Luận Văn Thạc Sĩ: Tách Chiết và Tinh Sạch Enzym Nattokinaza Sinh Ra Bởi Bacillus Subtilis

Tài liệu nghiên cứu Táh hiết và tinh sạh enzym nattokinaza sinh ra bởi hủng baillus subtilis, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Nguyễn Thị Hồng Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Lan Hương
• Trường học: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Tách Chiết và Tinh Sạch Enzym Nattokinaza Sinh Ra Bởi Chủng Bacillus Subtilis
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học
• Năm xuất bản: 2009-2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh tim mạch
• 1.2. Hiệu quả dinh dưỡng của Natto-thực phẩm chức năng
• 1.3. Ngăn ngừa chứng tim mạch bằng Natto: an toàn và rẻ nhất
• 1.4. Cấu trúc của Nattokinaza
• 1.5. Cơ chất của enzym nattokinaza
• 1.6. Cơ chế tác dụng của enzym nattokinaza
• 1.7. Quá trình đông máu và hòa tan các cục máu đông
• 1.8. Nguồn vi sinh vật tổng hợp enzym Nattokinaza
• 1.9. Đặc điểm hóa sinh của enzym thủy phân fibrin từ vi sinh vật
• 1.10. Sản xuất các enzym thủy phân fibrin từ nguồn vi sinh vật
• 1.10.1. Các phương pháp lên men thu nhận Nattokinaza
• 1.10.1.1. Phương pháp lên men bề mặt
• 1.10.1.2. Phương pháp lên men lỏng
• 1.10.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym nattokinaza
• 1.10.3. Đặc điểm của chế phẩm natto tạo ra từ các phương pháp lên men
• 1.10.4. Các phương pháp tách chiết và thu nhận enzym
• 1.10.4.1. Phương pháp chiết enzym từ canh trường lên men bề mặt
• 1.10.4.2. Phương pháp ly tâm
• 1.10.4.3. Phương pháp thu nhận enzym
• 1.10.4.3.1. Phương pháp kết tủa
• 1.10.4.3.2. Phương pháp lọc
• 1.10.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu nhận enzym nattokinaza
• 1.11. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nattokinaza trên thế giới và ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
• 2.2. Thiết bị sử dụng
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp vi sinh
• 2.3.2. Phương pháp hóa sinh
• 2.3.2.1. Định tính hoạt tính nattokinaza bằng phương pháp đo vòng thủy phân
• 2.3.2.2. Định lượng nattokinaza bằng phương pháp so màu
• 2.3.2.3. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 2.3.2.4. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinaza cao
• 3.2. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến khả năng sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.2.1. Lựa chọn nguyên liệu đậu thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của đậu tương
• 3.2.3. Ảnh hưởng của vỏ đậu và phương pháp lên men đến khả năng sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinaza của chủng D
• 3.3.1. Ảnh hưởng của lượng dịch và hàm lượng đậu tương
• 3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên khả năng sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.3.4. Ảnh hưởng của các muối khoáng lên khả năng sinh tổng hợp nattokinaza
• 3.3.4.1. Ảnh hưởng của CaCl2 lên khả năng sinh tổng hợp nattokinaza của chủng D
• 3.3.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4
• 3.3.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4
• 3.3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
• 3.3.6. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý nhiệt bột đậu tương
• 3.4. Lên men chìm sinh tổng hợp nattokinaza ở quy mô phòng thí nghiệm
• 3.4.1. Động thái sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp nattokinaza của chủng Bacillus subtilis natto D quy mô bình tam giác
• 3.4.2. Lên men ở quy mô 2 lít
• 3.5. Tách chiết và thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp bởi chủng D theo phương pháp lên men chìm
• 3.5.1. Thu dịch enzym thô
• 3.5.2. Kết tủa enzym
• 3.5.3. Thu nhận chế phẩm kỹ thuật
• 3.6. Tách chiết và thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp bởi chủng M1 theo phương pháp lên men bề mặt
• 3.6.1. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất enzym
• 3.6.2. Tối ưu điều kiện tách chiết
• 3.6.3. Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ phương pháp lên men bề mặt bởi chủng M1
• 3.7. Một số đặc điểm của chế phẩm nattokinaza
• 3.7.1. pH thích hợp cho enzyme hoạt động
• 3.7.2. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động
• 3.7.3. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm thu được bằng SDS-gel
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tách Chiết Nattokinaza Từ Bacillus Subtilis

Nattokinaza, một enzyme fibrinolytic mạnh mẽ, có nguồn gốc từ món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Bacillus subtilis là vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men đậu nành để tạo ra enzym này. Nattokinaza đã được chứng minh có nhiều lợi ích sức khỏe, đặc biệt trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh tim mạch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nattokinaza có khả năng làm tan cục máu đông một cách hiệu quả và an toàn. Sự gia tăng các bệnh về tim mạch đã thúc đẩy các nghiên cứu để tìm ra phương pháp sản xuất nattokinaza hiệu quả hơn. Do đó, việc tách chiết và tinh sạch enzyme nattokinaza từ Bacillus subtilis là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về enzym này.

1.1. Giới thiệu về Nattokinaza và ứng dụng tiềm năng

Nattokinaza là một serine protease, hay enzyme fibrinolytic được sản xuất bởi Bacillus subtilis natto trong quá trình lên men đậu nành. Enzyme này có khả năng phân giải fibrin, một protein chính trong cục máu đông. Vì vậy, nattokinaza được sử dụng rộng rãi trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch như đột quỵ, nhồi máu cơ tim và tăng huyết áp. Bác sỹ Hyroyuki Sumi đã khám phá ra nattokinaza vào năm 1980 khi ông đang giảng dạy tại khoa Hóa Sinh trường Đại học Chicago.

1.2. Vai trò của Bacillus subtilis trong sản xuất Nattokinaza

Bacillus subtilis, đặc biệt là chủng Bacillus subtilis natto, là vi sinh vật chủ chốt trong quá trình lên men đậu nành để sản xuất nattokinaza. Vi khuẩn này tiết ra enzyme vào môi trường xung quanh, nơi nó có thể được tách chiết và tinh sạch. Quá trình lên men tạo ra một môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời tạo điều kiện tối ưu cho sự sản xuất enzyme. Vỏ của hạt đậu tương chứa nhiều chất khoáng mà theo nhiều nghiên cứu thì các chất này đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả tổng hợp nattokinaza.

II. Thách Thức Trong Tách Chiết Enzyme Nattokinaza Hiệu Quả

Việc tách chiết và tinh sạch enzyme nattokinaza từ môi trường lên men Bacillus subtilis gặp phải nhiều thách thức. Enzyme có thể tồn tại với nồng độ thấp trong canh trường lên men, đòi hỏi các phương pháp tách chiết hiệu quả để thu hồi lượng enzyme tối đa. Ngoài ra, enzyme nattokinaza có thể bị lẫn với nhiều tạp chất khác, chẳng hạn như protein và carbohydrate, do đó cần có các quy trình tinh sạch enzyme để loại bỏ các tạp chất này và thu được enzyme có độ tinh khiết enzyme cao. Chi phí sản xuất cũng là một yếu tố quan trọng, cần tối ưu hóa quy trình để giảm chi phí và tăng hiệu suất tách chiết và hiệu suất tinh sạch.

2.1. Các tạp chất ảnh hưởng đến độ tinh khiết Nattokinaza

Canh trường lên men chứa nhiều tạp chất như protein, polysaccharide, lipid và các thành phần tế bào, làm giảm độ tinh khiết enzyme của nattokinaza. Việc loại bỏ các tạp chất này đòi hỏi các bước tinh sạch protein phức tạp và tốn kém. Protein là thành phần tạp chất chính trong canh trường lên men, do đó, các phương pháp tinh sạch enzyme phải tập trung vào việc loại bỏ protein một cách hiệu quả. Theo luận văn, các phương pháp kết tủa protein, lọc và sắc ký được sử dụng để loại bỏ protein và các tạp chất khác.

2.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết để tăng hiệu suất

Để tăng hiệu suất tách chiết và hiệu suất tinh sạch, cần tối ưu hóa quy trình tách chiết và tối ưu hóa quy trình tinh sạch. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết bao gồm dung môi tách chiết protein, thời gian tách chiết protein, nhiệt độ tách chiết protein và tỷ lệ dung môi/canh trường lên men. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tinh sạch bao gồm loại cột sắc ký, pha động, tốc độ dòng và gradient elution.

III. Phương Pháp Tách Chiết Enzyme Nattokinaza từ Bacillus Subtilis

Nhiều phương pháp có thể được sử dụng để tách chiết enzyme nattokinaza từ Bacillus subtilis. Các phương pháp phổ biến bao gồm ly tâm, kết tủa, lọc và chiết xuất bằng dung môi. Ly tâm được sử dụng để loại bỏ tế bào và các mảnh vụn tế bào. Kết tủa có thể được sử dụng để tập trung enzyme từ canh trường lên men. Lọc có thể được sử dụng để loại bỏ các hạt lớn và các tạp chất khác. Chiết xuất bằng dung môi có thể được sử dụng để tách enzyme khỏi các tạp chất khác. Lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm hiệu suất tách chiết, độ tinh khiết enzyme, chi phí và tính khả thi.

3.1. Ly tâm và lọc để loại bỏ tế bào và mảnh vụn

Ly tâm là bước đầu tiên để loại bỏ tế bào Bacillus subtilis và các mảnh vụn tế bào khỏi canh trường lên men. Tốc độ và thời gian ly tâm phải được tối ưu hóa để đảm bảo loại bỏ hiệu quả các tế bào và mảnh vụn mà không làm mất hoạt tính enzyme nattokinaza. Lọc là một phương pháp khác để loại bỏ các hạt lớn và các tạp chất khác. Kích thước lỗ lọc phải được lựa chọn cẩn thận để đảm bảo rằng enzyme không bị mất trong quá trình lọc.

3.2. Kết tủa enzyme bằng muối hoặc dung môi hữu cơ

Kết tủa enzyme là một phương pháp phổ biến để tập trung enzyme từ canh trường lên men. Các tác nhân kết tủa phổ biến bao gồm amoni sulfat, polyetylen glycol (PEG) và ethanol. Nồng độ tác nhân kết tủa, pH và nhiệt độ phải được tối ưu hóa để đảm bảo kết tủa hiệu quả enzyme mà không làm mất hoạt tính enzyme nattokinaza. Theo luận văn, thu hồi enzym nattokinaza thô bằng phương pháp kết tủa bằng muối amon sulfat T 23U .

IV. Quy Trình Tinh Sạch Enzyme Nattokinaza Đạt Độ Tinh Khiết Cao

Sau khi tách chiết protein, cần thực hiện các bước tinh sạch enzyme để loại bỏ các tạp chất còn lại và thu được enzyme có độ tinh khiết enzyme cao. Các phương pháp tinh sạch protein phổ biến bao gồm sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, ultrafiltration và sắc ký gel. Sắc ký ái lực là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch enzyme nattokinaza dựa trên khả năng liên kết đặc hiệu của enzyme với một phối tử. Sắc ký trao đổi ion được sử dụng để tách enzyme dựa trên điện tích của chúng. Ultrafiltration có thể được sử dụng để loại bỏ các phân tử nhỏ và tập trung enzyme. Lựa chọn phương pháp tinh sạch protein phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của enzyme và yêu cầu về độ tinh khiết enzyme.

4.1. Sắc ký ái lực để tách Nattokinaza đặc hiệu

Sắc ký ái lực là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch enzyme nattokinaza vì nó dựa trên khả năng liên kết đặc hiệu của enzyme với một phối tử. Phối tử có thể là một chất ức chế enzyme, một chất nền analog hoặc một kháng thể đặc hiệu cho enzyme. Quá trình tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực có thể đạt được độ tinh khiết enzyme rất cao.

4.2. Sắc ký trao đổi ion và Ultrafiltration để loại bỏ tạp chất

Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để loại bỏ các tạp chất dựa trên điện tích của chúng. Enzyme nattokinaza có thể được tách khỏi các tạp chất khác bằng cách sử dụng cột trao đổi ion tích điện dương hoặc tích điện âm. Ultrafiltration là một phương pháp hữu ích để loại bỏ các phân tử nhỏ và tập trung enzyme. Quá trình này sử dụng màng lọc có kích thước lỗ phù hợp để giữ lại enzyme và loại bỏ các phân tử nhỏ hơn.

V. Ứng Dụng Của Enzyme Nattokinaza Trong Y Học và Thực Phẩm

Enzyme nattokinaza có nhiều ứng dụng nattokinaza quan trọng trong y học và thực phẩm. Trong y học, nattokinaza được sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, chẳng hạn như đột quỵ, nhồi máu cơ tim và tăng huyết áp. Nattokinaza cũng có thể được sử dụng để cải thiện lưu thông máu và giảm nguy cơ hình thành cục máu đông. Trong thực phẩm, nattokinaza có thể được sử dụng để cải thiện tiêu hóa và tăng cường hấp thu dinh dưỡng. Ngoài ra, nattokinaza có thể được sử dụng để sản xuất thực phẩm chức năng và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

5.1. Điều trị bệnh tim mạch và cải thiện lưu thông máu

Enzyme nattokinaza có khả năng phân giải fibrin, một protein chính trong cục máu đông. Điều này làm cho nattokinaza trở thành một phương pháp điều trị tiềm năng cho các bệnh tim mạch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nattokinaza có thể cải thiện lưu thông máu, giảm nguy cơ hình thành cục máu đông và ngăn ngừa đột quỵ và nhồi máu cơ tim. Giá 1 liều Urokinaza, thuốc làm tan vón máu rất đắt tiền, khoảng 1,500 USD/liều và chỉ hữu hiệu trong vòng 30 phút hay sử dụng thuốc t-PA có hiệu quả trong 3-6 giờ và có giá lên đến 2,200 USD/liều.

5.2. Ứng dụng trong thực phẩm chức năng và chăm sóc sức khỏe

Enzyme nattokinaza có thể được sử dụng để sản xuất thực phẩm chức năng và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Nattokinaza có thể được bổ sung vào các loại thực phẩm như sữa chua, nước trái cây và bánh mì để tăng cường lợi ích sức khỏe. Nattokinaza cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe như viên nang, viên nén và bột. Nattokinaza đã được đưa vào sản xuất nattokinaza thương mại và mang lại lợi ích kinh tế rất đáng kể. Vào năm 1998, công ty Japan Bio Science laboratory Co. Ltd là công ty đầu tiên trên thế giới tách chiết và tung ra thị trường sản phẩm Nattokinaza NSK SD

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Nattokinaza

Việc tách chiết và tinh sạch enzyme nattokinaza từ Bacillus subtilis là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng với nhiều ứng dụng tiềm năng. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch protein hiệu quả có thể giúp thu được enzyme có độ tinh khiết enzyme cao và hoạt tính enzyme nattokinaza cao. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tách chiết và tối ưu hóa quy trình tinh sạch, giảm chi phí sản xuất và mở rộng ứng dụng nattokinaza trong y học và thực phẩm. Nghiên cứu enzyme học và tính chất của nattokinaza cũng rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme và phát triển các ứng dụng mới.

6.1. Tối ưu hóa quy trình sản xuất Nattokinaza quy mô công nghiệp

Để sản xuất nattokinaza quy mô công nghiệp, cần tối ưu hóa quy trình tách chiết và tối ưu hóa quy trình tinh sạch để giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu suất tách chiết và hiệu suất tinh sạch. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm điều kiện lên men, phương pháp tách chiết protein, phương pháp tinh sạch protein, và các yếu tố khác. Điều này có thể tạo ra một quy trình sản xuất nattokinaza hiệu quả hơn và kinh tế hơn.

6.2. Nghiên cứu enzyme học và tính chất của Nattokinaza

Nghiên cứu enzyme học và tính chất của nattokinaza là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme và phát triển các ứng dụng mới. Các nghiên cứu nên tập trung vào việc xác định cấu trúc của enzyme, xác định các chất ức chế enzyme và nghiên cứu tác động của enzyme đối với các quá trình sinh học khác nhau. Nghiên cứu về enzyme học và tính chất của nattokinaza sẽ giúp mở ra các ứng dụng mới và thú vị cho enzyme này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, với ước tính khoảng 17,1 triệu người chết do các bệnh này vào năm 2004, chiếm 29% tổng số ca tử vong toàn cầu. Dự báo đến năm 2030, con số này sẽ tăng lên khoảng 23,6 triệu người, trong đó Đông Nam Á là khu vực có tỷ lệ cao nhất. Ở Việt Nam, bệnh tim mạch cũng đứng đầu trong các nguyên nhân gây tử vong, với hơn 100 nghìn ca mắc mới mỗi năm. Nguyên nhân chính của các bệnh này là sự mất cân bằng giữa quá trình đông máu và hòa tan cục máu đông, dẫn đến tắc nghẽn mạch máu và các biến chứng nghiêm trọng.

Trong bối cảnh đó, enzym nattokinaza, được sinh ra bởi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ món ăn truyền thống Nhật Bản là Natto, đã thu hút sự quan tâm lớn nhờ khả năng hoạt huyết mạnh mẽ, an toàn và chi phí thấp. Nattokinaza có tác dụng kép vừa phòng ngừa vừa làm tan các cục máu đông, hiệu quả kéo dài và không gây tác dụng phụ nghiêm trọng. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phát triển quy trình tách chiết và tinh sạch enzym nattokinaza từ chủng Bacillus subtilis nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu và mở rộng ứng dụng trong phòng chống bệnh tim mạch. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2009-2011 tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tập trung vào tối ưu hóa quy trình lên men, chiết xuất và tinh chế enzym với các chỉ số hoạt lực enzym được đo lường cụ thể.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế đông máu và hòa tan cục máu đông: Quá trình đông máu tạo fibrin từ fibrinogen dưới tác dụng của thrombin, hình thành các cục máu đông. Quá trình hòa tan cục máu đông phụ thuộc vào enzym plasmin được hoạt hóa bởi t-PA và urokinaza.
• Cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzym nattokinaza: Nattokinaza là proteaza serine subtilisin, có cấu trúc chuỗi đơn gồm 275 amino acid, có khả năng thủy phân trực tiếp fibrin và kích thích tạo plasmin, urokinaza, t-PA, từ đó làm tan cục máu đông hiệu quả.
• Mô hình lên men sinh tổng hợp enzym: Bao gồm phương pháp lên men bề mặt và lên men lỏng, với các yếu tố ảnh hưởng như nguồn nguyên liệu, pH, nhiệt độ, nguồn nitơ và muối khoáng.
• Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzym: Sử dụng các kỹ thuật ly tâm, kết tủa bằng muối amoni sulfat, lọc màng siêu lọc và điện di SDS-PAGE để xác định độ tinh sạch và hoạt lực enzym.

Các khái niệm chính bao gồm: fibrin, fibrinogen, plasmin, proteaza serine, lên men bề mặt, lên men lỏng, kết tủa enzym, hoạt lực enzym (FU).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Bacillus subtilis phân lập từ các sản phẩm Natto Nhật Bản, Đài Loan và tương Bần Việt Nam. Nguyên liệu chính là đậu tương Hưng Yên.
• Phương pháp phân tích: Định tính hoạt tính enzym bằng phương pháp đo vòng thủy phân fibrin; định lượng enzym bằng phương pháp so màu với Folin; xác định độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE; xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.
• Quy trình nghiên cứu:
  • Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực nattokinaza cao.
  • Tối ưu hóa điều kiện lên men (nguồn nguyên liệu, pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống, muối khoáng).
  • Tách chiết enzym từ canh trường lên men bằng phương pháp khuếch tán, ly tâm.
  • Thu nhận enzym bằng kết tủa muối amoni sulfat và lọc màng siêu lọc.
  • Phân tích hoạt lực và độ tinh sạch enzym.
• Timeline: Nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn 2009-2011, với các bước thí nghiệm và phân tích được tiến hành tuần tự theo kế hoạch.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn: Trong 10 chủng phân lập từ Natto và tương Bần, chủng M1, D, W1, B9, T23 có hoạt lực enzym cao nhất, với hoạt lực enzym đạt khoảng 600-700 FU/g trên môi trường lên men rắn. Chủng T23 từ tương Bần cũng cho kết quả khả quan, mở ra tiềm năng sử dụng nguồn vi sinh vật trong nước.

2. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu: Đậu tương cho hoạt lực enzym cao nhất, gấp khoảng 2 lần so với đậu xanh và đậu đen, trong khi đậu đỏ cho hoạt lực thấp nhất. Điều này khẳng định đậu tương là nguyên liệu tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp nattokinaza.

3. Điều kiện lên men tối ưu: pH ban đầu khoảng 6-7, nhiệt độ 35-37°C, tỷ lệ giống 1-4%, bổ sung muối khoáng CaCl2 (0,02-0,06%) và MgSO4 (0,05-0,07%) giúp tăng hoạt lực enzym lên đến 800-900 FU/g. Lên men bề mặt cho năng suất enzym cao hơn so với lên men lỏng, tuy nhiên lên men lỏng thuận tiện cho sản xuất quy mô lớn.

4. Phương pháp tách chiết và tinh sạch: Kết tủa bằng muối amoni sulfat ở độ bão hòa 40-60% thu được enzym có hoạt lực cao và độ tinh sạch tốt. Lọc màng siêu lọc giúp loại bỏ tạp chất và cô đặc enzym, SDS-PAGE xác nhận enzym có trọng lượng phân tử khoảng 27,7 kDa, phù hợp với đặc điểm của nattokinaza.

Thảo luận kết quả

Kết quả tuyển chọn chủng phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, cho thấy nguồn vi sinh vật trong nước có thể thay thế nhập khẩu. Việc sử dụng đậu tương làm nguyên liệu không chỉ tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có mà còn giảm chi phí sản xuất. Điều kiện lên men và bổ sung muối khoáng phù hợp giúp tăng cường hoạt lực enzym, tương tự các nghiên cứu trước đây cho thấy Ca2+ và Mg2+ là yếu tố kích thích sinh tổng hợp enzym.

Phương pháp kết tủa bằng muối amoni sulfat được đánh giá là hiệu quả và kinh tế, phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp. Kết quả điện di SDS-PAGE và hoạt lực enzym cho thấy quy trình tách chiết và tinh sạch đạt chất lượng cao, có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt lực enzym theo chủng vi khuẩn, bảng so sánh hoạt lực trên các loại đậu, và hình ảnh gel điện di SDS-PAGE minh họa độ tinh sạch enzym.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình lên men bề mặt quy mô công nghiệp: Tăng cường đầu tư thiết bị và công nghệ để mở rộng sản xuất enzym nattokinaza với năng suất cao, giảm chi phí sản xuất, dự kiến hoàn thành trong 2-3 năm tới. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu phối hợp doanh nghiệp.

2. Tối ưu hóa môi trường lên men: Nghiên cứu bổ sung các nguồn dinh dưỡng thay thế đậu tương nhằm giảm giá thành nguyên liệu, đồng thời duy trì hoạt lực enzym, thực hiện trong 1-2 năm. Chủ thể: nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học.

3. Ứng dụng enzym nattokinaza trong sản phẩm thực phẩm chức năng: Phát triển các sản phẩm hỗ trợ phòng ngừa bệnh tim mạch, đảm bảo an toàn và hiệu quả, đưa ra thị trường trong vòng 3 năm. Chủ thể: doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

4. Xây dựng liên kết giữa trường đại học, viện nghiên cứu và doanh nghiệp: Tạo mạng lưới hợp tác để chuyển giao công nghệ, đào tạo nhân lực và phát triển sản phẩm, triển khai ngay từ năm đầu tiên. Chủ thể: các cơ quan quản lý giáo dục và doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Nghiên cứu về enzym, vi sinh vật và ứng dụng trong công nghiệp sinh học, có thể áp dụng quy trình lên men và tách chiết enzym nattokinaza.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm: Tìm hiểu quy trình sản xuất enzym nattokinaza để phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch, giảm chi phí nhập khẩu.

3. Chuyên gia y tế và dinh dưỡng: Nắm bắt thông tin về enzym nattokinaza và tác dụng phòng ngừa bệnh tim mạch để tư vấn và ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích enzym và quy trình sản xuất trong luận văn để phục vụ học tập và nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

1. Nattokinaza là gì và có tác dụng gì?
   Nattokinaza là enzym phân hủy fibrin được sinh ra bởi Bacillus subtilis trong quá trình lên men đậu tương Natto. Nó giúp làm tan các cục máu đông, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch hiệu quả, an toàn và chi phí thấp.

2. Tại sao đậu tương được chọn làm nguyên liệu lên men?
   Đậu tương chứa hàm lượng protein cao (khoảng 36,5 g/100 g), nhiều axit amin thiết yếu và khoáng chất, tạo môi trường dinh dưỡng lý tưởng cho vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng và tổng hợp enzym nattokinaza.

3. Phương pháp lên men nào hiệu quả hơn cho sản xuất nattokinaza?
   Lên men bề mặt cho năng suất enzym cao hơn và dễ kiểm soát mùi vị, nhưng lên men lỏng có ưu điểm cơ giới hóa, tự động hóa và phù hợp quy mô công nghiệp lớn. Cần cân nhắc lựa chọn tùy theo mục tiêu sản xuất.

4. Làm thế nào để tách chiết và tinh sạch enzym nattokinaza?
   Quy trình bao gồm chiết enzym từ canh trường lên men bằng dung môi nước, ly tâm loại bỏ bã, kết tủa enzym bằng muối amoni sulfat ở độ bão hòa thích hợp, sau đó lọc màng siêu lọc để cô đặc và loại bỏ tạp chất, cuối cùng xác định độ tinh sạch bằng SDS-PAGE.

5. Nattokinaza có thể ứng dụng trong sản phẩm nào?
   Nattokinaza được ứng dụng trong thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng ngừa và điều trị bệnh tim mạch, thuốc bổ dưỡng chống lão hóa, và có tiềm năng phát triển trong dược phẩm nhờ tính an toàn và hiệu quả cao.

Kết luận

• Nattokinaza là enzym hoạt huyết mạnh, có khả năng làm tan cục máu đông, phòng ngừa bệnh tim mạch hiệu quả và an toàn.
• Chủng Bacillus subtilis phân lập từ Natto và tương Bần có khả năng sinh tổng hợp enzym với hoạt lực cao, phù hợp sản xuất trong nước.
• Đậu tương là nguyên liệu tối ưu cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzym nattokinaza.
• Quy trình tách chiết và tinh sạch enzym bằng kết tủa muối amoni sulfat và lọc màng siêu lọc đạt hiệu quả cao, đảm bảo chất lượng sản phẩm.
• Đề xuất phát triển quy trình sản xuất quy mô công nghiệp, tối ưu môi trường lên men và ứng dụng enzym trong thực phẩm chức năng, góp phần giảm nhập khẩu và nâng cao giá trị sản phẩm trong nước.

Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai quy trình sản xuất, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzym nattokinaza trong y học và công nghiệp thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh tim mạch Các bệnh tim mạch do sự dối loạn về tim và mạch máu, bao gồm: bệnh tim mạch vành - bệnh của các mạch máu cung cấp cho cơ tim; bệnh mạch máu não - bệnh của các mạch máu cung cấp cho não; bệnh động mạch ngoại biên - bệnh của các mạch máu cung cấp các cánh tay và chân; bệnh tim thấp khớp - thiệt hại cho cơ tim và van tim do sốt thấp khớp, gây ra do vi khuẩn liên cầu khuẩn; bệnh tim bẩm sinh - dị tật tim cấu trúc hiện tại khi sinh; huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc phổi - cục máu đông trong các tĩnh mạch ở chân, có thể đánh bật và di chuyển đến tim và phổi. Theo báo cáo mới đây nhất năm 01/2011 của tổ chức WHO [29], Các bệnh đường tim mạch (Cardiovascular deaseas (CVDs)) là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, ước tính khoảng 17,1 triệu người chết vì bệnh CVDs vào năm 2004, chiếm 29% các ca tử vong trên thế giới.

Trong đó, ước tính khoảng 7,2 triệu người là là do bệnh vành tim và 5,7 triệu do đột quỵ. Trong đó 82% các ca tử vong do bệnh tim mạch diễn ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình và xuất hiện cân bằng ở cả nam giới và nữ giới. Tính đến năm 2030, sẽ có khoảng 23,6 triệu người bị chết vì bệnh tim mạch, chủ yếu do bệnh tim và đột quỵ. Số lượng ca lớn nhất xuất hiện ở vùng Đông Nam Á.

Ở Việt Nam, theo điều tra của Viện tim mạch - bệnh viện Bạch Mai, bệnh tim mạch là bệnh có nguy cơ gây tử vong cao. Năm 1980, bệnh tim mạch là bệnh gây tử vong cao đứng hàng thứ tư, còn từ năm 2000 thì bệnh này gây tử vong hàng đầu.1 Mối nguy hiểm của bệnh tim mạch [13] T 0 T 0T 0 T 0 Theo các năm Hàng đầu Thứ hai Thứ ba Thứ tư 1980 Nhiễm khuẩn Sơ sinh Ung thư Tim mạch 1990 Nhiễm khuẩn Tim mạch Ung thư Sơ sinh 2000 Tim mạch Ung thư Các nguyên nhân khác Nhiễm khuẩn Trong thập kỷ gần đây nhất, các biến chứng của bệnh tăng huyết áp và các bệnh có liên quan đã trở thành nổi bật, thường ở lứa tuổi 50 trở lên, và xu hướng trẻ dưới lứa tuổi đó ngày càng rõ (30-40 tuổi). Nguyễn Thị Hồng Ngân 11 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyên nhân của các bệnh tim mạch phần lớn do sự mất cân bằng giữa hai quá trình: quá trình đông tụ máu và quá trình hòa tan các cục máu đông. Trong đó, tác nhân gây đông tụ máu chính là các khối fibrin hình thành từ fibrinogen dưới tác dụng của thrombin.

Quá trình làm tan các cục máu đông phụ thuộc vào hoạt động của plasmin duy nhất trong cơ thể có tác dụng này và nó được hoạt hóa bởi nhân tố hoạt hóa plasminogen của mô [65]. Trong điều kiện sức khỏe bình thường, lượng enzym plasmin sinh ra có khả năng làm tan hết các cục máu đông trong mạch máu hoặc trong tim. Ngược lại, khi lượng plasin sinh ra không đủ để làm tan hoàn toàn các cục máu đông, các cục máu này sẽ tích tụ dần trong tim và mạch máu, làm cho kích thích lưu thông của máu trong mạch giảm, giảm sự troa đối O2 và CO 2 giữa R R R R máu và các bộ phận khác dẫn tới cao huyết áp và hàng loạt bệnh tim mạch khác [65]. Đứng trước sự nguy hiểm của căn bệnh này, trong suốt các thập niên gần đây, các nhà khoa học đã thực hiện nhiều công trình nghiên cứu để tìm ra giải pháp phòng và chữa các loại bệnh tim mạch.

Một trong những nghiên cứu đó đã chỉ ra rằng các thực phẩm lên men truyền thống ở châu Á như natto, Tofuyo của Nhật và Chungcook-jang của Hàn Quốc… không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh. Đây cũng là một trong những nguyên nhân làm cho tuổi thọ trung bình của người dân ở những nước này khá cao. Đậu tương Trong hạt đậu tương có các thành phần hóa học sau: protein (40%), lipip (12- 25%), glucid (10-15%), các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, D, E, F, các enzym, sáp, nhựa, xellulose [5, 7]. Hàm lượng protein cao trong đậu tương cũng như nhiều hợp chất có giá trị khiến đậu tương trở thành một trong những thực phẩm quan trọng trên thế giới.

Hạt họ đậu nói chung chưa hoàn toàn cân đối về axit amin, trong đó, glutamic, cystein và methionie thường thiều, tuy nhiên trong đậu có đủ các axit amin cơ bản như isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể. Nguyễn Thị Hồng Ngân 12 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng của 100 g đậu tương [Cơ sở dữ liệu USDA] T 0 T 0 Năng lượng 1,866 kJ (446 Protein 36,49 g kcal) Các bon hyđrát 30,16 g Tryptophan 0,591 g Đường 7,33 g Threonine 1,766 g Chất xơ thực phẩm 9,3 g Isoleucine 1,971 g Chất béo 19,94 g Leucine 3,309 g Chất béo no 2,884 g Lysine 2,706 g Chất béo không no 4,404 g Methionine 0,547 g đơn Chất béo không no đa 11,255 g Cystine 0,655 g Vitamin A equiv, 1 μg (0%) Phenylalanine 2,122 g Vitamin B6 0,377 mg (29%) Tyrosine 1,539 g Vitamin B12 0 μg (0%) Valine 2,029 g Vitamin C 6,0 mg (10%) Arginine 3,153 g Vitamin K 47 μg (45%) Histidine 1,097 g Can xi 277 mg (28%) Alanine 1,915 g Sắt 15,70 mg (126%) Axít aspartic 5,112 g Ma giê 280 mg (76%) Axít glutamic 7,874 g Phốt pho 704 mg (101%) Glycine 1,880 g Ka li 1797 mg (38%) Proline 2,379 g Muối ăn 2 mg (0%) Serine 2,357 g Thiếc 4,89 mg (49%) Nước 8,54 g Chính vì thành phần dinh đưỡng dồi dào mà đậu tương được chọn làm môi trường để nuôi cấy vi sinh vật và không cần bổ sung thêm bất kỳ chất nào nữa. Môi trường đậu tương thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzym.

Vỏ của hạt đậu tương là một thành phần đáng quan tâm vì nó chứa nhiều chất khoáng mà theo nhiều nghiên cứu thì các chất này đóng vai trò quan trọng trong Nguyễn Thị Hồng Ngân 13 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học hiệu quả tổng hợp nattokinaza của chủng Bacillus subtilis khi lên men trên môi trường đậu tương [6, 58] Bảng 2.2 Thành phần hóa học của đậu tương (% chất khô) [5] Chất khô Protein Xơ Khoáng Lipit Hạt có vỏ 91.2 11 Hạt không vỏ 95. Natto Natto là chữ ghép của Nat (nộp) và To (đậu) với nghĩa là “đậu nành lên men" đã xuất hiện ở Nhật vào năm 1068. “Natto” là những hạt đậu nành đã luộc chín được ủ với vi khuẩn (Bacillus natto). Là một món ăn dân dã rất phổ biến ở nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương với rong biển phơi khô (Nori) và trứng gà sống.

Natto có mùi, nhớt, ẩm bao phủ bởi các sợi tơ màu trắng. Từ trước đến nay, có nhiều thức ăn từ đậu nành lên men như các loại Tương (miso), Chao. bằng những chủng nấm mốc như Aspergillus, Rhozipus hay Actinomucos nhưng chỉ có Natto là lên men từ vi khuẩn Bacillus subtilis có trong rơm rạ và được gọi phổ biến là Bacillus Natto Hình 1.3 Natto lên men từ đậu tương 1.1 Hiệu quả dinh dưỡng của Natto-thực phẩm chức năng Khuynh hướng ngày càng tiêu thụ sản phẩm Natto vì tin rằng Natto không những là thức ăn rẽ tiền dễ tiêu, nhiều protein và không gây hại như các loại thực phẩm chế biến công nghiệp (ăn liền) mặc dù mùi “hương” của natto vẫn gây khó chịu, cực kỳ khó ngửi. Đây cũng là điểm yếu mà các nhà sản xuất thực phẩm ra sức Nguyễn Thị Hồng Ngân 14 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học khắc phục bằng cách pha trộn với hạt dẻ (1) hun khói, sấy khô với cám lúa mạch (2), thêm calci (3) Natto với loại rong tảo giàu Vitamin B-12 hay (5) Pha trộn Natto và gạo lức.

[27] Đã có những phát biểu đánh giá khá tích cực của giới chuyên môn vào những năm cuối và thập kỷ 1970 như nghiên cứu của GS Kameda - ĐH Y khoa Kanazawa về hiệu quả ngăn ngừa nhiễm độc, tế bào ung thư, kim loại nặng của natto trên cơ thể chuột hay như tổng kết của GS Ohta thuộc viện nghiên cứu Thực phẩm quốc gia (Nhật Bản) rằng” có nhiều chứng cớ qua nghiên cứu cơ bản cho thấy hiệu quả của natto như ngăn ngừa bệnh kiết lỵ, tiêu chảy và nhiễm độc đường ruột hay giảm béo …giữa các nhà chuyên môn mặc dù cho dến nay vẫn còn nhiều tranh cãi” nhưng rõ ràng là người ăn natto không bị đầy hơi, trướng bụng như khi ăn các loại đậu khác, có nghĩa là enzym natto có khả năng là một hoạt chất có ích không thể phủ nhận.2 Ngăn ngừa chứng tim mạch bằng Natto: an toàn và rẻ nhất Giá 1 liều Urokinaza, thuốc làm tan vón máu rất đắt tiền, khoảng 1,500 USD/liều và chỉ hữu hiệu trong vòng 30 phút hay sử dụng thuốc t-PA có hiệu quả trong 3-6 giờ và có giá lên đến 2,200 USD/liều , rẻ nhất cũng là 200USD/liều nếu dùng Streptokinaza hiệu quả trong vòng 12 tiếng trong khi 100 gr Natto chỉ là 1 USD có cùng hiệu quả tương đương kéo dài 8-12 tiếng dồng hồ và an toàn vì Natto ít có phản ứng phụ như Urokinaza [27]. Những thành quả của TS. Sumi Hiroyuki cũng đã được hai vị chuyên gia ở hai khu vực khác nhau phối hợp nghiên cứu, đó là BS. Martin Milner ở Trung tâm Y khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa kỳ) và TS.

Kouhei Makise thuộc bệnh viện Makise ở Kyoto, cùng công bố kết quả qua bài viết trên tạp chí chuyên môn kết luận rằng “là chuyên gia lâu năm về tim mạch và hô hấp chúng tôi nhất trí khẳng định rằng Nattokinaza là một phát hiện đầy phấn chấn trong việc ngăn ngừa và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, và “chúng tôi xác định Nattokinaza là một hoạt chất thiên nhiên có thể làm tan các huyết khối hữu hiệu, không gây dị ứng và có độ an toàn cao” hơn cả Tỏi, Nhân sâm Triều tiên hay Bromelain (từ quả Dứa) thúc đẩy sản sinh ra Plasmin trong quá trình thủy phân sợi Fibrin [27]. Nguyễn Thị Hồng Ngân 15 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 1.1 Cấu trúc của Nattokinaza Nattokinaza (NK) là enzym phân hủy fibrin do Bacillus natto tạo ra.