nucleotide được xem như một phương pháp tiêu chuẩn vì nó xác định chính xác genotype HCV dựa trên phân tích trình tự các vùng gen đặc trưng của virus này. Trên thực tế, các phương pháp xác định genotype HCV khác đều sử dụng phương pháp giải trình tự nucleotide như một chuẩn vàng để so sánh.

Việt Nam là nước có tỷ lệ lưu hành HCV thuộc loại cao trên thế giới nên nhu cầu kiểm soát bệnh nhiễm này thông qua điều trị này là vô cùng to lớn. Đứng trước nhu cầu thực tiễn này, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình xác định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B” nhằm phục vụ cho mục tiêu điều trị hiệu quả bệnh viêm gan virus C. Đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao khi nhằm tới việc đưa ra một quy trình xác định genotype của HCV một cách chính xác và hiệu quả dựa trên phương pháp giải trình tự nucleotide các vùng gen đặc trưng của virus này. Quy trình xác định genotype này không những được ứng dụng để phục vụ điều trị bệnh viêm gan virus C trong thực tế lâm sàng mà còn có có thể được sử dụng như một công cụ phân tử để nghiên cứu về dịch tễ các genotype của HCV cũng như tìm ra những biến chủng mới của HCV tại Việt Nam.

Bên cạnh đó, thông qua việc thực hiện đề tài quy trình kỹ thuật giải trình tự gen xác định genotype HCV sẽ được thiết lập ở Trung tâm Công nghệ Sinh học tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu và ứng dụng có liên quan. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vào thập niên 60 của thế kỷ 20, người ta phát hiện được hai loại viêm gan với những cách lây nhiễm khác nhau: lây lan qua đường tiêu hóa như trường hợp của virus A (Hepatitis A Virus – HAV); lây lan qua đường tiêm chích và qua các sản phẩm của máu như trường hợp của virus B (Hepatitis B Virus – HBV). Một thời gian ngắn sau đó, người ta ghi nhận thêm một nhóm virus không phải HAV cũng không phải HBV và gọi tên chung là nhóm virus không A không B (non A – non B hepatitis virus) [1]. Trong vòng 16 năm kể từ khi phát hiện sự tồn tại của nhóm virus không A không B thì người ta vẫn chưa xác định được nhân tố bí ẩn gây ra căn bệnh này.

Năm 1975, 6 Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan virus sau truyền máu không do HBV và có thời kì ủ bệnh dài hơn thời kì ủ bệnh do HAV. Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan virus loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan virus A và từ lúc này danh từ "bệnh viêm gan virus không A không B" ra đời. Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan virus không A không B được công bố. Bằng phương pháp li tâm siêu tốc huyết tương thu từ những con tinh tinh bị bệnh viêm gan virus, Choo và cộng sự đã tách chiết nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ gen) của gt11 và xâm nhiễm E.

Trong số hàng triệu dòng thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan virus không A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng bệnh viêm gan virus không A không B do một loại virus mới gây ra, đó là virus C (HCV) [2], [3]. HCV là virus thuộc họ Flaviviridae. Đây là một loại virus nhỏ, có vỏ lipid, kích thước khoảng 30-50nm.

Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch (+), chứa khoảng 9600 nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3. Genome chứa một khuôn đọc mở (Open Reading Frame) với các trình tự được trình bày trong Hình II.1: Sơ đồ cấu trúc genome HCV - Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã. - C (nucleocapsid): protein lõi - E1 (envelope): protein vỏ - E2 (envelope): protein vỏ - NS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng - NS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro - NS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng - NS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền 7 - Đầu 3’ không dịch mã 1. Vòng đời (life cycle) của HCV Đầu tiên, HCV gắn vào một receptor (thụ thể) chưa được xác định trên bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2.

HCV xâm nhập vào bên trong tế bào gan sau một quá trình hòa màng (membrane fusion). RNA mạch dương (+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ. Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để tạo ra các protein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1 – NS5). Sau khi HCV đã tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch âm (-) bổ sung với mạch (+) đã có.

Chính mạch RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV. Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2 sẽ kết hợp với RNA genome của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác. Dịch tễ học viêm gan virus C Đa số trường hợp nhiễm HCV là do lây truyền qua đường máu hoặc tiêm chích nhưng hơn một nửa số bệnh nhân bị nhiễm không có tiền căn tiêm chích hoặc truyền máu.

Vấn đề đặt ra là con đường lây truyền ở các bệnh nhân này. Một mặt, HCV lây truyền qua đường tiếp xúc sinh dục (bao gồm đồng tính và dị tính luyến ái) và đường mẹ truyền sang con với tỉ lệ rất thấp. Mặt khác, HCV ít hiện diện trong các dịch cơ thể nên đường lây do tiếp xúc thông thường rất hiếm. Vì vậy, câu trả lời cho căn nguyên của HCV còn đang bỏ ngỏ.

Khoảng 70% bệnh nhân viêm gan virus C trở thành người mang mầm bệnh mạn tính. Trên thế giới, theo ước tính của WHO (3/2011), tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới là 2,2% khoảng 170 triệu người, 3 – 4 triệu người mới nhiễm mỗi năm. Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế có 2 triệu người đang mắc viêm gan virus C, trong đó tỉ lệ tử vong chiếm gần 6%. Khoảng 85% trường hợp nhiễm HCV biến chuyển thành viêm gan C mạn tính, khoảng 20 – 25% sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan, ung thư gan [1], [4], [5].

Tính đến năm 2014, chỉ có 7 nghiên cứu về HCV genotype ở Việt Nam được công bố, trong nghiên cứu của Messina và cộng sự, sự lưu hành các genotype ở Việt Nam là 86 ngàn người mắc genotype 1 (60,56%), 8 ngàn người mắc genotype 2 (5,9%), 7 ngàn người mắc genotype 3 (4,79%), 41 ngàn người mắc genotype 6 (28,57%) và không có trường hợp nhiễm genotype 4 và 5 [6].2: Sự lưu hành virus hepatitis C giữa người lớn và phân bố genotype 3. Đặc điểm bệnh lý của viêm gan virus C Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm gan virus C cấp tính không khác biệt so với các loại viêm gan virus khác cho dù thời kì ủ bệnh (22 – 60 ngày) ngắn hơn so với viêm gan virus B và dài hơn viêm gan virus A. Hầu hết các bệnh nhân cấp tính đều không thể hiện rõ các triệu chứng hoặc chỉ biểu hiện các triệu chứng nhẹ, không đặc trưng. Chỉ có 25% bệnh nhân biểu hiện vàng da, vàng mắt.

Hơn nữa, các tình trạng viêm gan virus cấp tính nghiêm trọng và bùng phát đột ngột rất hiếm khi xảy ra cho nên khó phát hiện tình trạng nhiễm bệnh. Mặc dù không có triệu chứng hoặc triệu chứng rất nhẹ và khó phát hiện nhưng viêm gan virus C cấp tính vẫn thường biểu hiện dấu hiệu sưng gan mạn tính. Người ta thấy rằng nồng độ alanine aminotransferase (ALT) huyết thanh tuy tồn tại gián đoạn nhưng vẫn tăng cao một cách hằng định trong 50% trường hợp viêm gan virus C. Điều này cho thấy quá trình bệnh vẫn đang tiếp diễn.

Các mẫu sinh thiết gan cho thấy tình trạng viêm gan virus mạn tính dạng hoạt động (chronic active hepatitis – CAH) có trong 60% số bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính và tình trạng xơ gan trong 20% trường hợp. Ngoài ra, người ta còn thấy có một tỉ lệ nhất định các bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính chuyển sang tình trạng hoại tử gan hoặc là các biến chứng cao huyết áp. Đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu về các biến chứng của bệnh viêm gan virus C. Kyosawa và cộng sự (1984) đã mô tả một trường hợp tiến triển từ viêm gan virus mạn tính dạng dai dẳng (chronic persistent hepatitis – CPH) sang CAH, rồi sang xơ gan và ung thư gan ở một bệnh nhân viêm gan virus không A không B sau truyền máu.

Các báo cáo khác cho thấy ở một tỉ lệ nhỏ bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính xuất hiện ung thư gan nguyên phát và có sự hiện diện của kháng thể kháng HCV trong nhiều bệnh nhân bị ung thư gan [1], [4]. Sự đa dạng di truyền của HCV HCV có sự đa dạng di truyền cao đặc trưng bởi sự lưu hành của nhiều genotype.