ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virus C là một bệnh nhiễm do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Đặc điểm nổi bật của bệnh này là bệnh tiến triển rất thầm lặng trong một thời gian dài nên người bệnh không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc không điều trị đúng lúc có thể dẫn đến các biến chứng như xơ gan (khoảng 10 – 20% số bệnh nhân nhiễm HCV) hoặc nguy hiểm hơn là ung thư gan (khoảng 5% số bệnh nhân nhiễm HCV). Quan trọng hơn là cho đến nay chưa có vaccine phòng bệnh viêm gan virus C nên điều trị là phương thức duy nhất giúp ngăn ngừa việc lan truyền HCV trong cộng đồng cũng như đem lại những ích lợi cho sức khỏe của bệnh nhân.
Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải là một yếu tố cần phải được xác định trước khi điều trị vì nó ảnh hưởng đến quyết định phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị. Có nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển để xác định genotype HCV phục vụ trong điều trị bao gồm real-time PCR, lai phân tử, giải trình tự nucleotide. Trong số các phương pháp xác định genotype HCV thì giải trình tự nucleotide được xem như một phương pháp tiêu chuẩn vì nó xác định chính xác genotype HCV dựa trên phân tích trình tự các vùng gen đặc trưng của virus này. Trên thực tế, các phương pháp xác định genotype HCV khác đều sử dụng phương pháp giải trình tự nucleotide như một chuẩn vàng để so sánh.
Việt Nam là nước có tỷ lệ lưu hành HCV thuộc loại cao trên thế giới nên nhu cầu kiểm soát bệnh nhiễm này thông qua điều trị này là vô cùng to lớn. Đứng trước nhu cầu thực tiễn này, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình xác định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core và NS5B” nhằm phục vụ cho mục tiêu điều trị hiệu quả bệnh viêm gan virus C. Đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao khi nhằm tới việc đưa ra một quy trình xác định genotype của HCV một cách chính xác và hiệu quả dựa trên phương pháp giải trình tự nucleotide các vùng gen đặc trưng của virus này. Quy trình xác định genotype này không những được ứng dụng để phục vụ điều trị bệnh viêm gan virus C trong thực tế lâm sàng mà còn có có thể được sử dụng như một công cụ phân tử để nghiên cứu về dịch tễ các genotype của HCV cũng như tìm ra những biến chủng mới của HCV tại Việt Nam.
Bên cạnh đó, thông qua việc thực hiện đề tài quy trình kỹ thuật giải trình tự gen xác định genotype HCV sẽ được thiết lập ở Trung tâm Công nghệ Sinh học tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu và ứng dụng có liên quan. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vào thập niên 60 của thế kỷ 20, người ta phát hiện được hai loại viêm gan với những cách lây nhiễm khác nhau: lây lan qua đường tiêu hóa như trường hợp của virus A (Hepatitis A Virus – HAV); lây lan qua đường tiêm chích và qua các sản phẩm của máu như trường hợp của virus B (Hepatitis B Virus – HBV). Một thời gian ngắn sau đó, người ta ghi nhận thêm một nhóm virus không phải HAV cũng không phải HBV và gọi tên chung là nhóm virus không A không B (non A – non B hepatitis virus) [1]. Trong vòng 16 năm kể từ khi phát hiện sự tồn tại của nhóm virus không A không B thì người ta vẫn chưa xác định được nhân tố bí ẩn gây ra căn bệnh này.
Năm 1975, 6 Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan virus sau truyền máu không do HBV và có thời kì ủ bệnh dài hơn thời kì ủ bệnh do HAV. Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng bệnh viêm gan virus loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan virus A và từ lúc này danh từ "bệnh viêm gan virus không A không B" ra đời. Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan virus không A không B được công bố. Bằng phương pháp li tâm siêu tốc huyết tương thu từ những con tinh tinh bị bệnh viêm gan virus, Choo và cộng sự đã tách chiết nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ gen) của gt11 và xâm nhiễm E.
Trong số hàng triệu dòng thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan virus không A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng bệnh viêm gan virus không A không B do một loại virus mới gây ra, đó là virus C (HCV) [2], [3]. HCV là virus thuộc họ Flaviviridae. Đây là một loại virus nhỏ, có vỏ lipid, kích thước khoảng 30-50nm.
Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch (+), chứa khoảng 9600 nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3. Genome chứa một khuôn đọc mở (Open Reading Frame) với các trình tự được trình bày trong Hình II.1: Sơ đồ cấu trúc genome HCV - Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã. - C (nucleocapsid): protein lõi - E1 (envelope): protein vỏ - E2 (envelope): protein vỏ - NS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng - NS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro - NS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng - NS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền 7 - Đầu 3’ không dịch mã 1. Vòng đời (life cycle) của HCV Đầu tiên, HCV gắn vào một receptor (thụ thể) chưa được xác định trên bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2.
HCV xâm nhập vào bên trong tế bào gan sau một quá trình hòa màng (membrane fusion). RNA mạch dương (+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ. Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để tạo ra các protein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1 – NS5). Sau khi HCV đã tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch âm (-) bổ sung với mạch (+) đã có.
Chính mạch RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV. Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2 sẽ kết hợp với RNA genome của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác. Dịch tễ học viêm gan virus C Đa số trường hợp nhiễm HCV là do lây truyền qua đường máu hoặc tiêm chích nhưng hơn một nửa số bệnh nhân bị nhiễm không có tiền căn tiêm chích hoặc truyền máu.
Vấn đề đặt ra là con đường lây truyền ở các bệnh nhân này. Một mặt, HCV lây truyền qua đường tiếp xúc sinh dục (bao gồm đồng tính và dị tính luyến ái) và đường mẹ truyền sang con với tỉ lệ rất thấp. Mặt khác, HCV ít hiện diện trong các dịch cơ thể nên đường lây do tiếp xúc thông thường rất hiếm. Vì vậy, câu trả lời cho căn nguyên của HCV còn đang bỏ ngỏ.
Khoảng 70% bệnh nhân viêm gan virus C trở thành người mang mầm bệnh mạn tính. Trên thế giới, theo ước tính của WHO (3/2011), tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới là 2,2% khoảng 170 triệu người, 3 – 4 triệu người mới nhiễm mỗi năm. Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế có 2 triệu người đang mắc viêm gan virus C, trong đó tỉ lệ tử vong chiếm gần 6%. Khoảng 85% trường hợp nhiễm HCV biến chuyển thành viêm gan C mạn tính, khoảng 20 – 25% sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan, ung thư gan [1], [4], [5].
Tính đến năm 2014, chỉ có 7 nghiên cứu về HCV genotype ở Việt Nam được công bố, trong nghiên cứu của Messina và cộng sự, sự lưu hành các genotype ở Việt Nam là 86 ngàn người mắc genotype 1 (60,56%), 8 ngàn người mắc genotype 2 (5,9%), 7 ngàn người mắc genotype 3 (4,79%), 41 ngàn người mắc genotype 6 (28,57%) và không có trường hợp nhiễm genotype 4 và 5 [6].2: Sự lưu hành virus hepatitis C giữa người lớn và phân bố genotype 3. Đặc điểm bệnh lý của viêm gan virus C Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm gan virus C cấp tính không khác biệt so với các loại viêm gan virus khác cho dù thời kì ủ bệnh (22 – 60 ngày) ngắn hơn so với viêm gan virus B và dài hơn viêm gan virus A. Hầu hết các bệnh nhân cấp tính đều không thể hiện rõ các triệu chứng hoặc chỉ biểu hiện các triệu chứng nhẹ, không đặc trưng. Chỉ có 25% bệnh nhân biểu hiện vàng da, vàng mắt.
Hơn nữa, các tình trạng viêm gan virus cấp tính nghiêm trọng và bùng phát đột ngột rất hiếm khi xảy ra cho nên khó phát hiện tình trạng nhiễm bệnh. Mặc dù không có triệu chứng hoặc triệu chứng rất nhẹ và khó phát hiện nhưng viêm gan virus C cấp tính vẫn thường biểu hiện dấu hiệu sưng gan mạn tính. Người ta thấy rằng nồng độ alanine aminotransferase (ALT) huyết thanh tuy tồn tại gián đoạn nhưng vẫn tăng cao một cách hằng định trong 50% trường hợp viêm gan virus C. Điều này cho thấy quá trình bệnh vẫn đang tiếp diễn.
Các mẫu sinh thiết gan cho thấy tình trạng viêm gan virus mạn tính dạng hoạt động (chronic active hepatitis – CAH) có trong 60% số bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính và tình trạng xơ gan trong 20% trường hợp. Ngoài ra, người ta còn thấy có một tỉ lệ nhất định các bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính chuyển sang tình trạng hoại tử gan hoặc là các biến chứng cao huyết áp. Đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu về các biến chứng của bệnh viêm gan virus C. Kyosawa và cộng sự (1984) đã mô tả một trường hợp tiến triển từ viêm gan virus mạn tính dạng dai dẳng (chronic persistent hepatitis – CPH) sang CAH, rồi sang xơ gan và ung thư gan ở một bệnh nhân viêm gan virus không A không B sau truyền máu.
Các báo cáo khác cho thấy ở một tỉ lệ nhỏ bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính xuất hiện ung thư gan nguyên phát và có sự hiện diện của kháng thể kháng HCV trong nhiều bệnh nhân bị ung thư gan [1], [4]. Sự đa dạng di truyền của HCV HCV có sự đa dạng di truyền cao đặc trưng bởi sự lưu hành của nhiều genotype.