Tổng quan nghiên cứu

Aflatoxin là một nhóm độc tố nấm mốc nguy hiểm, được sản sinh chủ yếu bởi các chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, thường xuất hiện trong nhiều loại nông sản như ngô, lạc, gạo và các loại hạt khác. Theo ước tính của Đại học Georgia, khoảng 25% cây lương thực trên thế giới bị nhiễm độc tố nấm, ảnh hưởng đến hơn 4,5 tỷ người và nhiều động vật. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong các mẫu nông sản dao động từ 60% đến 65%, đặc biệt là ngô. Aflatoxin B1 (AFB1) được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 1 các chất gây ung thư, liên quan mật thiết đến ung thư gan và các bệnh lý nghiêm trọng khác.

Với xu hướng phát triển chăn nuôi công nghiệp, thức ăn chăn nuôi (TĂCN) chiếm tỷ trọng lớn trong giá thành sản xuất, khoảng 65-75%. Sự nhiễm aflatoxin trong TĂCN không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi mà còn gây nguy cơ tích tụ độc tố trong sản phẩm động vật, ảnh hưởng đến người tiêu dùng. Do đó, việc phát triển phương pháp phát hiện nhanh, chính xác aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi là rất cần thiết.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển que thử miễn dịch sắc ký nhanh, đặc hiệu để xác định aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng TĂCN, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc aflatoxin cho người và vật nuôi. Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội trong giai đoạn 2016-2018, với phạm vi tập trung vào các mẫu thức ăn chăn nuôi phổ biến tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết sắc ký miễn dịch cạnh tranh (LFA cạnh tranh): Nguyên lý hoạt động dựa trên sự cạnh tranh giữa aflatoxin tự do trong mẫu và aflatoxin gắn trên màng nitrocellulose để liên kết với kháng thể gắn hạt nano vàng, tạo ra tín hiệu màu đặc trưng.
  • Mô hình tạo kháng thể đa dòng: Sử dụng phức hợp AFB1-KLH để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ, tạo ra kháng thể đặc hiệu với AFB1.
  • Khái niệm hạt nano vàng (GNPs): Là chất đánh dấu màu trong que thử, có khả năng gắn kết bền vững với kháng thể, giúp phát hiện nhanh và rõ ràng.
  • Khái niệm sắc ký ái lực Protein A: Phương pháp tinh sạch kháng thể IgG từ huyết thanh thỏ dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa Protein A và phần Fc của IgG.
  • Khái niệm ELISA gián tiếp và Dot-blot: Phương pháp đánh giá tính đặc hiệu và hoạt tính của kháng thể kháng AFB1.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu tại các địa phương Việt Nam; huyết thanh thỏ được gây miễn dịch để tạo kháng thể; các hóa chất và vật liệu chuyên dụng như hạt nano vàng, màng nitrocellulose, miếng cộng hợp, miếng thấm mẫu.
  • Phương pháp chọn mẫu: Thỏ cái khỏe mạnh được chọn để gây miễn dịch; mẫu thức ăn chăn nuôi được thu thập đại diện cho các loại phổ biến tại Việt Nam.
  • Phương pháp phân tích:
    • Gây miễn dịch thỏ với phức hợp AFB1-KLH, thu huyết thanh và tinh sạch IgG bằng sắc ký ái lực Protein A.
    • Đánh giá hoạt tính và tính đặc hiệu kháng thể bằng ELISA gián tiếp và Dot-blot.
    • Tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng dựa trên hấp phụ vật lý.
    • Chuẩn bị que thử sắc ký miễn dịch cạnh tranh với các thành phần: miếng thấm mẫu, miếng cộng hợp, màng nitrocellulose, miếng thấm hút.
    • Đánh giá độ nhạy, độ lặp lại và ngưỡng phát hiện của que thử trên mẫu thức ăn chăn nuôi.
  • Timeline nghiên cứu: Giai đoạn 2016-2018, gồm các bước: gây miễn dịch và thu kháng thể (6 tháng), tinh sạch và đánh giá kháng thể (3 tháng), phát triển và tối ưu que thử (9 tháng), thử nghiệm mẫu thực tế (6 tháng).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tạo kháng thể kháng AFB1 hiệu quả: Sau 4 lần tiêm phức hợp AFB1-KLH, lượng IgG trong huyết thanh thỏ tăng ổn định, đạt nồng độ 3,29 mg/ml sau tinh sạch. Kháng thể có độ đặc hiệu cao với AFB1, không phản ứng với KLH hay BSA.
  2. Tinh sạch kháng thể thành công: Sắc ký ái lực Protein A thu được IgG tinh sạch với độ tinh khiết cao, được xác nhận qua điện di SDS-PAGE với các băng protein đặc trưng chuỗi nặng (50 kDa) và chuỗi nhẹ (25 kDa).
  3. Phát triển que thử sắc ký miễn dịch cạnh tranh: Que thử sử dụng hạt nano vàng làm chỉ thị màu, với miếng cộng hợp và màng nitrocellulose được tối ưu về vật liệu và điều kiện cố định kháng thể. Que thử cho kết quả rõ ràng trong vòng 10-30 phút.
  4. Độ nhạy và độ lặp lại cao: Que thử có ngưỡng phát hiện aflatoxin khoảng 5 µg/kg, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế. Độ lặp lại trên mẫu âm tính và dương tính đạt trên 95%, đảm bảo tính ổn định và tin cậy.
  5. Thử nghiệm trên mẫu thức ăn chăn nuôi thực tế: Que thử phát hiện aflatoxin trong 7 mẫu dương tính với nồng độ aflatoxin vượt ngưỡng cho phép, chứng minh khả năng ứng dụng thực tiễn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phức hợp AFB1-KLH để gây miễn dịch trên thỏ là phương pháp hiệu quả để tạo kháng thể đa dòng đặc hiệu với AFB1. Việc tinh sạch kháng thể bằng sắc ký ái lực Protein A giúp loại bỏ các tạp chất, nâng cao độ tinh khiết và hoạt tính kháng thể, phù hợp cho ứng dụng trong que thử miễn dịch.

Que thử sắc ký miễn dịch cạnh tranh phát triển dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch cạnh tranh đã được tối ưu hóa các thành phần vật liệu như miếng cộng hợp, màng nitrocellulose và miếng thấm mẫu, giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc sử dụng hạt nano vàng làm chỉ thị màu không chỉ giúp quan sát kết quả nhanh chóng mà còn đảm bảo tính ổn định của que thử.

So sánh với các phương pháp phát hiện aflatoxin truyền thống như HPLC, ELISA, que thử miễn dịch có ưu điểm vượt trội về thời gian phân tích nhanh, thao tác đơn giản, không cần thiết bị phức tạp, phù hợp sử dụng tại hiện trường. Kết quả thử nghiệm trên mẫu thức ăn chăn nuôi thực tế cho thấy que thử có thể phát hiện chính xác aflatoxin ở mức độ nguy hiểm, góp phần kiểm soát chất lượng thức ăn và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ELISA thể hiện sự tăng nồng độ IgG theo tuần gây miễn dịch, sắc ký đồ Protein A minh họa quá trình tinh sạch kháng thể, và bảng kết quả thử nghiệm que thử trên mẫu thực tế với tỷ lệ phát hiện dương tính và ngưỡng phát hiện.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai sản xuất que thử tại các cơ sở kiểm nghiệm thức ăn chăn nuôi: Đẩy mạnh ứng dụng que thử miễn dịch sắc ký cạnh tranh để kiểm tra nhanh aflatoxin, giảm thiểu rủi ro ngộ độc, nâng cao chất lượng sản phẩm. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: các viện nghiên cứu, doanh nghiệp công nghệ sinh học.
  2. Đào tạo kỹ thuật viên và người sử dụng: Tổ chức các khóa đào tạo về sử dụng que thử miễn dịch cho cán bộ kiểm nghiệm, người chăn nuôi và doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi nhằm đảm bảo thao tác chính xác, hiệu quả. Thời gian: 6-12 tháng; chủ thể: trường đại học, trung tâm đào tạo.
  3. Xây dựng quy trình kiểm soát chất lượng thức ăn chăn nuôi: Áp dụng que thử như một bước kiểm tra định kỳ trong quy trình sản xuất và bảo quản thức ăn, giúp phát hiện sớm và xử lý kịp thời các mẫu nhiễm aflatoxin. Thời gian: 1 năm; chủ thể: doanh nghiệp sản xuất TĂCN, cơ quan quản lý.
  4. Nghiên cứu mở rộng phát triển que thử cho các loại độc tố khác: Tiếp tục nghiên cứu phát triển que thử miễn dịch cho các độc tố nấm mốc khác như ochratoxin, fumonisin nhằm đa dạng hóa công cụ kiểm tra an toàn thực phẩm. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: viện nghiên cứu, trường đại học.
  5. Tăng cường giám sát và quản lý aflatoxin trong chuỗi cung ứng: Sử dụng que thử như công cụ hỗ trợ giám sát tại các điểm thu mua, kho bảo quản, giúp giảm thiểu nguy cơ aflatoxin lan rộng trong chuỗi thực phẩm. Thời gian: liên tục; chủ thể: cơ quan quản lý nhà nước, doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, an toàn thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về aflatoxin, kỹ thuật tạo kháng thể và phát triển que thử miễn dịch, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan.
  2. Doanh nghiệp sản xuất và kiểm nghiệm thức ăn chăn nuôi: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm que thử nội địa, nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng, giảm thiểu rủi ro aflatoxin.
  3. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và nông nghiệp: Sử dụng luận văn làm cơ sở khoa học để xây dựng chính sách, quy chuẩn kiểm soát aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi và nông sản.
  4. Người chăn nuôi và các tổ chức hợp tác xã: Nắm bắt kiến thức về nguy cơ aflatoxin và phương pháp phát hiện nhanh, từ đó chủ động kiểm tra và xử lý thức ăn chăn nuôi, bảo vệ sức khỏe vật nuôi và người tiêu dùng.

Câu hỏi thường gặp

  1. Que thử aflatoxin hoạt động dựa trên nguyên lý nào?
    Que thử sử dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch cạnh tranh, trong đó aflatoxin tự do trong mẫu cạnh tranh với aflatoxin gắn trên màng để liên kết với kháng thể gắn hạt nano vàng, tạo ra tín hiệu màu đặc trưng giúp nhận biết sự có mặt của aflatoxin.

  2. Ngưỡng phát hiện của que thử là bao nhiêu?
    Que thử phát hiện aflatoxin với ngưỡng khoảng 5 µg/kg, phù hợp với tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế và quy định của nhiều quốc gia, giúp phát hiện kịp thời các mẫu thức ăn chăn nuôi nhiễm độc.

  3. Kháng thể kháng AFB1 được tạo ra như thế nào?
    Kháng thể được tạo ra bằng cách gây miễn dịch trên thỏ với phức hợp AFB1-KLH, trong đó AFB1 là hapten gắn với protein KLH để kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể đặc hiệu với AFB1.

  4. Que thử có thể sử dụng ngoài hiện trường không?
    Có, que thử được thiết kế đơn giản, thao tác nhanh, không cần thiết bị phức tạp, phù hợp sử dụng tại các trang trại, cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi hoặc điểm thu mua để kiểm tra nhanh aflatoxin.

  5. So với các phương pháp truyền thống, que thử có ưu điểm gì?
    Que thử miễn dịch sắc ký nhanh có ưu điểm về thời gian phân tích ngắn (10-30 phút), dễ sử dụng, chi phí thấp, không cần nhân viên kỹ thuật cao, phù hợp kiểm tra ngoài hiện trường, trong khi các phương pháp như HPLC, ELISA đòi hỏi thiết bị phức tạp và thời gian lâu hơn.

Kết luận

  • Đã thành công trong việc tạo và tinh sạch kháng thể đa dòng đặc hiệu với aflatoxin B1 từ huyết thanh thỏ, với nồng độ IgG đạt 3,29 mg/ml và độ tinh khiết cao.
  • Phát triển que thử sắc ký miễn dịch cạnh tranh sử dụng hạt nano vàng làm chỉ thị màu, có ngưỡng phát hiện khoảng 5 µg/kg, đáp ứng yêu cầu kiểm tra nhanh aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi.
  • Que thử cho kết quả ổn định, độ lặp lại cao trên mẫu âm tính và dương tính, phù hợp ứng dụng thực tế tại Việt Nam.
  • Kết quả thử nghiệm trên mẫu thức ăn chăn nuôi thực tế chứng minh khả năng phát hiện chính xác aflatoxin vượt ngưỡng cho phép.
  • Đề xuất triển khai sản xuất, đào tạo sử dụng và mở rộng nghiên cứu que thử cho các độc tố khác nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm.

Next steps: Triển khai sản xuất quy mô, đào tạo kỹ thuật viên, xây dựng quy trình kiểm soát chất lượng thức ăn chăn nuôi và mở rộng nghiên cứu phát triển que thử cho các độc tố khác.

Call to action: Các cơ quan quản lý, doanh nghiệp và nhà nghiên cứu cần phối hợp để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và phát triển ngành chăn nuôi bền vững.