Luận án tiến sĩ sinh học ứng dụng peptide chứa motif đặc hiệu của helicase rhau làm công cụ nghiên cứu g quadruplex song song ở vi khuẩn

Nghiên cứu ứng dụng peptide chứa motif helicase rhau trong việc khám phá g quadruplex song song ở vi khuẩn, mở ra hướng đi mới trong sinh học.

• Người hướng dẫn: PGS. Phan Thị Phượng Trang
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Peptide Chứa Motif Đặc Hiệu Của Helicase RHAU Trong Nghiên Cứu G-Quadruplex Ở Vi Khuẩn
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm cấu trúc G4
• 1.2. Cấu tạo, điều kiện và các kiểu hình thành cấu trúc G4
• 1.3. Vai trò của G4 trong điều hòa hoạt động tế bào
• 1.4. Protein helicase RHAU
• 1.4.1. Khái niệm protein helicase RHAU
• 1.4.2. Chức năng của helicase RHAU trong tế bào
• 1.4.3. Cơ chế tương tác của protein helicase RHAU với G4 trong tế bào
• 1.4.4. Tình hình nghiên cứu vai trò của tương tác giữa RHAU với G4 trong tế bào
• 1.4.5. Cơ chế tương tác giữa RHAUp chứa RSM với G4 song song
• 1.5. Nghiên cứu và ứng dụng tương tác của peptide chứa motif RHAU với G4
• 1.5.1. Ứng dụng tương tác của peptide chứa motif RHAU với G4
• 1.5.2. Nghiên cứu cải thiện ái lực của RHAUp với G4
• 1.5.3. Sàng lọc peptide bám đặc hiệu với ái lực cao bằng kỹ thuật ribosome display
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2. Kháng sinh và môi trường
• 2.3. Các bộ Kit cho thu nhận và làm sạch DNA hoặc RNA
• 2.4. Vật liệu sinh học
• 2.5. Phương pháp
• 2.5.1. Tạo dòng các vector tái tổ hợp cho phép biểu hiện protein mục tiêu
• 2.5.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp RHAU140-CFP trong E. coli
• 2.5.3. Thu nhận protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc kí ái lực
• 2.5.4. Khảo sát khả năng nhận diện G4 song song của mẫu dò RHAU140-CFP bằng đo cường độ phát huỳnh quang
• 2.5.5. Khảo sát khả năng nhận diện đặc hiệu G4 song song của RHAU140-FokI
• 2.5.6. Kiểm tra sự ức chế biểu hiện CFP bởi tương tác giữa peptide RHAU140 với G4 song song trong E. coli
• 2.5.7. Sàng lọc RHAUp có ái lực cao với G4 song song bằng ribosome display
• 2.5.8. Kiểm tra ái lực của peptide RHAU30 sau sàng lọc với G4 song song
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỂN LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu sử dụng RHAU140-CFP làm mẫu dò phát hiện G4 song song
• 3.1.1. Tạo dòng vector tái tổ hợp cho phép biểu hiện RHAU140-CFP
• 3.1.2. Thu nhận protein RHAU140-CFP bằng phương pháp sắc kí ái lực
• 3.1.3. Khảo sát khả năng nhận diện đặc hiệu G4 song song của RHAU140-CFP bằng cường độ phát huỳnh quang
• 3.2. Khảo sát enzyme cắt giới hạn RHAU140-FokI đặc hiệu cho G4 song song
• 3.2.1. Thu nhận enzyme cắt giới hạn RHAU140-FokI và RHAU124-FokI
• 3.2.2. Kiểm tra khả năng nhận biết đặc hiệu G4 song song của RHAU140-FokI
• 3.2.3. Kiểm tra đặc tính cắt sợi đơn và sợi đôi G4 song song của RHAU140-FokI
• 3.2.4. Khảo sát nồng độ enzyme RHAU140-FokI cho phản ứng cắt
• 3.2.5. Đánh giá khả năng nhận biết và cắt cơ chất G4 song song của RHAU140-FokI theo thời gian
• 3.3. Nghiên cứu sự ức chế biểu hiện CFP bởi tương tác của peptide RHAU140 với G4 song song trong E. coli
• 3.3.1. Tạo dòng vector cho phép biểu hiện RHAU140, RHAU124 và G4-CFP
• 3.3.2. Đánh giá sự ức chế biểu hiện CFP bởi tương tác của RHAU140 với G4 song song
• 3.4. Sử dụng kỹ thuật ribosome display để sàng lọc các RHAUp bám đặc hiệu lên G4 song song với ái lực cao
• 3.4.1. Thiết kế và tạo các thư viện DNA mã hóa cho RHAUp bằng PCR tổ hợp
• 3.4.2. Sử dụng kỹ thuật ribosome display để sàng lọc các RHAUp bám đặc hiệu lên G4 song song
• 3.4.3. Xác định độ hội tụ của thư viện ở vòng sàng lọc thứ 6
• 3.4.4. Kiểm tra ái lực gắn với G4 song song của các peptide RHAU30 sau sàng lọc
• 3.4.5. Đánh giá tương tác của peptide RHAU30 sau sàng lọc với G4 song song
• 3.4.6. So sánh ái lực gắn giữa mẫu dò RHAU30-CFP và RHAU140-CFP với G4 song song
• 3.4.7. Kiểm tra ái lực liên kết giữa peptide RHAU30 với G4 song song bằng FRET
• 3.4.8. Kiểm tra khả năng G4 song song cảm ứng RHAU30-CASP9 dimer bằng hoạt tính cắt cơ chất
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan Nghiên Cứu G Quadruplex G4 ở Vi Khuẩn 55 ký tự

G-Quadruplex (G4) là cấu trúc DNA hoặc RNA bậc hai có bốn sợi được hình thành từ các trình tự nucleotide lặp lại giàu guanine tạo nên các mặt phẳng G-tetrad xếp chồng lên nhau khi có sự hiện diện của ion kim loại hóa trị 1. Mỗi G-tetrad chứa bốn phân tử guanine ở bốn góc của mặt phẳng, giữa hai G-tetrad có ion kim loại hóa trị thường là K+ hoặc Na+ ở trung tâm giúp G4 bền vững. Cấu trúc G4 phổ biến thường có ba mặt phẳng nhưng đôi khi cũng có hai hoặc bốn G-tetrad. G4 được phát hiện đầu tiên ở telomere, sau đó là promoter và một số vị trí khác trong bộ gene có vai trò điều hòa hoạt động tế bào. Vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere đã khiến G4 trở thành đối tượng nghiên cứu tiềm năng cho việc điều hòa hoạt động của tế bào, đặc biệt trong việc phát triển các phân tử thuốc nhắm mục tiêu G4 để điều trị bệnh ung thư. Ngoài ra, G4 còn có giá trị đối với virus như ức chế sự phát triển và là công cụ chẩn đoán để phát hiện hepatitis A virus (HAV), Epstein-Barr Virus (EBV) và cauliflower mosaic virus (CaMV).

1.1. Cấu trúc G Quadruplex G4 Nền tảng sinh học phân tử 45 ký tự

Cấu trúc G4 đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học thiết yếu. Chúng ảnh hưởng đến sự sao chép DNA, phiên mã RNA, dịch mã protein, và duy trì telomere. Theo tài liệu gốc, G4 có tiềm năng lớn trong nghiên cứu và ứng dụng để điều hòa hoạt động của tế bào, định hướng phát triển các phân tử thuốc nhắm mục tiêu G4 để điều trị bệnh cho người đặc biệt là ung thư. G4 cũng có giá trị trong việc ức chế sự phát triển của virus và trong chẩn đoán bệnh do virus gây ra.

1.2. Vai trò của G Quadruplex trong điều hòa hoạt động tế bào 53 ký tự

Cấu trúc G4 được tìm thấy ở những vị trí quan trọng trong bộ gene, bao gồm telomere, promoter, và vùng 5'-UTR. Sự hình thành và ổn định của G4 tại những vị trí này có thể điều chỉnh biểu hiện gene, ảnh hưởng đến quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã. Do đó, G4 có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển, biệt hóa, và chức năng của tế bào. Nghiên cứu ứng dụng peptide hướng tới G4 hứa hẹn mở ra phương pháp điều trị mới.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Helicase RHAU và G Quadruplex 59 ký tự

Mặc dù tiềm năng của G4 là rất lớn, việc nghiên cứu và ứng dụng G4 vẫn còn nhiều thách thức. Các phân tử nhỏ tương tác với G4 thường có độ đặc hiệu không cao và có thể gây ra tác dụng phụ không mong muốn. Việc xác định chính xác vị trí và cấu trúc G4 trong tế bào sống cũng là một vấn đề nan giải. Hơn nữa, việc phát triển các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu G4 đòi hỏi phải có sự hiểu biết sâu sắc về cơ chế hoạt động của G4 và các protein tương tác với G4, trong đó có Helicase RHAU. Các nghiên cứu gần đây cho thấy ngày càng có nhiều cấu trúc G4 trong các gene liên quan đến bệnh và các protein tương tác với G4 có vai trò điều hòa hoạt động của các gene này.

2.1. Hạn chế của các phân tử nhỏ tác động lên G Quadruplex 50 ký tự

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc khai thác tiềm năng của G4 là sự thiếu hụt các phân tử có ái lực cao và độ đặc hiệu cao đối với G4. Các phân tử nhỏ hiện có thường tương tác với G4 một cách không chọn lọc, dẫn đến các tác dụng phụ không mong muốn. Do đó, cần phải phát triển các phân tử nhỏ mới hoặc các phương pháp tiếp cận khác để cải thiện tính đặc hiệu và hiệu quả của việc nhắm mục tiêu G4.

2.2. Khó khăn trong việc xác định cấu trúc G Quadruplex in vivo 52 ký tự

Việc xác định cấu trúc và vị trí chính xác của G4 trong môi trường tế bào sống (in vivo) là một thách thức kỹ thuật lớn. Các phương pháp hiện tại như NMR và tương tác protein-DNA thường đòi hỏi phải có điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt và có thể không phản ánh chính xác tình hình thực tế trong tế bào. Do đó, cần phát triển các phương pháp mới và cải tiến để nghiên cứu G4 trong môi trường sinh lý thực tế.

III. Phương Pháp Ứng Dụng Peptide RHAU Nghiên Cứu G Quadruplex 60 ký tự

RHAU (RNA Helicase associated with AU-rich element) là một trong số các protein liên kết với G4 có ái lực cao và đặc hiệu do chứa Motif đặc hiệu RHAU (RSM) dài 13 amino acid từ vị trí 54-66. Tương tác giữa RHAU với G4 có vai trò trong sự phát triển phôi và tim, tạo máu,... Tuy nhiên, protein RHAU có kích thước to, khó kiểm soát cấu trúc và dung hợp với các protein chức năng. Do đó, các Peptide RHAU (RHAUp) mang các trình tự đặc hiệu liên kết với G4 là các ligand tiềm năng cho nghiên cứu liệu pháp điều trị bệnh dựa trên kiểm soát G4. RHAUp có cơ chế gắn lên G4 đã được hiểu rõ và peptide nhỏ nhất liên kết với G4 là RHAU16 nhưng có ái lực yếu do đoạn peptide này ngắn.

3.1. Ưu điểm của Peptide RHAU so với protein RHAU nguyên bản 59 ký tự

So với protein RHAU nguyên bản, Peptide RHAU (RHAUp) có nhiều ưu điểm vượt trội. RHAUp có kích thước nhỏ, dễ tổng hợp và biến đổi, và có thể được thiết kế để nhắm mục tiêu G4 một cách chọn lọc. RHAUp cũng ít có khả năng gây ra các tác dụng phụ không mong muốn so với protein RHAU nguyên bản. Vì vậy, RHAUp là một công cụ đầy hứa hẹn cho việc nghiên cứu và ứng dụng G4 trong y sinh học và dược phẩm.

3.2. Tối ưu hóa ái lực của Peptide RHAU với G Quadruplex 51 ký tự

Một trong những thách thức chính trong việc sử dụng Peptide RHAU (RHAUp) là cải thiện ái lực của chúng đối với G4. Peptide ngắn như RHAU16 có ái lực yếu, trong khi peptide dài hơn có thể có ái lực cao hơn nhưng lại khó tổng hợp và biến đổi. Do đó, cần phải phát triển các phương pháp để tối ưu hóa ái lực của RHAUp đối với G4 mà không làm ảnh hưởng đến các đặc tính khác của chúng.

3.3. Kỹ thuật Ribosome Display để sàng lọc Peptide RHAU 57 ký tự

Kỹ thuật ribosome display là một phương pháp mạnh mẽ để sàng lọc các peptide có ái lực cao đối với một mục tiêu cụ thể. Kỹ thuật này cho phép sàng lọc hàng tỷ peptide khác nhau trong một thí nghiệm duy nhất. Luận án sử dụng kỹ thuật ribosome display để sàng lọc các RHAUp có ái lực cao và đặc hiệu cho G4 song song. Kết quả sàng lọc sẽ cung cấp các peptide mới có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu G-Quadruplex.

IV. Ứng Dụng Peptide RHAU140 Công Cụ Nghiên Cứu G Quadruplex 60 ký tự

Để tăng ái lực liên kết giữa RHAUp với G4, luận án sử dụng RHAU140 chứa RSM để tạo ra các công cụ mới cho nghiên cứu và ứng dụng trên đối tượng G4 bằng cách dung hợp với các protein chỉ thị hoặc protein chức năng hướng đến mục tiêu ứng dụng trong nghiên cứu như chỉnh sửa gene, kiểm soát hoạt động tế bào. Luận án tạo ra các protein RHAU140 tái tổ hợp chứa RSM dung hợp với các protein chức năng khác để làm enzyme cắt, mẫu dò phát hiện G4 song song, hoạt hóa enzyme và kiểm soát biểu hiện protein trong tế bào.

4.1. RHAU140 CFP Mẫu dò huỳnh quang phát hiện G Quadruplex 58 ký tự

RHAU140 được dung hợp với protein huỳnh quang CFP để tạo ra mẫu dò RHAU140-CFP. Mẫu dò này có khả năng nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song thông qua đo cường độ phát huỳnh quang CFP. Điều này cho phép theo dõi sự hình thành và vị trí của G4 trong tế bào sống. Các kết quả nghiên cứu chứng minh rằng mẫu dò RHAU140-CFP là một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu G4.

4.2. RHAU140 FokI Enzyme cắt giới hạn đặc hiệu G Quadruplex 59 ký tự

RHAU140 được dung hợp với enzyme cắt giới hạn FokI để tạo ra enzyme RHAU140-FokI. Enzyme này có khả năng cắt DNA tại vị trí G4 song song. Nghiên cứu khảo sát các đặc tính cắt DNA của enzyme này như nồng độ và thời gian. Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme RHAU140-FokI có tính đặc hiệu cao và có thể được sử dụng để chỉnh sửa gene nhắm mục tiêu G4. Đây là một công cụ đầy hứa hẹn cho việc phát triển các liệu pháp điều trị gene dựa trên G-Quadruplex.

V. Kết Quả Sàng Lọc Ribosome Display Peptide RHAU30 56 ký tự

Để cải thiện ái lực của RHAU23 với G4 song song, luận án tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật ribosome display để thu được các peptide có kích thước nhỏ nhưng ái lực cao và đặc hiệu từ trình tự gốc RHAU23. Sau khi sàng lọc, thu được các RHAUp có ái lực cao và đặc hiệu với G4 song song T95-27. Kết quả cho thấy RHAU30 có ái lực gắn G4 song song cao nhất và tương đương với RHAU140.

5.1. Đánh giá ái lực tương tác của Peptide RHAU30 với G4 56 ký tự

Ái lực tương tác của Peptide RHAU30 sau sàng lọc bằng ribosome display với G4 song song được đánh giá thông qua FRET và hoạt hóa enzyme. RHAU30 có khả năng cảm ứng sự dimer hóa và hoạt hóa RHAU30-CASP9 thông qua tương tác đặc hiệu giữa G4 và hai phân tử RHAU30. Đây là một cơ chế mới có thể được khai thác để phát triển các liệu pháp điều trị nhắm mục tiêu G4.

5.2. RHAU30 CASP9 Hoạt hóa enzyme thông qua tương tác G Quadruplex 59 ký tự

RHAU30 được dung hợp với enzyme CASP9 để tạo ra RHAU30-CASP9. Sự tương tác giữa RHAU30 và G4 làm hoạt hóa enzyme CASP9. Điều này cho phép kiểm soát hoạt động của enzyme CASP9 một cách chính xác và có thể được sử dụng trong các ứng dụng y học như điều trị ung thư.

VI. Kết luận và Hướng Nghiên Cứu Peptide RHAU 53 ký tự

Luận án đã tạo ra các protein tái tổ hợp mới bằng phương pháp dung hợp giữa RHAUp với các protein chức năng có khả năng nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song và thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng như phân tử dò huỳnh quang, enzyme cắt giới hạn, hoạt hóa enzyme. Do đó, luận án đã tạo ra các công cụ mới và hiệu quả cho việc nghiên cứu và ứng dụng G4 trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Nghiên cứu này là một cách tiếp cận có tính khoa học và tiềm năng ứng dụng cao.

6.1. Đóng góp mới của luận án về nghiên cứu Peptide và G4 55 ký tự

Luận án đóng góp vào sự hiểu biết về tương tác giữa Peptide RHAU và G4, đồng thời cung cấp các công cụ mới cho việc nghiên cứu G4. Các kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị bệnh dựa trên G4. Trong đó có (i) tạo ra đầu dò RHAU140-CFP nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song; (ii) tạo enzyme cat giới hạn RHAU140-FokI; (iii) sàng lọc thành công 4 RHAUp có ái lực cao.

6.2. Hướng phát triển tiềm năng của nghiên cứu Peptide RHAU 53 ký tự

Nghiên cứu này mở ra nhiều hướng phát triển tiềm năng trong tương lai. Các Peptide RHAU có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị bệnh dựa trên G4. Chúng cũng có thể được sử dụng để phát triển các công cụ chẩn đoán bệnh và các công cụ nghiên cứu sinh học phân tử. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của RHAU30-CASP9 có thể dẫn đến các phương pháp điều trị ung thư mới.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Cấu trúc bậc hai nucleic acid không chuẩn (non-canonical secondary structures), đặc biệt là G-quadruplex (G4) hình thành từ các trình tự giàu guanine thông qua liên kết hydrogen Hoogsteen và được ổn định bởi các cation hóa trị 1 như $\text{K}^+$ ($140\text{ mM}$ nội bào) hoặc $\text{Na}^+$ ($5-15\text{ mM}$), đóng vai trò then chốt trong kiểm soát biểu hiện gen, nhân đôi DNA, phiên mã, dịch mã và duy trì đầu mút telomere. Các phân tích điện toán dự đoán có khoảng 716.310 cấu trúc G4 hình thành trong hệ gen người, trong đó hơn $40%$ promoter chứa ít nhất một motif G4 có liên hệ mật thiết với các gen sinh ung như MYC, KRAS, KIT, BCL2 và VEGF. Tuy nhiên, việc khai thác cấu trúc G4 trong chẩn đoán và điều trị sinh học phân tử gặp phải rào cản kỹ thuật lớn do sự thiếu hụt các công cụ phân tử có kích thước nhỏ gọn nhưng đạt ái lực cao và nhận diện chuyên biệt dạng hình học không gian (topology) song song (parallel G4).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở sự mất cân bằng giữa kích thước phân tử và ái lực liên kết: protein helicase tự nhiên RHAU (DHX36/G4R1) có khả năng tháo xoắn G4 với ái lực picomolar ($\text{K}_d = 39-77\text{ pM}$) nhờ motif đặc hiệu RSM (RHAU-specific motif, 13 amino acid từ vị trí 54–66), nhưng kích thước lớn (1008 amino acid, $\sim 115\text{ kDa}$) khiến nó rất khó dung hợp chức năng hoặc biểu hiện tái tổ hợp; ngược lại, các peptide cắt ngắn như RHAU16 hay RHAU18 ($2.4\text{ kDa}$) lại có ái lực liên kết yếu, trong khi các mẫu dò huỳnh quang thế hệ trước như RHAU53-CFP chỉ đạt $\text{K}_d = 124 \pm 10\text{ nM}$ (Dang & Phan, 2016). Luận án của Nghiên cứu sinh Trương Thị Tình Tươm (2024) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM giải quyết trực diện bài toán này bằng cách dung hợp peptide RHAU140 chứa RSM với các protein chức năng (CFP, endonuclease FokI, CASP9) và áp dụng kỹ thuật tiến hóa phân tử in vitro ribosome display để sàng lọc biến thể peptide RHAU30 thế hệ mới.

Câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học:

1. RQ1: Liệu peptide RHAU140 (140 aa, mang trình tự từ amino acid 53–192 của DHX36) khi dung hợp với protein huỳnh quang CFP và enzyme cắt giới hạn FokI có duy trì khả năng nhận diện và phân cắt đặc hiệu trên cơ chất DNA G4 song song (T95-2T) hay không?
   • H1: Phức hợp RHAU140-CFP phát huỳnh quang chọn lọc với G4 song song, và RHAU140-FokI tạo enzyme giới hạn nhân tạo phân cắt đặc hiệu sợi đôi/sợi đơn chứa motif G4.
2. RQ2: Sự tương tác giữa RHAU140 và G4 song song nội bào có thể ức chế sự dịch mã/phiên mã của gen chỉ thị trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli hay không?
   • H2: Cấu trúc G4 chèn trước gen chỉ thị kết hợp với sự biểu hiện của RHAU140 tạo phức hợp cản trở không gian, gây suy giảm định lượng tín hiệu CFP.
3. RQ3: Kỹ thuật tiến hóa vô bào ribosome display từ thư viện đột biến ngẫu nhiên NNK có thể tạo ra peptide thu nhỏ RHAU30 mang ái lực cao ngang ngửa RHAU140 và kích hoạt thành công quá trình dimer hóa enzyme caspase-9 hay không?
   • H3: Biến thể peptide RHAU30 thu nhận qua 6 vòng sàng lọc (biopanning) đạt ái lực nanomolar mạnh và cảm ứng dimer hóa RHAU30-CASP9 để phân cắt cơ chất tự nhiên CASP3.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp cấu trúc sinh học phân tử (structural biophysics), sinh học tổng hợp (synthetic biology) và tiến hóa protein in vitro. Phạm vi nghiên cứu bao gồm thiết kế 4 thư viện DNA tổ hợp, sàng lọc qua 6 chu kỳ ribosome display, khảo sát in vitro trên các oligomer G4 (T95-2T, Htelo, TERRA) và thử nghiệm in vivo trên chủng vi khuẩn E. coli XL10-Gold và BL21(DE3). Kết quả mang lại đóng góp đột phá khi tạo ra hệ công cụ nhận diện topology G4 có độ nhạy cao và mô hình dimer hóa enzyme định hướng mục tiêu sinh học.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu cấu trúc G4 bắt đầu từ những năm 1960 và bùng nổ khi mối liên hệ giữa G4 telomere và cơ chế ức chế enzyme telomerase được làm sáng tỏ (Zahler et al., 1991; Phan et al., 2004). Khi nồng độ cation $\text{K}^+$ đạt ngưỡng sinh lý ($140\text{ mM}$), trình tự lặp telomere người $\text{d}[(\text{GGGTTA})_3\text{GGGT}]$ hình thành cấu trúc lai (hybrid G4) hoặc đối song song (anti-parallel G4) khi có $\text{Na}^+$ ($10\text{ mM}$), trong khi các trình tự RNA G4 (như TERRA) và một số vùng promoter gen ung thư (c-MYC) ưu tiên gấp cuộn thành dạng song song hoàn toàn ($4\uparrow$) với tất cả các glycosidic bond conformation ở dạng anti (Burge et al., 2006).

Các trường phái nghiên cứu đối kháng tồn tại xoay quanh cơ chế nhận diện G4: một trường phái tập trung vào các phối tử hóa học tổng hợp nhỏ (small molecules) như telomestatin, RHPS4, dẫn xuất triaryl-substituted imidazole IZNP-1 hay pyridostatin (PDS) (Rodriguez et al., 2012; Tan et al., 2014). Mặc dù các phân tử này làm bền G4 và ức chế tế bào khối u hiệu quả, chúng thiếu tính phân biệt tuyệt đối giữa các topology G4 khác nhau (song song vs đối song song vs lai) và thường gây độc tế bào không đặc hiệu. Trường phái thứ hai khai thác các domain nhận diện sinh học tự nhiên như kháng thể chuỗi đơn scFv (như BG4 của Biffi et al., 2013) hoặc kháng thể đơn dòng (1H6). Tuy nhiên, BG4 có kích thước lớn ($\sim 30\text{ kDa}$), phức tạp trong biểu hiện và khó tái cấu trúc thành các công cụ điều hòa nội bào dạng enzyme dung hợp.

Trong dòng nghiên cứu về helicase RHAU, Heddi et al. (2015) đã xác định bằng NMR cấu trúc phức hợp giữa peptide RHAU18 (SMHPGHLKGREIGMWYAKKQ) và DNA G4 song song T95-2T ($\text{tt}(\text{gggt})_4$), chứng minh rằng motif RSM tạo ra một đoạn $\alpha$-helix liên kết trên mặt phẳng G-tetrad đầu 5' qua tương tác kỵ nước giữa Gly9, Ile12, Gly13, Ala17 với guanine G3, G7, G11, G15, kết hợp tương tác tĩnh điện của Lys8, Arg10, Lys19 với khung phosphate. Tuy nhiên, RHAU18 có ái lực gắn kết thấp. Nhóm nghiên cứu Dang & Phan (2016) mở rộng chuỗi lên RHAU53 dung hợp CFP, nhưng độ nhạy chỉ đạt $\text{K}_d = 124\text{ nM}$. Zheng et al. (2020) thiết kế protein nhân tạo G4P (64 amino acid, gồm hai đơn vị RHAU23 nối bằng linker, $6.7\text{ kDa}$) để bắt giữ G4 trong tế bào sống phục vụ ChIP-seq. Gần đây nhất, Chen et al. (2020) tạo RHAU23 dạng vòng (cyclic RHAU23 qua enzyme OaAEP1) nâng ái lực lên $\text{K}_d = 129\text{ nM}$ so với mạch thẳng ($678\text{ nM}$), và Mou et al. (2023) dùng mRNA display sàng lọc peptide pep11 (12 aa) liên kết RNA G4 hTERC với $\text{K}_d = 1.37 \pm 0.22\text{ }\mu\text{M}$.

Luận án này định vị chính xác vào khoảng trống khoa học nêu trên: nâng cấp độ dài phân tử lên RHAU140 để khai thác tối đa các liên kết kẹp hỗ trợ từ domain N-terminal của DHX36, tạo enzyme cắt nhân tạo RHAU140-FokI đầu tiên nhận diện G4, đồng thời tiên phong ứng dụng ribosome display để tiến hóa peptide RHAU30 đạt ái lực cực cao mà không cần cấu trúc dimer hóa hay dạng vòng hóa nhân tạo.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm mô hình tương tác phân tử giữa DEAH-box helicase và nucleic acid quadruplex. Lý thuyết cấu trúc cổ điển cho rằng motif 13 amino acid RSM là đơn vị chức năng tối thiểu để nhận diện G4. Tuy nhiên, luận án chứng minh rằng chỉ riêng RSM 13 aa không đủ để tạo ái lực sinh học bền vững in vitro; cấu trúc kẹp không gian của 140 amino acid đầu N (RHAU140) đóng vai trò nâng đỡ bề mặt, gia tăng ái lực liên kết thông qua cấu trúc bậc ba mở rộng.

               Mô hình tương tác phân tử RHAU18/RSM với G4 song song
               
                     [  RHAU18 / RSM  α-helix  ]
                     (Gly9, Ile12, Gly13, Ala17)

Mô hình lý thuyết tương tác được xác lập qua các định đề:

• Định đề 1 (Topology Selection): Peptide chứa RSM chọn lọc tuyệt đối cấu trúc G4 song song có hai mặt phẳng phẳng G-tetrad đầu 5' và 3' mở tự do, không bị cản trở bởi các vòng bên (lateral loops) hay vòng chéo (diagonal loops) như ở dạng đối song song Htelo.
• Định đề 2 (Dual Binding Stoichiometry): Một phân tử G4 song song monomeric (như T95-2T) có khả năng liên kết đồng thời với hai phân tử peptide RHAU (tỷ lệ $1:2$) trên cả hai mặt G-tetrad đầu 5' và 3'.
• Định đề 3 (Dimer-Induced Activation): Sự liên kết của hai phân tử peptide RHAU trên cùng một cơ chất G4 đóng vai trò như một giàn giáo phân tử (molecular scaffold), định hướng hai domain chức năng (như thụ thể xúc tác caspase-9) lại gần nhau, tạo hiệu ứng khoảng cách để hoạt hóa enzyme mà không cần phức hợp Apaf-1/apoptosome tự nhiên.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết:

1. Lý thuyết tương tác lập thể sinh học (Stereochemical Recognition Theory): Giải thích sự khớp nối phân tử giữa mặt phẳng kỵ nước của $\alpha$-helix peptide RHAU và mặt phẳng G-tetrad của G4.
2. Lý thuyết tiến hóa phân tử định hướng vô bào (Cell-Free Directed Evolution Framework): Dựa trên nguyên lý kết cặp kiểu gen - kiểu hình (phenotype-genotype linkage) của hệ thống ribosome display để vượt qua giới hạn dung lượng biến nạp của tế bào sống, đạt kích thước thư viện $10^{12}-10^{14}$ biến thể.
3. Lý thuyết kích hoạt enzym theo cơ chế cảm ứng không gian (Proximity-Induced Enzyme Activation): Vận dụng sự dimer hóa phụ thuộc khuôn G4 để biến đổi các phân tử dò quang học thành hệ thống enzyme xúc tác động lực học.

Điều kiện biên (boundary conditions): Các tương tác đặc hiệu chỉ duy trì ổn định trong môi trường đệm có cation $\text{K}^+$ nồng độ tối thiểu $20-100\text{ mM}$, pH $7.0-7.4$, và cấu trúc G4 mục tiêu phải duy trì hình thái song song hoàn toàn.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng triết lý thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm nghiêm ngặt đa tầng (multi-level experimental design), kết hợp hóa sinh vô bào, lý sinh phân tử và di truyền vi khuẩn. Quy mô nghiên cứu bao gồm việc thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá 6 cấu trúc protein tái tổ hợp chính (RHAU140-CFP, RHAU140-FokI, RHAU124-FokI, RHAU30-CFP, RHAU30-YFP, RHAU30-CASP9) cùng 4 thư viện DNA đột biến ngẫu nhiên cho ribosome display.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Hệ thống tạo dòng và biểu hiện protein:

   • Vector khung sườn: pETDuet-1 (Novagen) mang 2 promoter T7, plasmid pHT590 mang spacer Intein-CBD, plasmid pHT2503 mang promoter T7 và gen kháng Kanamycin.
   • Chủng vi khuẩn: E. coli XL10-Gold dùng cho nhân dòng; E. coli BL21(DE3) dùng cho biểu hiện protein dưới sự cảm ứng của IPTG ($0.5-1.0\text{ mM}$) ở điều kiện nhiệt độ hạ thấp ($16-25^\circ\text{C}$, lắc $180-200\text{ rpm}$).
   • Tinh sạch protein: Sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) qua cột HisTrap HP 1 ml (GE Healthcare Life Sciences) trên hệ thống FPLC/áp suất thấp, giải hấp bằng imidazole gradient từ $20\text{ mM}$ đến $500\text{ mM}$.

2. Kỹ thuật Ribosome Display vô bào:

   • Sử dụng bộ kit tổng hợp protein tái tổ hợp hoàn chỉnh PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (New England Biolabs - NEB) nhằm loại bỏ hoàn toàn hoạt tính nuclease và protease tạp nhiễm.
   • Bổ sung chất ức chế RNase (RiboLock, Thermo Fisher Scientific), thực hiện phản ứng trong nước xử lý UltraPure DEPC.
   • Thiết kế thư viện DNA sơ cấp: Bổ sung cấu trúc stem-loop ở đầu 5' và 3' để bảo vệ mRNA, đoạn đệm spacer dài $\ge 23-30$ amino acid (từ Intein-CBD) không có stop codon để peptide tự do gấp cuộn ngoài kênh thoát ribosome.
   • Phân đoạn đột biến: Sử dụng mồi thoái hóa mang bộ ba ngẫu nhiên NNK ($N = A/T/G/C$, $K = G/T$) nhằm mã hóa đầy đủ 20 amino acid nhưng giảm thiểu xuất hiện codon dừng (chỉ có 1 codon stop TAG thay vì 3).
   • Chọn lọc ái lực (Biopanning): DNA G4 mục tiêu T95-2T ($\text{tt}(\text{gggt})_4$) được gắn Biotin ở đầu 3', cố định trên bề mặt hạt từ NeutrAvidin (Thermo Fisher Scientific). Rửa nghiêm ngặt bằng đệm WBT 1X ($\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{KCl } 100\text{ mM}$, Tween-20 $0.05%$, Magnesium acetate $50\text{ mM}$).
   • Tách chiết mRNA bằng đệm giải hấp EB chứa EDTA ($50\text{ mM}$) để tạo phức chelat với ion $\text{Mg}^{2+}$, phá vỡ cấu trúc ribosome và thu hồi mRNA mục tiêu. Tiến hành RT-PCR bằng enzyme phiên mã ngược và mồi đặc hiệu ON1480B/ON1491, lặp lại liên tục qua 6 chu kỳ sàng lọc.

3. Kỹ thuật phân tích cấu trúc và quang phổ:

   • Điện di Native-PAGE $18%$ trong đệm Kpi $20\text{ mM}$ pH 7.2 chứa $\text{KCl } 100\text{ mM}$ để kiểm tra sự dịch chuyển băng cộng hóa trị giữa G4 và peptide.
   • Điện di biến tính SDS-PAGE $12%$ nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250.
   • Phân tích FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): Đo chuyển dịch năng lượng huỳnh quang cộng hưởng giữa cặp phân tử RHAU30-CFP (donor, kích thích ở bước sóng $\lambda_{ex} = 430\text{ nm}$, phát xạ $\lambda_{em} = 475\text{ nm}$) và RHAU30-YFP (acceptor, phát xạ $\lambda_{em} = 530\text{ nm}$) trên máy đọc đĩa vi thể đa năng BMG Labtech.
   • Đo hoạt tính phân cắt enzyme FokI và phân giải CASP3 trên bản gel polyacrylamide biến tính $12%$, định lượng mật độ quang bằng phần mềm ImageJ và phân tích mức độ hội tụ trình tự qua Sequence Logo.

Data và phân tích

Nhóm thông số thực nghiệm	Chi tiết kỹ thuật và thiết bị	Giá trị định lượng / Tiêu chuẩn kiểm soát
Dung lượng thư viện sơ cấp	PCR tổ hợp với mồi NNK	$\sim 10^{12}$ phân tử DNA tái tổ hợp
Nồng độ muối đẳng trương	Đệm Kpi + KCl	$\text{KCl } 100\text{ mM}$, $\text{pH } 7.2 \pm 0.1$
Mẫu dò huỳnh quang	RHAU140-CFP vs RHAU124-CFP	Đo quang phổ huỳnh quang tại $\lambda = 475\text{ nm}$
Độ tinh sạch protein	Cột HisTrap HP 1 ml	Độ tinh sạch $> 90%$ trên gel SDS-PAGE
Phân cắt giới hạn FokI	RHAU140-FokI trên G4-dx1/cs1	Phân cắt đặc hiệu sợi đơn mang G4 và sợi đôi
Số vòng sàng lọc Ribosome	6 vòng liên tiếp (biopanning)	Phân tích hội tụ Sequence Logo ở vòng 6
Hằng số phân ly ($\text{K}_d$)	FRET và huỳnh quang định lượng	RHAU30 đạt mức nanomolar, tương đương RHAU140

Các phép thử nghiệm đều thiết lập mẫu đối chứng âm chuẩn mực: sử dụng peptide đối chứng RHAU124 (bị cắt mất đoạn amino acid 53–68 chứa motif RSM), đối chứng cơ chất sợi đơn dx1 không chứa G4, và cấu trúc G4 đối song song Htelo để chứng minh tính chuyên biệt cấu trúc hình học.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án đã đạt được 5 phát hiện cốt lõi mang tính bước ngoặt sinh học phân tử:

1. Xác lập thành công mẫu dò huỳnh quang RHAU140-CFP đặc hiệu tuyệt đối cho G4 song song: Protein tái tổ hợp RHAU140-CFP biểu hiện mạnh trong E. coli, tinh sạch qua sắc ký ái lực cho thấy khả năng tăng cường phát huỳnh quang chọn lọc khi tương tác với G4 song song T95-2T, trong khi hoàn toàn không có tín hiệu phản ứng chéo với cấu trúc G4 đối song song Htelo hay DNA sợi đơn/sợi đôi thông thường. Đoạn N-terminal 140 aa cung cấp khung liên kết bền vững hơn đáng kể so với RHAU53.

                    Hiệu quả phân cắt đặc hiệu của RHAU140-FokI
                    
     [Cơ chất G4-dx1 / cs1]
     [ Sản phẩm phân cắt chính xác tại vị trí cách G4 9-13 bp ]

2. Chế tạo thành công enzyme cắt giới hạn nhân tạo nhắm mục tiêu G4 (RHAU140-FokI): Bằng cách dung hợp domain xúc tác cắt không đặc hiệu của enzyme endonuclease FokI với đầu C của RHAU140, nghiên cứu đã tạo ra một enzyme cắt giới hạn nhân tạo mới. Thử nghiệm trên cơ chất sợi đôi G4-dx1/cs1 chứng minh RHAU140-FokI nhận biết cấu trúc G4 song song và thực hiện phản ứng cắt chính xác phụ thuộc nồng độ và thời gian; trong khi cấu trúc đột biến thiếu RSM (RHAU124-FokI) mất hoàn toàn hoạt tính phân cắt cơ chất.

3. Chứng minh hiện tượng ức chế biểu hiện gen nội bào in vivo qua trung gian G4-RHAU140: Khi đồng biểu hiện plasmid mang gen chỉ thị G4-CFP cùng vector biểu hiện RHAU140 trong vi khuẩn E. coli, mức độ huỳnh quang CFP và mật độ protein trên SDS-PAGE giảm rõ rệt so với đối chứng mang plasmid RHAU124 hoặc vector rỗng. Điều này khẳng định tương tác bền vững giữa RHAU140 và motif G4 nằm ở vùng khởi động/dịch mã tạo ra vật cản không gian (steric hindrance), ức chế trực tiếp bộ máy biểu hiện gen của vi khuẩn.

4. Tiến hóa thành công peptide siêu ái lực RHAU30 bằng Ribosome Display: Qua 6 vòng sàng lọc liên tục từ thư viện đột biến L10 (sử dụng mồi thoái hóa NNK), mức độ đa dạng di truyền hội tụ cao độ tại vòng thứ 6 (chứng minh qua Sequence Logo). Sàng lọc thu được 4 biến thể peptide RHAU30 có ái lực vượt trội. Đáng chú ý, peptide RHAU30 (kích thước chỉ 30 aa) đạt hằng số phân ly $\text{K}_d$ ở dải nanomolar, tương đương với phân tử RHAU140 có kích thước gấp gần 5 lần.

5. Kích hoạt thành công hệ thống enzyme Caspase-9 thông qua dimer hóa cảm ứng bởi G4: Khi dung hợp RHAU30 với caspase-9 (RHAU30-CASP9), ở trạng thái monomer enzyme không có hoạt tính. Tuy nhiên, khi bổ sung G4 song song (T95-2T hoặc RNA TERRA), hai phân tử RHAU30 liên kết đồng thời lên hai mặt G-tetrad của một phân tử G4, kéo hai domain CASP9 lại gần nhau tạo phức hợp dimer hoạt động, xúc tác phân cắt cơ chất tự nhiên CASP3 thành các đoạn peptide đặc trưng trên gel SDS-PAGE.

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Xác thực mô hình dimer hóa cảm ứng không gian trên nền tảng nucleic acid quadruplex; cung cấp bằng chứng thực nghiệm rõ ràng về cơ chế điều hòa biểu hiện gen in vivo dựa trên phức hợp G4-protein ở sinh vật nhân sơ.
• Đổi mới phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình ribosome display vô bào trong tiến hóa peptide nhận diện cấu trúc nucleic acid bậc cao; thiết lập phương thức thiết kế enzyme giới hạn nhân tạo có thể lập trình (programmable G4-targeted nucleases).
• Ứng dụng y sinh: Peptide RHAU30 và mẫu dò RHAU140-CFP mở ra phương tiện chẩn đoán nhanh sự hiện diện của các đoạn gen G4 bảo tồn trong các tác nhân gây bệnh nguy hiểm như SARS-CoV-2, Hepatitis A Virus (HAV), Epstein-Barr Virus (EBV).
• Phát triển dược phẩm: Hệ thống RHAU30-CASP9 đặt nền móng cho liệu pháp "bẫy tự sát phân tử" (molecular suicide trap): nhắm mục tiêu vào các tế bào ung thư biểu hiện quá mức G4 telomere để kích hoạt chọn lọc chu trình chết tế bào (apoptosis) mà không ảnh hưởng đến mô lành.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn ghi nhận 3 giới hạn nghiên cứu:

1. Phạm vi mô hình sinh vật: Các thử nghiệm điều hòa biểu hiện gen in vivo mới dừng lại ở hệ vi khuẩn Escherichia coli, chưa đánh giá trên các dòng tế bào ung thư người (mammalian cells) vốn có bối cảnh nhiễm sắc chất (chromatin architecture) và hệ protein tháo xoắn nội sinh phức tạp hơn nhiều.
2. Động lực học phân cắt in vivo của FokI: Enzyme RHAU140-FokI hoạt động hiệu quả in vitro nhưng để ứng dụng chỉnh sửa gen trong tế bào sống đòi hỏi phải tối ưu hóa cấu trúc monomer/dimer của domain FokI (như dạng heterodimer cải tiến Sharkey) nhằm loại bỏ hoàn toàn khả năng cắt ngoài mục tiêu (off-target cleavage).
3. Cấu trúc tinh thể học chi tiết: Ái lực của RHAU30 mới được xác định qua FRET và huỳnh quang gián tiếp; chưa thu thập dữ liệu nhiễu xạ tia X (X-ray crystallography) hoặc Cryo-EM ở độ phân giải nguyên tử cho phức hợp RHAU30-CASP9 gắn trên G4.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda):

• Phát triển các cấu trúc nanobody/mini-protein dựa trên khung RHAU30 để đưa vào tế bào người bằng hạt nano lipid (LNP) nhằm ức chế biểu hiện gen tiền ung thư c-MYC và KRAS.
• Tối ưu hóa linker giữa RHAU140 và FokI để tạo ra công cụ G4-base editing có độ chính xác cao.
• Ứng dụng RHAU30 làm sensor huỳnh quang đơn phân tử trong kỹ thuật giải trình tự G4 toàn hệ gen (G4-Seq).
• Mở rộng kỹ thuật ribosome display để tạo các peptide chuyên biệt cho G4 đối song song và G4 lai.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình của NCS. Trương Thị Tình Tươm mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn to lớn:

• Tác động học thuật: Dự kiến thu hút hàng chục trích dẫn quốc tế trong các chuyên ngành lý sinh học, hóa sinh acid nucleic và sinh học tổng hợp; củng cố vị thế của nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học (CBB) - ĐHKHTN TP.HCM và Biophysics Lab - Đại học Công nghệ Nanyang (NTU, Singapore).
• Chuyển giao công nghệ sinh học: Cung cấp bộ công cụ nhận diện G4 chi phí thấp, sản xuất nhanh qua hệ thống tái tổ hợp E. coli, giảm sự phụ thuộc vào kháng thể nhập khẩu đắt tiền (như BG4).
• Tiềm năng ứng dụng lâm sàng: Mở ra hướng tiếp cận mới trong chẩn đoán virus (SARS-CoV-2, EBV) và thiết kế thuốc trúng đích G4 điều trị ung thư.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học giả chuyên ngành Vi sinh – Sinh học phân tử: Tiếp cận quy trình chi tiết về kỹ thuật tiến hóa vô bào ribosome display và phương pháp biểu hiện, tinh sạch protein dung hợp gắn G4.
• Các nhà phát triển công nghệ chỉnh sửa gen: Khai thác module định hướng RHAU140 để phát triển các thế hệ nuclease nhân tạo mới nhận diện cấu trúc bậc hai thay vì chuỗi đơn nucleotide.
• R&D Dược phẩm sinh học: Ứng dụng khung peptide RHAU30 để thiết kế các phân tử thuốc sinh học (biologics) nhắm mục tiêu telomere và các vùng điều hòa promoter gây bệnh.
• Hệ thống y tế dự phòng và kiểm soát dịch bệnh: Ứng dụng mẫu dò huỳnh quang RHAU140-CFP trong các kít chẩn đoán nhanh acid nucleic virus có cấu trúc G4.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đâu là đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án đối với cấu trúc RHAU-G4?

   • Trả lời: Luận án chứng minh rằng tính đặc hiệu nhận diện G4 song song hoàn toàn có thể được cô đọng trong một peptide đơn chuỗi 30 amino acid (RHAU30) với ái lực tương đương vùng N-terminal 140 aa tự nhiên, đồng thời chứng minh cơ chế một phân tử G4 đóng vai trò giàn giáo (scaffold) cảm ứng dimer hóa và kích hoạt chức năng của hai enzyme gắn kèm (CASP9).

2. Cải tiến phương pháp luận của luận án có gì vượt trội so với 2 nghiên cứu quốc tế tiêu biểu?

   • Trả lời: So với nghiên cứu của Dang & Phan (2016) sử dụng mẫu dò RHAU53-CFP có ái lực thấp ($\text{K}_d = 124\text{ nM}$), luận án đã nâng cấp thành công lên RHAU140-CFP cho độ nhạy vượt trội. So với công trình G4P của Zheng et al. (2020) phải ghép 2 phân tử RHAU23 qua linker nhân tạo (64 aa), luận án sử dụng ribosome display tiến hóa thành công peptide đơn phân RHAU30 chỉ 30 aa nhưng đạt ái lực cực mạnh.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm là gì?

   • Trả lời: Sự tương tác giữa RHAU140 và G4 khi được bố trí trong plasmid ở vi khuẩn E. coli có khả năng gây ức chế biểu hiện gen chỉ thị CFP ở mức độ rất mạnh in vivo, cho thấy cản trở không gian của phức hợp protein-G4 đủ sức phong tỏa hoạt động của bộ máy dịch mã nhân sơ mà không cần hoạt tính helicase xúc tác.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

   • Trả lời: Toàn bộ quy trình được chuẩn hóa chi tiết: từ trình tự mồi PCR (Bảng 2.6), thành phần phản ứng cắt/nối, công thức đệm gel Native-PAGE $18%$ (chứa đệm Kpi $20\text{ mM}$ pH 7.2 và $\text{KCl } 100\text{ mM}$), đến quy trình 6 bước sàng lọc ribosome display sử dụng kit vô bào PURExpress và đệm giải hấp EDTA.

5. Kế hoạch nghiên cứu 10 năm được định hình như thế nào?

   • Trả lời: Lộ trình tập trung vào: (1) Cấu trúc tinh thể học phức hợp RHAU30-G4 độ phân giải cao; (2) Thử nghiệm tiền lâm sàng hệ thống RHAU30-CASP9 trên mô hình chuột ung thư mang đột biến c-MYC; (3) Mở rộng thư viện ribosome display để tạo peptide đặc hiệu cho RNA G4 trong các virus RNA mới nổi.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Trương Thị Tình Tươm đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra với 6 đóng góp mang tính nền tảng:

1. Thiết kế và biểu hiện thành công đầu dò huỳnh quang RHAU140-CFP nhận diện chọn lọc cấu trúc G4 song song T95-2T.
2. Chế tạo thành công enzyme cắt giới hạn nhân tạo RHAU140-FokI có khả năng phân cắt cơ chất DNA chứa motif G4 song song phụ thuộc thời gian và liều lượng.
3. Chứng minh thực nghiệm sự ức chế biểu hiện gen CFP in vivo trong E. coli thông qua tương tác đặc hiệu giữa G4 và RHAU140.
4. Xây dựng 4 thư viện DNA đột biến tổ hợp và thiết lập quy trình ribosome display 6 vòng chọn lọc để làm giàu các phân tử peptide siêu ái lực.
5. Thu nhận thành công peptide thế hệ mới RHAU30 (30 amino acid) có ái lực gắn kết G4 song song mạnh nhất, tương đương với phân tử kích thước lớn RHAU140.
6. Chứng minh nguyên lý dimer hóa và kích hoạt thành công enzyme caspase-9 (RHAU30-CASP9) trên khuôn G4 song song để phân cắt cơ chất CASP3.

Công trình mở ra 3 hướng nghiên cứu mới về chẩn đoán virus, trị liệu ung thư trúng đích và công nghệ nuclease nhân tạo, đóng góp bước tiến quan trọng cho sinh học phân tử Việt Nam trên bản đồ học thuật quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU G-quadruplex (G4) là cấu trúc xoắn bốn sợi của DNA hoặc RNA được hình thành ở vùng trình tự lặp lại giàu guanine trong những vi trí thiết yếu của tế bào như telomere, promoter, 5’-UTR (5’-untranslated region),. Đây là cấu trúc có vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere. Do đó, G4 có tiềm năng lớn trong nghiên cứu và ứng dụng đề điều hòa hoạt động của tế bảo, định hướng phát triển các phân tử thuốc nhắm mục tiêu G4 dé điều trị bệnh cho người đặc biệt là ung thư. Ngoài ra, G4 còn có giá trị đối với virus như ức chế sự phát triển va là công cụ chan đoán đề phát hiện hepatitis A virus (HAV), Epstein-Barr Virus (EBV) và cauliflower mosaic virus (CaMV).

Đặc biệt, trong đại dịch toàn cầu COVID-19 (Coronavirus disease) vừa qua, các nghiên cứu đã xác định một số trình tự G4 bảo tồn và bền vững trong SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) mang chức năng kép trong ức chế sao chép và dịch mã của virus. Vì vậy, các nhà khoa học hy vọng có thể phát hiện vai trò của G4 trong chu trình sống của virus dé mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị các bệnh có nguồn gốc từ virus. Những nghiên cứu gan đây cho thay đã phát hiện ngày càng nhiều cau trúc G4 trong các gene liên quan đến bệnh và các protein tương tác với G4 có vai trò điều hòa hoạt động của các gene này. Trong đó RHAU (RNA Helicase associated with AU- rich element) là một trong s6 các protein liên kết với G4 có ái lực cao và đặc hiệu do chứa RHAU specific motif (RSM) dài 13 amino acid (aa) từ vị trí 54-66.

Tương tac giữa RHAU với G4 có vai trò trong sự phát triển phôi và tim, tao mau,. Tuy nhiên, protein RHAU có kích thước to, khó kiểm soát cấu trúc và dung hợp với các protein chức năng. Do đó, các peptide RHAU (RHAUp) mang các trình tự đặc hiệu liên kết với G4 là các ligand tiềm năng cho nghiên cứu liệu pháp điều trị bệnh dựa trên kiểm soát G4. RHAUp có cơ chế gan lên G4 đã được hiểu rõ và peptide nhỏ nhất liên kết với G4 là RHAU16 nhưng có ái lực yếu do đoạn peptide này ngắn.

Peptide dai hơn cho ái lực cao hơn vì có các tương tác hỗ trợ và thông thường các nghiên cứu sử dụng RHAU23, RHAUS3,. nhưng có ái lực không cao. Vì vậy dé tăng ái lực liên kết giữa RHAUp với G4 trong đề tài sẽ sử dụng RHAU140 chứa RSM để tạo ra các công Trang | cụ mới cho nghiên cứu và ứng dụng trên đối tượng G4 bằng cách dung hợp với các protein chỉ thị hoặc protein chức năng hướng đến mục tiêu ứng dụng trong nghiên cứu như chỉnh sửa gene, kiểm soát hoạt động tế bào. Do vậy, đề tài này tạo ra các protein RHAU140 tái tổ hợp chứa RSM dung hợp với các protein chức năng khác để làm enzyme cắt, mẫu dò phát hiện G4 song song, hoạt hóa enzyme và kiêm soát biêu hiện protein trong tế bào.

Bên cạnh đó, dé cải thiện ái lực của RHAU23 với G4 song song, tiến hành sang lọc bang kỹ thuật ribosome display dé thu được các peptide có kích thước nhỏ nhưng ái luc cao và đặc hiệu từ trình tự sốc RHAU23. Mục tiêu nghiên cứu: ứng dung peptide chứa motif đặc hiệu cua helicase RHAU làm công cụ nghiên cứu G4 song song ở vi khuẩn Đề dat được các mục tiêu nêu trên, cần tiễn hành các nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu tương tác đặc hiệu cua các peptide RHAU 140 dung hợp với G4 song Song trong sinh hóa Sang lọc các RHAUp có ái lực cao và đặc hiệu cho G4 song song bang kỹ thuật ribosome display Đánh giá ái lực tương tác của RHAUp sau sàng lọc bằng ribosome display với G4 song song thông qua FRET và hoạt hóa enzyme Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: cấu trúc G4 trong bộ gene có vai trò quan trọng trong điều hoà rất nhiều hoạt động của tế bào như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy tri telomere. Đây là đối tượng tiềm năng trong các nghiên cứu và ứng dụng y dược học. Các phân tử tương tác đặc hiệu với G4 và làm bền cấu trúc này có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh đặc biệt là ung thư.

Việc tìm được phân tử ái lực cao và đặc hiệu có vai trò rất lớn trong nghiên cứu và ứng dụng đề can thiệp vào các chức năng của G4. Nghiên cứu này đã tạo ra các protein tái tổ hợp mới bằng phương pháp dung hợp giữa RHAUPp với các protein chức năng có khả năng nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song và thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng như phân tử dò huỳnh quang, enzyme cắt giới hạn, hoạt hóa enzyme. Do đó, nghiên cứu này là một cách tiép cận có tính khoa học và tiêm năng ứng dụng cao. Trang 2 Những đóng góp mới của luận án: (i) tạo ra đầu dò RHAU140-CFP nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song 795-27 thông qua đo cường độ phát huỳnh quang CFP, (ii) tạo enzyme cat giới hạn RHAU140-FokI và khảo sat các đặc tính cắt DNA của enzyme này như nồng độ và thời gian, (iii) chứng minh được có sự ức chế biểu hiện protein CFP trong tế bào vi khuẩn E.

coli bởi tương tác giữa G4 song song với RHAU140, (iv) tao được 4 thư viện DNA bằng PCR tô hợp dùng cho sàng lọc băng kỹ thuật ribosome display, (v) thu được 4 RHAUp có ái lực cao, đặc hiệu với G4 song song 795-27 sau khi sàng lọc bằng ribosome display và chứng minh RHAU30 có ái lực gắn G4 song song cao nhất và tương đương với RHAU140, (vi) RHAU30 cảm ứng sự dimer và hoạt hóa RHAU30-CASP9 thông qua tương tác đặc hiệu giữa G4 và hai phân tử RHAU30. Trang 3 Chương | TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm cấu trúc G4 G4 là cấu trúc DNA hoặc RNA bậc hai có bốn sợi được hình thành từ các trình tự nucleotide lặp lại giàu guanine tạo nên các mặt phăng G-tetrad xếp chồng lên nhau khi có sự hiện diện của ion kim loại hóa trị 1 [1]. Mỗi G-tetrad chứa bốn phân tử guanine ở bốn góc của mặt phang, giữa hai G-tetrad có ion kim loại hóa trị thường là K* hoặc Nat ở trung tâm giúp G4 bền vững[2].

Cau trúc G4 phô biến thường có ba mặt phăng nhưng đôi khi cũng có hai hoặc bốn G-tetrad. G4 được phát hiện đầu tiên ở telomere, sau đó là promoter và một số vị trí khác trong bộ gene có vai trò điều hòa hoạt động tế bào. Cầu trúc G4 trong sợi đôi DNA được minh họa trong Hình 1.1: Cấu trúc của G4 trong sợi đôi DNA Cấu trúc G4 được bắt đầu nghiên cứu vào đầu những năm 1960 và tiếp tục cho đến nay đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị, vẫn là đối tượng giàu tiềm năng trong nghiên cứu, chân đoán và trị liệu, thu hút nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới bởi trình tự hình thành G4 chỉ có ở các vùng chức năng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động tế bao như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere. Do đó, G4 được xem là đối tượng tiềm năng trong định hướng nghiên cứu tìm kiếm các liệu pháp dé chống ung thư và các bệnh nguy hiểm khác.

Cấu tạo, điều kiện và các kiểu hình thành cấu trúc G4 Các trình tự DNA hoặc RNA lặp lại giàu guanine khác nhau sẽ hình thành các kiểu cầu trúc G4 khác nhau bởi sự tác động của những nhân tố như: số lượng guanine, số base trong mỗi vòng (loop), số lượng phân tử DNA hoặc RNA, chiều và hướng gấp cuộn, vị trí hình thành trong bộ gene, điều kiện môi trường và chức năng sinh học trong tế bào [3], [4], [5]. Nhìn chung, G4 là cấu trúc bậc hai có bốn sợi của phân Trang 4 tử nucleic acid lặp lại giàu guanine do sự xếp chồng lên nhau của các G-tetrad khi có sự hiện diện của ion kim loại K* hoặc Na" ở trung tâm của hai mặt phăng G-tetrad. Cấu tạo của G-tetrad là một mặt phắng tạo nên từ bốn guanine ở bốn góc thông qua liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các guanine ở các vị trí N1, N2 va 06, N7 của các guanine bên cạnh nhau như Hình 1. Tám liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các phân tử guanine trong một mặt phang G-tetrad giúp cấu trúc này ồn định hơn.

Guanine TM, a A B n7 —R “1 N › / 7 oO HN )1 :ry \ Ề: HN HH a N7H 2 = \ ’ H H2N N H, = AA N ì _N-LN:-.2: Cấu trúc của mặt phẳng G-tetrad A: Cấu tạo phân tử guanine, B: Mặt phẳng G-tetrad Các trình tự nucleotide giàu guanine sẽ tạo thành các mặt phang G-tetrad xếp chồng lên nhau khi có sự hiện diện của ion Kt hoặc Na dé hình thành cấu trúc G4. Đối với sợi DNA, tùy vào hướng gấp cuộn mà G4 được phân loại thành ba kiểu cấu trúc chính: song song (parallel) là cấu trúc có bốn sợi cùng hướng (4 † hoặc 4 |) [6], đối song song (anti-parallel) là cấu trúc có hai sợi cùng hướng và hai sợi có chiều ngược lại (2 †+ 2 |) [7] có thé là cấu trúc dạng ghế hoặc cấu trúc kiểu giỏ tùy thuộc vào vị trí của các vòng, hỗn hợp (hybrid) là kiểu cấu trúc có một sợi ngược hướng với ba sợi còn lại (3 † + 1 | hoặc 3 | + 1 †) [8]. Các kiểu cấu trúc G4 được thé hiện trong Hình 1.3 [9], trong đó cấu trúc song song tao ra hai mặt phang ở đầu 5’ và 3” nên dễ dàng tương tác với phân tử khác hơn hai cấu trúc còn lại do hình thành vòng bên hoặc vòng trên mặt phẳng ở đầu 5’ và 3’ nên khó tương tác với các phân tử khác. Đối với trình tự RNA, G4 chỉ hình thành cấu trúc song song [10].

Sự hình thành, tính ôn định và hình dạng của cau trúc G4 phụ thuộc rất nhiều vào các cation hóa trị 1 [11]. Sự hiện diện của ion K* sẽ tạo ra kiểu cấu trúc G4 hỗn hợp trong telomere người trong khi Na có xu hướng hình thành cấu trúc đối song song [12]. Trang 5 Ghế Vòng 3 5 song song không song song không song song hỗn hợp Hình 1.3: Các kiểu cấu trúc G4 Cấu trúc G4 được hình thành từ một, hai hoặc bốn sợi DNA (hoặc RNA) nhưng phần lớn các nghiên cứu tập trung vào G4 tạo nên từ một sợi DNA (hoặc RNA). Sự có mặt của các ion kim loại K* hoặc Na" là điều kiện cần dé trình tự lặp lại giàu guanine hình thành cau trúc G4 cũng như làm ôn định và bền vững chúng.