Tuyển Chọn Vi Khuẩn Đất Có Khả Năng Sinh Kháng Sinh Ức Chế Enterococci và Streptococci

Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn đất có khả năng sinh kháng sinh, ức chế vi khuẩn enterococci và streptococci, góp phần bảo vệ sức khỏe.

• Tác giả: Trần Minh Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Mạnh Tuấn
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tuyển Chọn Vi Khuẩn Đất Sinh Kháng Sinh Ức Chế Enterococci và Streptococci
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Lý do chọn đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tóm lược lịch sử khám phá kháng sinh
• 2.2. Đặc điểm sinh học của Enterococci và Streptococci
• 2.3. Cơ chế kháng thuốc của các chủng Enterococci và Streptococci
• 2.4. Cơ chế tác động của kháng sinh đến Enterococci và Streptococci
• 2.4.1. Ức chế sinh tổng hợp thành tế bào
• 2.4.2. Ức chế sinh tổng hợp protein
• 2.5. Kỹ thuật tách dòng phân tử trong nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh và thách thức
• 2.6. Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu đất
• 3.3.2. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn đất
• 3.3.3. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh hoạt chất kháng khuẩn
• 3.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và nhân trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập
• 3.3.5. Phương pháp phân loại và xây dựng sơ đồ phả hệ
• 3.3.6. Phương pháp xác định đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45
• 3.3.7. Phương pháp tách chiết hoạt chất kháng khuẩn tổng số
• 3.3.8. Phương pháp đánh giá hoạt chất kháng khuẩn (MIC90)
• 3.3.9. Nhận diện hoạt chất KKTS bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khối phổ
• 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh trưởng chậm có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn
• 4.2. Định danh phân tử chủng BPTC-45
• 4.3. Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45
• 4.4. Khả năng sinh trưởng và màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố tan
• 4.5. Môi trường thích hợp cho sinh hoạt chất kháng khuẩn
• 4.6. Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số của chủng BPTC-45
• 4.7. Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng hệ thống sắc khí khối phổ (GC-MS)
• 4.8. Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng
• 4.9. Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng GCMS
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Tuyển Chọn Vi Khuẩn Đất Kháng Sinh

Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn đất sinh kháng sinh ức chế Enterococci và Streptococci là hướng đi đầy tiềm năng trong bối cảnh kháng kháng sinh gia tăng. Vi khuẩn đất là nguồn gốc tự nhiên giàu có các hợp chất kháng khuẩn. Việc tìm kiếm và phân lập vi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là các chủng đa kháng thuốc như Enterococci và Streptococci, là vô cùng cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc sàng lọc vi khuẩn từ đất nông nghiệp và đất tự nhiên, đánh giá khả năng sinh chất kháng khuẩn của chúng, và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Mục tiêu cuối cùng là tìm ra các giải pháp thay thế cho kháng sinh tổng hợp, giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Theo ước tính, mỗi năm có khoảng 8.6 triệu người tử vong trên toàn thế giới do các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc [de Kraker và cs, 2016]

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Vi Khuẩn Đất Kháng Khuẩn

Tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người. Các chủng Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc đang lan rộng nhanh chóng, gây khó khăn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng. Việc tuyển chọn vi khuẩn đất có khả năng sinh kháng sinh mở ra cơ hội tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn mới, có cơ chế kháng khuẩn độc đáo, từ đó ức chế vi khuẩn gây bệnh một cách hiệu quả. Nghiên cứu này đóng góp vào việc bảo tồn nguồn gốc tự nhiên và phát triển các giải pháp ứng dụng sinh học bền vững.

1.2. Mục Tiêu Và Phạm Vi Nghiên Cứu Tuyển Chọn Vi Khuẩn

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập vi khuẩn từ các mẫu đất khác nhau, bao gồm đất nông nghiệp và đất tự nhiên. Các chủng vi khuẩn đất được tuyển chọn dựa trên khả năng ức chế vi khuẩn Enterococci và Streptococci trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nghiên cứu cũng tiến hành đánh giá kháng sinh của các hợp chất sinh học được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn được tuyển chọn, nhằm xác định tiềm năng ứng dụng sinh học của chúng. Cuối cùng, nghiên cứu hướng đến việc xác định cơ chế kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả ức chế của các hợp chất này.

II. Thách Thức Vấn Đề Kháng Thuốc Enterococci Streptococci

Sự gia tăng của các chủng Enterococci và Streptococci kháng thuốc đặt ra một thách thức lớn đối với y học hiện đại. Các chủng này có khả năng đa kháng thuốc, khiến cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng trở nên khó khăn và tốn kém hơn. Tình trạng này không chỉ gây ảnh hưởng đến sức khỏe cá nhân mà còn tạo ra gánh nặng cho hệ thống y tế. Theo kết quả về tình hình kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện lớn ở Việt Nam cho thấy các loài của Enterococci có khả năng kháng Ampicilin, Vancomycin, Erythromycin và Ciprofloxacin lần lượt là 28,6; 5,3; 70; và 30%; trong khi có tới 71,4% số loài Streptococci kháng penicillin và kháng erythromycin (chiếm 92). Chính vì vậy, nước ta nằm trong các nước có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất thế giới, các “siêu vi khuẩn” Enterococci và Streptococci kháng thuốc xuất hiện ở hầu hết ở các bệnh viện trong cả nước

2.1. Thực Trạng Kháng Thuốc Của Enterococci Và Streptococci

Các chủng Enterococci và Streptococci kháng thuốc đã lan rộng trên toàn cầu, gây ra nhiều vụ dịch bệnh nghiêm trọng. Enterococci kháng Vancomycin (VRE) và Streptococci kháng Penicillin là những ví dụ điển hình. Tình trạng này khiến cho các bác sĩ phải sử dụng các loại kháng sinh mạnh hơn, đắt tiền hơn, và có nhiều tác dụng phụ hơn. Đồng thời, việc điều trị trở nên kéo dài hơn, làm tăng nguy cơ lây lan vi khuẩn gây bệnh trong cộng đồng.

2.2. Nguyên Nhân Gây Ra Tình Trạng Kháng Thuốc Kháng Sinh

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi, và sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh trong môi trường bệnh viện là những yếu tố chính. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng. Vi khuẩn có thể phát triển các cơ chế để vô hiệu hóa tác dụng của kháng sinh, hoặc thay đổi cấu trúc tế bào để ngăn chặn kháng sinh xâm nhập.

III. Phương Pháp Tuyển Chọn Vi Khuẩn Đất Sinh Kháng Sinh Hiệu Quả

Nghiên cứu sử dụng phương pháp tuyển chọn vi khuẩn từ vi sinh vật đất có khả năng sinh kháng sinh ức chế Enterococci và Streptococci. Quy trình bao gồm các bước: thu thập mẫu đất, phân lập vi khuẩn, sàng lọc vi khuẩn dựa trên hoạt tính kháng khuẩn, định danh vi khuẩn, và đánh giá kháng sinh. Phương pháp này tập trung vào việc tạo môi trường nuôi cấy đặc biệt, sử dụng dịch chiết đất, nhằm kích thích sự phát triển của các chủng vi khuẩn đất sinh trưởng chậm, có tiềm năng sinh chất kháng khuẩn mới. Trong nghiên cứu này, nhóm vi khuẩn đất sinh trưởng chậm được phân lập thông qua môi trường dịch chiết đất nhằm thu nhận được nguồn gen vi khuẩn mới tiềm năng cho phát hiện kháng sinh tự nhiên và từng bước kiểm soát bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Enterococci và Streptococci gây ra.

3.1. Thu Thập Và Xử Lý Mẫu Đất Nghiên Cứu Vi Khuẩn

Mẫu đất được thu thập từ các khu vực khác nhau, bao gồm đất nông nghiệp và đất tự nhiên, để đảm bảo tính đa dạng của vi sinh vật đất. Mẫu đất được xử lý và chuẩn bị theo quy trình tiêu chuẩn để loại bỏ các tạp chất và tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân lập vi khuẩn. Việc lựa chọn địa điểm thu thập mẫu đất cần cân nhắc đến các yếu tố như loại đất, độ ẩm, và lịch sử sử dụng đất.

3.2. Phân Lập Và Sàng Lọc Vi Khuẩn Đất Có Khả Năng Kháng Khuẩn

Các chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất bằng phương pháp pha loãng và cấy trải trên môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc có hình thái khác nhau được chọn lọc và nuôi cấy riêng. Sàng lọc vi khuẩn được thực hiện bằng cách đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của Enterococci và Streptococci trên đĩa thạch. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao được chọn để nghiên cứu tiếp.

3.3. Định Danh Phân Tử Và Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn

Các chủng vi khuẩn được định danh bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA. Kết quả phân tích cho phép xác định chính xác loài vi khuẩn và so sánh với các loài đã được biết đến. Đánh giá kháng sinh được thực hiện bằng cách xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration) của các hợp chất sinh học được sản xuất bởi vi khuẩn. MIC là nồng độ thấp nhất của hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

IV. Kết Quả Phát Hiện Chủng Vi Khuẩn Đất BPTC 45 Tiềm Năng

Nghiên cứu đã thành công trong việc tuyển chọn được chủng vi khuẩn đất BPTC-45 có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn hiệu quả đối với Enterococci và Streptococci. Chủng BPTC-45 được định danh là Streptomyces sp. dựa trên phân tích trình tự gen 16S rRNA. Hoạt chất kháng khuẩn từ chủng BPTC-45 có MIC thấp đối với nhiều chủng Enterococci và Streptococci kháng thuốc. Bảng 1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập bằng phương pháp cấy chấm điểm

4.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Chủng Vi Khuẩn Đất BPTC 45

Chủng vi khuẩn BPTC-45 là vi sinh vật đất Gram dương, hiếu khí, có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại môi trường khác nhau. Chủng có khả năng sản xuất sắc tố melanin và tạo bào tử. Chủng BPTC-45 được đánh giá là vi khuẩn có lợi và có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y học.

4.2. Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Hoạt Chất Từ Chủng BPTC 45

Hoạt chất kháng khuẩn được chiết xuất từ chủng BPTC-45 có hoạt tính ức chế mạnh mẽ đối với nhiều chủng Enterococci và Streptococci, bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc. Hoạt chất có phổ kháng khuẩn rộng, tác động lên nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác. Phân tích hoạt chất bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí khối phổ cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất có tiềm năng kháng khuẩn.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Sản Phẩm Tự Nhiên Từ Vi Khuẩn Đất

Chủng vi khuẩn đất BPTC-45 và hoạt chất kháng khuẩn của nó có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm tự nhiên thay thế kháng sinh tổng hợp. Các ứng dụng sinh học có thể bao gồm: chế phẩm sinh học phòng và trị bệnh cho cây trồng, chế phẩm sinh học cải tạo đất, và chất kháng khuẩn trong y tế và thú y. Giải pháp tìm kiếm các nguồn gen vi khuẩn đất tiềm năng mới được gợi ý cho việc thúc đẩy phát hiện các kháng sinh tự nhiên [Pham và Kim, 2012; Hug và công sự, 2016; Ling và cộng sự, 2015; Lewis, 2017]

5.1. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Bền Vững

Chế phẩm sinh học từ chủng BPTC-45 có thể được sử dụng để phòng và trị bệnh cho cây trồng, thay thế cho thuốc trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Chế phẩm có thể giúp tăng năng suất cây trồng, cải thiện chất lượng nông sản, và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng vi khuẩn probiotic như BPTC-45 có thể giúp cải thiện sức khỏe đất, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng.

5.2. Ứng Dụng Trong Y Tế Và Thú Y

Hoạt chất kháng khuẩn từ chủng BPTC-45 có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới điều trị các bệnh nhiễm trùng do Enterococci và Streptococci, đặc biệt là các chủng đa kháng thuốc. Thuốc có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng máu, và nhiều bệnh nhiễm trùng khác. Việc phát triển các sản phẩm tự nhiên có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ và nguy cơ kháng kháng sinh.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vi Khuẩn Đất Kháng Sinh

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của vi khuẩn đất trong việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn mới. Việc tuyển chọn vi khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên như đất là một hướng đi đầy hứa hẹn trong bối cảnh kháng kháng sinh gia tăng. Nghiên cứu cần được tiếp tục để khám phá sâu hơn về cơ chế kháng khuẩn của chủng BPTC-45 và phát triển các ứng dụng thực tiễn của nó. Cần thiết phải nghiên cứu thêm về độc tính và tính an toàn của hoạt chất kháng khuẩn trước khi đưa vào sử dụng.

6.1. Thách Thức Và Triển Vọng Trong Nghiên Cứu Vi Khuẩn Đất

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc nghiên cứu vi khuẩn đất cũng đối mặt với nhiều thách thức. Việc phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn khó tính là một vấn đề lớn. Việc xác định và tinh chế các hợp chất kháng khuẩn cũng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ sinh học, các thách thức này có thể được vượt qua. Triển vọng trong tương lai là rất lớn, mở ra cơ hội tìm kiếm các giải pháp mới cho vấn đề kháng kháng sinh.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vi Khuẩn Đất Kháng Sinh

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khám phá cơ chế kháng khuẩn chi tiết của hoạt chất từ chủng BPTC-45, tối ưu hóa quá trình sản xuất hoạt chất, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của hoạt chất trên động vật và người, và phát triển các công thức chế phẩm sinh học ổn định và dễ sử dụng. Cần thiết phải mở rộng phạm vi sàng lọc vi khuẩn từ các nguồn gốc tự nhiên khác nhau để tìm kiếm các chủng vi khuẩn có tiềm năng hơn nữa.

Nội dung chính

## Tổng quan nghiên cứu

Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang trở thành một thách thức nghiêm trọng toàn cầu, với ước tính khoảng 8,6 triệu người tử vong hàng năm do các vi khuẩn đa kháng thuốc, và dự báo con số này có thể lên tới 10 triệu người vào năm 2050. Ở Việt Nam, các chủng Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc xuất hiện phổ biến tại các bệnh viện lớn, với tỷ lệ kháng thuốc cao như Enterococci kháng Ampicillin (28,6%), Vancomycin (5,3%), Erythromycin (70%) và Ciprofloxacin (30%), trong khi Streptococci có tỷ lệ kháng Penicillin và Erythromycin lần lượt là 71,4% và 92%. 

Luận văn tập trung vào việc tuyển chọn và xác định đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn đất có khả năng sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn kháng thuốc Enterococci và Streptococci. Nghiên cứu được thực hiện tại Thái Nguyên trong giai đoạn từ tháng 6/2020 đến tháng 9/2022, nhằm tìm kiếm nguồn gen vi khuẩn đất tiềm năng cho phát hiện kháng sinh tự nhiên mới, góp phần kiểm soát các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn đa kháng thuốc gây ra. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các hoạt chất kháng khuẩn mới, hỗ trợ nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc trong cộng đồng.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Kháng sinh và cơ chế tác động:** Kháng sinh là các chất có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn thông qua các cơ chế như ức chế sinh tổng hợp thành tế bào, sinh tổng hợp protein, sao chép DNA và chuyển hóa axit folic.  
- **Cơ chế kháng thuốc của Enterococci và Streptococci:** Bao gồm bất hoạt enzym kháng sinh (β-lactamase), sửa đổi mục tiêu kháng khuẩn, và chuyển gen theo chiều ngang qua các yếu tố di truyền di động (plasmid, transposon).  
- **Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn:** Sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn đất sinh trưởng chậm trên môi trường dịch chiết đất, tách chiết DNA tổng số, nhân trình tự gen 16S rRNA và xây dựng sơ đồ phả hệ để định danh phân tử chủng vi khuẩn.  
- **Phân tích hoạt chất kháng khuẩn:** Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số (KKTS) bằng phương pháp cấy chấm điểm, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC90), nhận diện hoạt chất bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS).

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** 5 mẫu đất nguyên thô bề mặt (độ sâu 5-10 cm) thu thập tại khu vực Mỏ sắt Trại Cau, Đồng Hỷ, Thái Nguyên.  
- **Phương pháp phân lập:** Pha loãng mẫu đất đến 10^-6, cấy trên môi trường ISEM, nuôi cấy 3 tuần ở 28°C, thu nhận 321 khuẩn lạc, trong đó 30 chủng có hoạt tính kháng khuẩn.  
- **Phương pháp tuyển chọn:** Cấy chấm điểm trên môi trường Mueller Hinton chứa các chủng vi khuẩn kiểm định Enterococci và Streptococci, đo vòng vô khuẩn để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.  
- **Phân tích gen:** Tách chiết DNA, PCR nhân gen 16S rRNA, giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu EzTaxon để định danh phân tử.  
- **Đánh giá hoạt chất kháng khuẩn:** Tách chiết KKTS bằng ethyl acetate, xác định MIC90 theo chuẩn CLSI, nhận diện thành phần bằng TLC và GC-MS.  
- **Timeline nghiên cứu:** Thực hiện từ tháng 6/2020 đến tháng 9/2022, bao gồm thu thập mẫu, phân lập, tuyển chọn, phân tích gen và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Phân lập và tuyển chọn:** Thu nhận 321 khuẩn lạc, trong đó 30 chủng (9,35%) có khả năng kháng khuẩn ít nhất một loại vi khuẩn kiểm định. Chủng BPTC-45 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vòng vô khuẩn lên đến 18 mm đối với Enterococcus faecalis CCARM 5171.  
- **Định danh phân tử:** Chủng BPTC-45 có trình tự gen 16S rRNA dài 1479 bp, tương đồng 98,89% với Streptomyces melanogenes, được xác định là ứng viên loài mới thuộc chi Streptomyces.  
- **Đặc điểm nuôi cấy:** BPTC-45 sinh trưởng tốt trên môi trường R2A, TSA và ISP 2, với màu sắc khuẩn ty và sắc tố thay đổi theo môi trường. Môi trường R4 được xác định là thích hợp nhất cho sinh hoạt chất kháng khuẩn với vòng vô khuẩn 17 mm.  
- **Hoạt tính kháng khuẩn KKTS:** Hoạt chất tách chiết từ BPTC-45 có khả năng ức chế 6 chủng vi khuẩn kiểm định với MIC90 dao động từ 0,125 đến 2 µg/ml, vượt trội so với kháng sinh chuẩn norfloxacin (1,25-8 µg/ml).  
- **Phân tích thành phần hoạt chất:** GC-MS xác định 6 hoạt chất chính gồm pristinol, ectoine, 2-methylsoborneol, kinamycin A, antimycin A và esperamicin, trong đó kinamycin A, antimycin A và esperamicin là các kháng sinh phổ rộng có hiệu quả cao.

### Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy chủng Streptomyces sp. BPTC-45 có tiềm năng lớn trong việc sản sinh các hoạt chất kháng khuẩn mới, đặc biệt hiệu quả với các chủng Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc. Việc xác định môi trường R4 tối ưu cho sinh hoạt chất kháng khuẩn giúp nâng cao hiệu quả sản xuất trong nghiên cứu tiếp theo. So sánh với các nghiên cứu trước đây, hoạt tính kháng khuẩn của BPTC-45 vượt trội hơn nhiều chủng vi khuẩn đất đã được báo cáo, đồng thời thành phần hoạt chất chứa các kháng sinh có giá trị y học cao như kinamycin A và antimycin A. Dữ liệu có thể được trình bày qua bảng so sánh vòng vô khuẩn và MIC90 giữa các chủng, cũng như biểu đồ thành phần hoạt chất phân tích bằng GC-MS để minh họa rõ ràng hiệu quả và đa dạng hóa hoạt chất.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Tăng cường nghiên cứu và phát triển:** Đẩy mạnh nghiên cứu sâu về cơ chế sinh tổng hợp và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng BPTC-45 nhằm nâng cao sản lượng hoạt chất kháng khuẩn, mục tiêu tăng 30% sản lượng trong 2 năm tới, do các viện nghiên cứu sinh học thực hiện.  
- **Ứng dụng trong y học:** Khuyến nghị thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng các hoạt chất tách chiết từ BPTC-45 để phát triển thuốc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc, với mục tiêu đưa vào thử nghiệm trong vòng 3 năm.  
- **Phát triển thư viện gen vi khuẩn đất:** Xây dựng thư viện gen vi khuẩn đất đa dạng tại Việt Nam, sử dụng kỹ thuật metagenomic để khai thác nguồn gen tiềm năng, nhằm mở rộng nguồn kháng sinh tự nhiên mới, thực hiện trong 5 năm tới.  
- **Tăng cường quản lý và sử dụng kháng sinh:** Đề xuất các biện pháp kiểm soát việc sử dụng kháng sinh tại bệnh viện và cộng đồng, giảm tỷ lệ kê đơn không hợp lý xuống dưới 20% trong 3 năm, phối hợp với Bộ Y tế và các cơ quan y tế địa phương.  

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật:** Nắm bắt phương pháp phân lập, tuyển chọn và phân tích vi khuẩn đất sinh kháng sinh, phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc mới.  
- **Bác sĩ và chuyên gia y tế:** Hiểu rõ về tình trạng kháng thuốc Enterococci và Streptococci, cũng như các giải pháp kháng sinh mới tiềm năng để áp dụng trong điều trị.  
- **Cơ quan quản lý y tế và chính sách:** Sử dụng dữ liệu để xây dựng chính sách kiểm soát kháng sinh và phát triển nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực kháng sinh.  
- **Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học:** Khai thác nguồn gen vi khuẩn đất và hoạt chất kháng khuẩn mới để phát triển sản phẩm thuốc kháng sinh hiệu quả, đáp ứng nhu cầu thị trường.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Tại sao cần tìm kiếm kháng sinh mới từ vi khuẩn đất?**  
Vi khuẩn đất là nguồn phong phú các gen sinh kháng sinh tự nhiên, đặc biệt trong bối cảnh kháng thuốc gia tăng, việc khai thác vi khuẩn đất giúp phát hiện các hoạt chất mới có hiệu quả cao và ít kháng thuốc.

2. **Chủng BPTC-45 có điểm gì nổi bật?**  
BPTC-45 là ứng viên loài mới thuộc chi Streptomyces, có khả năng sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn hiệu quả với MIC90 thấp hơn nhiều so với kháng sinh chuẩn, đặc biệt ức chế tốt Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc.

3. **Phương pháp nào được sử dụng để xác định hoạt chất kháng khuẩn?**  
Hoạt chất được tách chiết bằng ethyl acetate, đánh giá hoạt tính bằng phương pháp cấy chấm điểm và xác định MIC90 theo chuẩn CLSI, nhận diện thành phần bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS).

4. **Tình hình kháng thuốc Enterococci và Streptococci tại Việt Nam ra sao?**  
Tỷ lệ kháng thuốc rất cao, với Enterococci kháng Ampicillin 28,6%, Vancomycin 5,3%, Erythromycin 70%, và Streptococci kháng Penicillin 71,4%, Erythromycin 92%, gây khó khăn trong điều trị.

5. **Làm thế nào để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn?**  
Kết quả có thể được sử dụng để phát triển thuốc kháng sinh mới, cải tiến quy trình sản xuất, đồng thời hỗ trợ xây dựng chính sách quản lý sử dụng kháng sinh hiệu quả, giảm thiểu kháng thuốc trong cộng đồng.

## Kết luận

- Đã phân lập và xác định chủng Streptomyces sp. BPTC-45 có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn mạnh, ức chế hiệu quả Enterococci và Streptococci đa kháng thuốc.  
- Môi trường R4 được xác định là điều kiện tối ưu cho sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng BPTC-45.  
- Hoạt chất kháng khuẩn tổng số tách chiết có MIC90 thấp, vượt trội so với kháng sinh chuẩn norfloxacin.  
- Phân tích GC-MS xác định nhiều hoạt chất kháng sinh có giá trị y học cao như kinamycin A, antimycin A và esperamicin.  
- Nghiên cứu mở ra hướng đi mới trong phát hiện và phát triển kháng sinh tự nhiên, góp phần kiểm soát tình trạng kháng thuốc tại Việt Nam.

Tiếp tục nghiên cứu cơ chế sinh tổng hợp, thử nghiệm tiền lâm sàng và phát triển sản phẩm thuốc mới từ chủng BPTC-45 nhằm ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đa kháng thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tóm lƣợc lịch sử khám phá kháng sinh. Đặc điểm sinh học của Enterococci và Streptococci. Cơ chế kháng thuốc của các chủng Enterococci và Streptococci.

Cơ chế tác động của kháng sinh đến Enterococci và Streptococci. Ức chế sinh tổng hợp thành tế bào. Ức chế sinh tổng hợp protein. Ức chế sao chép DNA.

Ức chế chuyển hóa axít folic. Kỹ thuật tách dòng phân tử trong nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh và thách thức. Tổng quan tình hình trong nƣớc và trên thế giới. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Các chủng vi khuẩn kiểm định. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp thu thập mẫu đất. Phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn đất. Phƣơng pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh hoạt chất kháng khuẩn.

Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số và nhân trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập. Phƣơng pháp phân loại và xây dựng sơ đồ phả hệ. Phƣơng pháp xác định đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45. Phƣơng pháp tách chiết hoạt chất kháng khuẩn tổng số.

Phƣơng pháp đánh giá hoạt chất kháng khuẩn (MIC90). Nhận diện hoạt chất KKTS bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khối phổ. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn.

Định danh phân tử chủng BPTC-45. Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45. Khả năng sinh trƣởng và mầu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố tan. Môi trƣờng thích hợp cho sinh hoạt chất kháng khuẩn.

Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số của của chủng BPTC-45. Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng hệ thống sắc khí khối phổ (GC-MS). Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng. Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng GCMS.

38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 42 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 54 vi DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT CCARM: Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes CFU: Colony Forming Units ISEM: Intensive soil extract medium ISP: International Streptomyces Project KKTS: Kháng khuẩn tổng số MDR: Multidrug Resistant MIC: Minimum inhibitory concentration MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus TLC: Thin-layer chromatography VRE: Vancomycin-resistant Enterococcus vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm. Kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự gen 16S rRNA của chủng BPTC-45 với các loài đã công bố trên EzTxon. Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 trên các loại môi trƣờng khác nhau ở 21 ngày nuôi cấy ở 28oC. Giá trị MIC90 của hoạt chất kháng khuẩn tổng số tách chiết từ dịch lên men của chủng BPTC-45.

Các hoạt chất có trong dịch chiết KKTS của chủng BPTC-45. 39 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm. Điện di DNA tổng số (a), sản phẩm PCR (b) trên gel agarose 1,3% của chủng BPTC-45.

Sơ đồ phả hệ dựa vào trình tự gen 16S rRNA của chủng BPTC-45 với các loài gần nhất của chi Streptomyces; Kitasatospora setae KM- 6054T (AB022868) là loài ngoài chi Streptomyces. Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 trên các loại môi trƣờng ở 28oC, 21 ngày. Thanh bar: 0,5 cm. Khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng BPTC-45 trong các môi trƣờng.

Dịch lên men (15 µl/khoanh giấy cho mỗi loại môi trƣờng). Hoạt tính kháng khuẩn tổng số của chủng BPTC-45 (a), ức chế vi khuẩn E. Phân tách các phân đoạn có trong hoạt chất KKTS bằng TLC. Nhận diện các hoạt chất tách chiết từ dịch lên men của chủng BPTC- 45 bằng GS-MS.

Lý do chọn đề tài Enterococci và Streptococci thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, có mặt ở trong ruột, da của vật chủ, là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn đƣờng mật, viêm phúc mạc thứ phát, viêm bể thận cấp, ., đặc biệt khả năng lây lan nhanh ở các bệnh viện. Hiện nay, các loài Enterococcus và Streptococci đa kháng thuốc xuất hiện ở hầu hết các quốc gia/vùng lãnh thổ trên toàn thế giới. Hậu quả để lại của tính kháng thuốc thƣờng rất nghiêm trọng và là tác nhân gây ra các bệnh thứ phát. Theo ƣớc tính có khoảng 8,6 triệu ngƣời bị chết bởi các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc hàng năm trên toàn thế giới; và dự đoán đến năm 2050 sẽ khoảng 10 triệu ngƣời chết/năm nguyên nhân đến từ vấn đề vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (de Kraker và cs, 2016).

Nƣớc ta thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thuận lợi các các loài vi sinh vật sinh trƣởng, trong đó có các các loài vi khuẩn gây bệnh. Theo kết quả về tình hình kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện lớn ở nƣớc ta cho thấy các loài của Enterococci có khả năng kháng Ampicilin, Vancomycin, Erythromycin và Ciprofloxacin lần lƣợt là 28,6; 5,3; 70; và 30%; trong khi có tới 71,4% số loài Streptococci kháng penicillin và kháng erythromycin (chiếm 92. Chính vì vậy, nƣớc ta nằm trong các nƣớc có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất thế giới, các “siêu vi khuẩn” Enterococci và Streptococci kháng thuốc xuất hiện ở hầu hết ở các bệnh viện trong cả nƣớc. Hầu hết kháng sinh tự nhiên gốc từ vi khuẩn đất, mở ra thời kỳ “vàng” cho khám phá kháng sinh vào những năm 1950-1960.

Tuy nhiên sau thời nay này số lƣợng các kháng sinh tự nhiên đƣợc phát hiện có xu hƣớng giảm mạnh, trong khi nguồn bệnh đa kháng thuốc lại cho chiều hƣớng ngƣợc lại. Giải pháp tìm kiếm các nguồn gen vi khuẩn đất tiềm năng mới đƣợc gợi ý cho việc thúc đẩy phát hiện các kháng sinh tự nhiên (Pham và Kim, 2012; Hug và công sự, 2016; Ling và cộng sự, 2015; Lewis, 2017). 2 Trong đất chứa đựng khoảng 107~1010 tế bào vi khuẩn/gram. Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 1% cộng đồng vi khuẩn đất đƣợc nuôi cấy thành công, cũng nhƣ xác định đƣợc các đặc tính sinh học trong trong phòng thí nghiệm (Hug và công sự, 2016; Ling và cộng sự, 2015).

Sự thiếu các nhân tố cảm ứng của tự nhiên ở đó các vi khuẩn sinh sống trong môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo là một nguyên nhân chính cần đƣợc khắc phục để thu nhận đƣợc các nguồn gen vi khuẩn sinh kháng mới. Các phƣơng bổ sung các nhân tố tự nhiên trong môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc thiết lập, tuy nhiên ở nhiệt độ khử trùng cao có thể làm biến tính các nhân tố hỗ trợ sinh trƣởng (đặc biệt là các loại vitamin) cho các chủng vi khuẩn trong phòng thí nghiệm. Kết quả là, thu nhận nguồn gen vi khuẩn tiềm năng mới cho nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn tự nhiên còn nhiều hạn chế. Trong nghiên cứu này, nhóm vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm đƣợc phân lập thông qua môi trƣờng dịch chiết đất nhằm thu nhận đƣợc nguồn gen vi khuẩn mới tiềm năng cho phát hiện kháng sinh tự nhiên và từng bƣớc kiểm soát bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Enterococci và Streptococci gây ra.

Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn và xác định đƣợc đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn đất sản sinh hoạt chất kháng Enterococci và Streptococci. Xác định đƣợc các hoạt chất sinh học sản sinh trong dịch lên men của chủng vi khuẩn kháng Enterococci và Streptococci. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn - Định danh phân tử chủng phân lập - Đặc điểm nuôi cấy của chủng phân lập - Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số - Phân tích hoạt tính kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khí khối phổi. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tóm lƣợc lịch sử khám phá kháng sinh Kháng sinh còn đƣợc gọi là trụ sinh là những chất đƣợc chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, đƣợc tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thƣờng là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh đƣợc định nghĩa là những chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi, hiện nay kháng sinh đƣợc định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, đƣợc bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp nhất có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh (Bộ Y tế, 2015) Chất kháng sinh (antibiotic) đƣợc phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin, vào những năm 40 của thế kỷ XX.

Tuy nhiên, thực tế, từ lâu con ngƣời đã biết dùng nấm mốc (mold, milew) trên đậu phụ để đắp chữa các vết thƣơng nhỏ. Nhiều thế kỷ trƣớc tại châu Âu, châu Mỹ, ngƣời ta đã biết cách dùng bánh mỳ, ngô hay giày da cũ đã lên mốc để điều trị các vết lở loét, lên mủ ở da. Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì móc meo trên đậu phụ hay trên bánh mỳ thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều ngƣời xƣa chƣa biết vi khuẩn, chân khuẩn là gì, lại càng không biết chất kháng sinh là gì. Năm 1928, Flemming là nhà vi khuẩn học làm việc tại Bệnh viện Saint Mary ở London.

Trong khi kiểm tra các đĩa nuôi cấy chứa vi khuẩn, ông phát hiện hiện tƣợng khác thƣờng: nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng vi khuẩn đã bị phá hủy. Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi khuẩn. Loại nấm mọc giống nhƣ dạng các bụi cây này sau đƣợc đặt tên khoa học là penicillium 4 notatum, còn chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn đƣợc đặt là pennicillin. Ban đầu, penicillin đƣợc dùng chữa các vết thƣơng bề mặt, nó chỉ mang lại thành công nhất định vì trong penicillin thô có rất ít các hoạt chất.

Flemming đã cố gắng tách penicillin nguyên chất nhƣng không thành công. 10 năm sau, ở Oxford, dƣới sự chỉ đạo của Howara Walter Florey - nhà giải phẫu bệnh học ngƣời Australia và Ernst Boris Chain đã nghiên cứu với mục đích là chế tạo penicillin trên quy mô công nghiệp.