CHƯƠNG 1.1 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học Giáo sư Lenan C Clark là người đầu tiên phát minh ra điện cực oxy năm 1956, khởi nguồn của Công nghệ cảm biến sinh học [16]. Năm 1962, tại Hội thảo khoa học của Viện Hàn lâm Khoa học New York, ông đã đề xuất một hướng nghiên cứu mới : ‘‘Làm thế nào để tạo ra cảm biến điện hóa thông minh hơn (pH, phân thế, độ dẫn,…) ?’’ khi đưa thêm vào ‘‘lớp chuyển tiếp enzyme giống như màng kẹp giữa, theo kiểu xếp chồng’’. Khái niệm này sau đó được làm sáng tỏ bằng thực nghiệm khi người ta sử dụng điện cực oxy Clark để bẫy men đường (glucose oxidase) thông qua màng thẩm tách. Độ giảm của nồng độ oxy đo được tỷ lệ với nồng độ glucose.
Trong một công trình công bố năm 1962, Clark và Lyon lần đầu tiên đưa ra khái niệm điện cực enzyme [15]. Updike và Hick đã triển khai chi tiết thực nghiệm để chứng minh sự cần thiết để tạo ra điện cực enzyme chức năng đo nồng độ glucose mặc dù nhận được rất nhiều phê bình từ các nhà chuyên môn [59]. Năm 1969, Guilbault và Montalvo công bố chi tiết về điện cực enzyme bằng phương pháp đo thế [28]. Hai ông mô tả cảm biến urea trên cơ sở cố định chất urease tại điện cực màng chất lỏng lọc lựa amoniac.
Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực khi công ty thiết bị Yellow Springs (Ohio, Mỹ) giới thiệu lần thứ hai (lần đầu năm 1973) về thiết bị phân tích glucose sử dụng phương pháp đo thế. Năm 1974, Cooney và đồng nghiệp đề xuất sử dụng bộ chuyển đổi nhiệt cho cảm biến sinh học. Những thiết bị mới loại này được đặt tên tương ứng với đầu dò enzyme nhiệt [18] và men cặp nhiệt [40]. Sự phát triển cảm biến sinh học đã tạo bước đột phá mới vào năm 1975, khi Divis cho rằng có thể sử dụng vi khuẩn làm yếu tố nhận biết sinh học trong các điện cực vi sinh vật để đo nồng độ cồn [25].
Công trình của ông đã khởi đầu cho hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản nhằm tạo ra các loại cảm biến sinh học có khả năng ứng dụng trong kiểm soát môi trường và Công nghệ sinh học. Cũng trong năm 1975, Lubbers và Optitz đưa ra thuật ngữ optode để mô tả cảm biến sợi quang học có gắn chất chỉ thị để đo oxit cácbon II (CO2) hoặc oxy. Trên cơ sở đó, hai ông và đồng nghiệp đã tạo ra cảm biến sinh học tín hiệu quang để đo nồng độ cồn [60]. Năm 1976, Clemens và đồng nghiệp đã tích hợp thành công cảm biến sinh học glucose điện hoá trong tuyến tụy nhân tạo [17], sau đó được Miles (Elkhart) tung ra thị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 trường với thương hiệu: Biostator.
Cùng thời gian này, La Roche (Thuỵ Sỹ) đã giới thiệu bộ phân tích Lactat LA 640 sử dụng chất trung gian dehydrogenase để truyền tải điện tích từ lactat đến điện cực. Mặc dù không thành công về mặt thương mại nhưng thiết bị này lại là một dự báo quan trọng cho một thế hệ cảm biến sinh học mới ra đời. Một tiến bộ lớn của cảm biến sinh học đo glucose ứng dụng trong cơ thể sống được công bố bởi Shichiri và đồng nghiệp năm 1982, khi lần đầu tiên họ mô tả điện cực enzyme kiểu hình kim cấy dưới da [54]. Nhiều công ty vẫn đang theo đuổi triển vọng để phát triển loại thiết bị này, nhưng hiện nay sản phẩm vẫn chưa xuất hiện trên thị trường.
Trong khi đó, ý tưởng tạo ra bộ cảm biến miễn dịch trực tiếp bằng cách cố định kháng thể lên bộ phận chuyển đổi điện thế hay áp điện đã được khảo sát ngay từ những năm 1970 [38], các nhà khoa học đã mô tả khả năng sử dụng cộng hưởng plasmon bề mặt để kiểm soát ngay trong thời gian các phản ứng ái lực xảy ra. Năm 1990, BIAcore (Pharmacia, Thuỵ Điển) đã cho ra mắt loại cảm biến dựa vào công nghệ này. Năm 1984, rất nhiều công trình công bố sử dụng ferrocene và dẫn xuất của nó làm môi trường trung gian để cố định phần tử đầu dò trong cấu trúc điện cực enzyme với giá thành rẻ [13]. Loại cảm biến này được chế tạo trên cơ sở điện cực enzyme bằng kỹ thuật in lưới do MediSense (Cambridge, Mỹ) đề xuất năm 1987 nhằm tạo ra thiết bị kiểm tra nồng độ glucose trong máu có kích cỡ nhỏ như chiếc bút viết.
Doanh thu bán hàng của công ty Medisense tăng theo hàm mũ, đạt tới 175 triệu USD năm 1996. Các tạp chí chuyên ngành hiện nay đăng tải một số lượng lớn các công trình nghiên cứu về các thiết bị khai thác các tính năng của enzyme, axit nucleic, thụ thể tế bào, kháng thể,… kết hợp với các bộ chuyển đổi nhiệt, quang, áp điện, điện hoá [58]. Mỗi phương pháp có thể được sử dụng cho rất nhiều các yếu tố phân tích khác nhau như trong chăm sóc sức khỏe, thực phẩm, kiểm soát môi trường, an ninh quốc phòng, chống khủng bố sinh học,… [8,24,35,60]. Theo Fuji-Keizai Group (Mỹ) dự đoán rằng doanh thu của thị trường cảm biến trên toàn thế giới năm 2007 sẽ đạt khoảng 10,8 tỷ đô la với tốc độ tăng trưởng 10,4% [64].
Với những ưu điểm vượt trội như độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, khả năng phát hiện nhanh, tại chỗ, giá thành rẻ, nên cảm biến sinh học có triển vọng vượt qua hầu hết nhược điểm của các thiết bị thông thường khác. Vì vậy, loại cảm biến này ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các tính năng và khả năng ứng dụng trong phân tích chất lượng thực phẩm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, cảm biến sinh học đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học như ở Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,. Một số kết quả về cảm biến sinh học được nghiên cứu chế tạo trong nước đã được công bố như: cảm biến enzyme để phát hiện nồng độ thuốc trừ sâu, cảm biến DNA,.
Với tiềm năng phát triển và ứng dụng của cảm biến sinh học trong khoa học sự sống, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện gen của một số loại vi rút gây bệnh trên người như vi rút Herpes týp 1&2 – tác nhân gây bệnh lở loét vùng mặt và vùng sinh dục phổ biến nhất trên toàn cầu, vi rút cúm A - loại vi rút đang được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quan tâm hàng đầu,. Việt Nam là một trong những nước nằm trong vùng nóng về dịch và nguy cơ xảy ra đại dịch của cả hai loại vi rút này. Một số kết quả ban đầu về nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng trong y sinh học đã được tác giả công bố trên các tạp chí, hội nghị trong nước và Quốc tế [4,5,29,39].2 Cảm biến sinh học 1.1 Khái niệm cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hoá học ứng dụng - IUPAC năm 1999 đã định nghĩa: cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng cung cấp những thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, sử dụng một yếu tố nhận biết sinh học (thụ thể sinh hóa) duy trì sự tiếp xúc không gian trực tiếp với một phần tử chuyển đổi [22]. Thévenot và đồng nghiệp, hệ thống nhận biết sinh học chuyển thông tin từ vùng sinh hoá, thường là nồng độ chất phân tích thành tín hiệu vật lý hoặc hóa học ở đầu ra với độ nhạy xác định.
Mục đích chính của hệ thống nhận biết này nhằm tạo cho cảm biến có độ chọn lọc cao đối với chất cần phân tích. Phần tử nhận biết sinh học có thể là enzyme, DNA/RNA, kháng nguyên/kháng thể, tế bào,…như mô tả trong bảng 1. Để phát hiện vi rút gây bệnh có thể dựa trên việc phát hiện kháng thể/kháng nguyên thông qua cảm biến miễn dịch hoặc phát hiện DNA/RNA đặc hiệu của từng loại vi rút thông qua cảm biến DNA. Trong khuổn khổ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 của luận văn, tác giả chỉ tập trung giới thiệu về cảm biến DNA với phần tử nhận biết sinh học là DNA để phát hiện axit nucleic đặc hiệu của vi rút gây bệnh.
Các loại thụ thể sử dụng trong cảm biến sinh học và kỹ thuật đo điện hoá [22] Hệ thống ghi nhận thụ thể/hóa Kỹ thuật đo lường/ phương thức Chất phân tích học chuyển đổi Thể mang ion sinh học, tinh thể 1. Ion vô cơ dẫn ion, enzyme, thủy tinh Điện thế; Thế-dòng trao đổi ion,… Điện thế; Thế-dòng Màng kỵ nước hoặc lớp lipid kép; Dòng điện; 2. Khử mùi, khí, Điện cực kim loại trơ; Dòng điện hoặc điện thế gas Enzyme; Dòng điện, điện thế hoặc trở Kháng thể, thụ thể kháng, áp điện hoặc quang học Enzyme; tế bào; thụ thể; Dòng điện hoặc điện thế, độ dẫn, 3. Chất nền Mô động hoặc thực vật áp điện, calo Kháng nguyên/ Kháng thể; Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp 4.
Kháng thể / Oligonucleotid; điện, quang học hay cộng hưởng Kháng nguyên Gắn enzyme; gắn chất phát huỳnh plasmon bề mặt quang hoặc quang hoá 5. Protein hoặc các loại ion, chất Các kênh , thụ thể protein phối tử Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp nền có khối đặc biệt; gắn enzyme hoặc các điện, quang học hay cộng hưởng lượng phân tử chất phát huỳnh quang plasmon bề mặt thấp Chìa khoá của cảm biến sinh học chính là bộ chuyển đổi, đây là bộ phận chuyển tín hiệu không điện từ hệ thống nhận biết sang tín hiệu điện. Phần tử chuyển đổi có thể là vi điện cực, ISFET, linh kiện quang, nhiệt,…Một số phương thức chuyển đổi thông dụng như: điện hoá, quang học, áp điện hay nhiệt,…[30,43,44]. - Chuyển đổi điện hoá: gồm các phép đo dòng, thế, hiệu ứng trường hay độ dẫn.
+ Phép đo dòng: cơ bản dựa trên sự thay đổi dòng điện từ quá trình oxy hóa - khử điện hóa của đối tượng phân tích làm hoạt hoá các điện tích. Phương pháp này thường được thực hiện bởi sự duy trì một điện thế không đổi tại điện cực hoạt động LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 như các bon (C), platin (Pt) hay vàng (Au) hoặc trên một dãy điện cực so với một điện cực chuẩn so sánh. Dòng thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ khối đối tượng phân tích hoạt hóa điện tích hoặc mức tiêu hao sinh ra trong lớp chất xúc tác sinh học.