MỞ ĐẦU G-quadruplex (G4) là cấu trúc xoắn bốn sợi của DNA hoặc RNA được hình thành ở vùng trình tự lặp lại giàu guanine trong những vi trí thiết yếu của tế bào như telomere, promoter, 5’-UTR (5’-untranslated region),. Đây là cấu trúc có vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere. Do đó, G4 có tiềm năng lớn trong nghiên cứu và ứng dụng đề điều hòa hoạt động của tế bảo, định hướng phát triển các phân tử thuốc nhắm mục tiêu G4 dé điều trị bệnh cho người đặc biệt là ung thư. Ngoài ra, G4 còn có giá trị đối với virus như ức chế sự phát triển va là công cụ chan đoán đề phát hiện hepatitis A virus (HAV), Epstein-Barr Virus (EBV) và cauliflower mosaic virus (CaMV).
Đặc biệt, trong đại dịch toàn cầu COVID-19 (Coronavirus disease) vừa qua, các nghiên cứu đã xác định một số trình tự G4 bảo tồn và bền vững trong SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) mang chức năng kép trong ức chế sao chép và dịch mã của virus. Vì vậy, các nhà khoa học hy vọng có thể phát hiện vai trò của G4 trong chu trình sống của virus dé mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị các bệnh có nguồn gốc từ virus. Những nghiên cứu gan đây cho thay đã phát hiện ngày càng nhiều cau trúc G4 trong các gene liên quan đến bệnh và các protein tương tác với G4 có vai trò điều hòa hoạt động của các gene này. Trong đó RHAU (RNA Helicase associated with AU- rich element) là một trong s6 các protein liên kết với G4 có ái lực cao và đặc hiệu do chứa RHAU specific motif (RSM) dài 13 amino acid (aa) từ vị trí 54-66.
Tương tac giữa RHAU với G4 có vai trò trong sự phát triển phôi và tim, tao mau,. Tuy nhiên, protein RHAU có kích thước to, khó kiểm soát cấu trúc và dung hợp với các protein chức năng. Do đó, các peptide RHAU (RHAUp) mang các trình tự đặc hiệu liên kết với G4 là các ligand tiềm năng cho nghiên cứu liệu pháp điều trị bệnh dựa trên kiểm soát G4. RHAUp có cơ chế gan lên G4 đã được hiểu rõ và peptide nhỏ nhất liên kết với G4 là RHAU16 nhưng có ái lực yếu do đoạn peptide này ngắn.
Peptide dai hơn cho ái lực cao hơn vì có các tương tác hỗ trợ và thông thường các nghiên cứu sử dụng RHAU23, RHAUS3,. nhưng có ái lực không cao. Vì vậy dé tăng ái lực liên kết giữa RHAUp với G4 trong đề tài sẽ sử dụng RHAU140 chứa RSM để tạo ra các công Trang | cụ mới cho nghiên cứu và ứng dụng trên đối tượng G4 bằng cách dung hợp với các protein chỉ thị hoặc protein chức năng hướng đến mục tiêu ứng dụng trong nghiên cứu như chỉnh sửa gene, kiểm soát hoạt động tế bào. Do vậy, đề tài này tạo ra các protein RHAU140 tái tổ hợp chứa RSM dung hợp với các protein chức năng khác để làm enzyme cắt, mẫu dò phát hiện G4 song song, hoạt hóa enzyme và kiêm soát biêu hiện protein trong tế bào.
Bên cạnh đó, dé cải thiện ái lực của RHAU23 với G4 song song, tiến hành sang lọc bang kỹ thuật ribosome display dé thu được các peptide có kích thước nhỏ nhưng ái luc cao và đặc hiệu từ trình tự sốc RHAU23. Mục tiêu nghiên cứu: ứng dung peptide chứa motif đặc hiệu cua helicase RHAU làm công cụ nghiên cứu G4 song song ở vi khuẩn Đề dat được các mục tiêu nêu trên, cần tiễn hành các nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu tương tác đặc hiệu cua các peptide RHAU 140 dung hợp với G4 song Song trong sinh hóa Sang lọc các RHAUp có ái lực cao và đặc hiệu cho G4 song song bang kỹ thuật ribosome display Đánh giá ái lực tương tác của RHAUp sau sàng lọc bằng ribosome display với G4 song song thông qua FRET và hoạt hóa enzyme Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: cấu trúc G4 trong bộ gene có vai trò quan trọng trong điều hoà rất nhiều hoạt động của tế bào như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy tri telomere. Đây là đối tượng tiềm năng trong các nghiên cứu và ứng dụng y dược học. Các phân tử tương tác đặc hiệu với G4 và làm bền cấu trúc này có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh đặc biệt là ung thư.
Việc tìm được phân tử ái lực cao và đặc hiệu có vai trò rất lớn trong nghiên cứu và ứng dụng đề can thiệp vào các chức năng của G4. Nghiên cứu này đã tạo ra các protein tái tổ hợp mới bằng phương pháp dung hợp giữa RHAUPp với các protein chức năng có khả năng nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song và thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng như phân tử dò huỳnh quang, enzyme cắt giới hạn, hoạt hóa enzyme. Do đó, nghiên cứu này là một cách tiép cận có tính khoa học và tiêm năng ứng dụng cao. Trang 2 Những đóng góp mới của luận án: (i) tạo ra đầu dò RHAU140-CFP nhận diện đặc hiệu cấu trúc G4 song song 795-27 thông qua đo cường độ phát huỳnh quang CFP, (ii) tạo enzyme cat giới hạn RHAU140-FokI và khảo sat các đặc tính cắt DNA của enzyme này như nồng độ và thời gian, (iii) chứng minh được có sự ức chế biểu hiện protein CFP trong tế bào vi khuẩn E.
coli bởi tương tác giữa G4 song song với RHAU140, (iv) tao được 4 thư viện DNA bằng PCR tô hợp dùng cho sàng lọc băng kỹ thuật ribosome display, (v) thu được 4 RHAUp có ái lực cao, đặc hiệu với G4 song song 795-27 sau khi sàng lọc bằng ribosome display và chứng minh RHAU30 có ái lực gắn G4 song song cao nhất và tương đương với RHAU140, (vi) RHAU30 cảm ứng sự dimer và hoạt hóa RHAU30-CASP9 thông qua tương tác đặc hiệu giữa G4 và hai phân tử RHAU30. Trang 3 Chương | TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm cấu trúc G4 G4 là cấu trúc DNA hoặc RNA bậc hai có bốn sợi được hình thành từ các trình tự nucleotide lặp lại giàu guanine tạo nên các mặt phăng G-tetrad xếp chồng lên nhau khi có sự hiện diện của ion kim loại hóa trị 1 [1]. Mỗi G-tetrad chứa bốn phân tử guanine ở bốn góc của mặt phang, giữa hai G-tetrad có ion kim loại hóa trị thường là K* hoặc Nat ở trung tâm giúp G4 bền vững[2].
Cau trúc G4 phô biến thường có ba mặt phăng nhưng đôi khi cũng có hai hoặc bốn G-tetrad. G4 được phát hiện đầu tiên ở telomere, sau đó là promoter và một số vị trí khác trong bộ gene có vai trò điều hòa hoạt động tế bào. Cầu trúc G4 trong sợi đôi DNA được minh họa trong Hình 1.1: Cấu trúc của G4 trong sợi đôi DNA Cấu trúc G4 được bắt đầu nghiên cứu vào đầu những năm 1960 và tiếp tục cho đến nay đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị, vẫn là đối tượng giàu tiềm năng trong nghiên cứu, chân đoán và trị liệu, thu hút nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới bởi trình tự hình thành G4 chỉ có ở các vùng chức năng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa hoạt động tế bao như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere. Do đó, G4 được xem là đối tượng tiềm năng trong định hướng nghiên cứu tìm kiếm các liệu pháp dé chống ung thư và các bệnh nguy hiểm khác.
Cấu tạo, điều kiện và các kiểu hình thành cấu trúc G4 Các trình tự DNA hoặc RNA lặp lại giàu guanine khác nhau sẽ hình thành các kiểu cầu trúc G4 khác nhau bởi sự tác động của những nhân tố như: số lượng guanine, số base trong mỗi vòng (loop), số lượng phân tử DNA hoặc RNA, chiều và hướng gấp cuộn, vị trí hình thành trong bộ gene, điều kiện môi trường và chức năng sinh học trong tế bào [3], [4], [5]. Nhìn chung, G4 là cấu trúc bậc hai có bốn sợi của phân Trang 4 tử nucleic acid lặp lại giàu guanine do sự xếp chồng lên nhau của các G-tetrad khi có sự hiện diện của ion kim loại K* hoặc Na" ở trung tâm của hai mặt phăng G-tetrad. Cấu tạo của G-tetrad là một mặt phắng tạo nên từ bốn guanine ở bốn góc thông qua liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các guanine ở các vị trí N1, N2 va 06, N7 của các guanine bên cạnh nhau như Hình 1. Tám liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các phân tử guanine trong một mặt phang G-tetrad giúp cấu trúc này ồn định hơn.
Guanine TM, a A B n7 —R “1 N › / 7 oO HN )1 :ry \ Ề: HN HH a N7H 2 = \ ’ H H2N N H, = AA N ì _N-LN:-.2: Cấu trúc của mặt phẳng G-tetrad A: Cấu tạo phân tử guanine, B: Mặt phẳng G-tetrad Các trình tự nucleotide giàu guanine sẽ tạo thành các mặt phang G-tetrad xếp chồng lên nhau khi có sự hiện diện của ion Kt hoặc Na dé hình thành cấu trúc G4. Đối với sợi DNA, tùy vào hướng gấp cuộn mà G4 được phân loại thành ba kiểu cấu trúc chính: song song (parallel) là cấu trúc có bốn sợi cùng hướng (4 † hoặc 4 |) [6], đối song song (anti-parallel) là cấu trúc có hai sợi cùng hướng và hai sợi có chiều ngược lại (2 †+ 2 |) [7] có thé là cấu trúc dạng ghế hoặc cấu trúc kiểu giỏ tùy thuộc vào vị trí của các vòng, hỗn hợp (hybrid) là kiểu cấu trúc có một sợi ngược hướng với ba sợi còn lại (3 † + 1 | hoặc 3 | + 1 †) [8]. Các kiểu cấu trúc G4 được thé hiện trong Hình 1.3 [9], trong đó cấu trúc song song tao ra hai mặt phang ở đầu 5’ và 3” nên dễ dàng tương tác với phân tử khác hơn hai cấu trúc còn lại do hình thành vòng bên hoặc vòng trên mặt phẳng ở đầu 5’ và 3’ nên khó tương tác với các phân tử khác. Đối với trình tự RNA, G4 chỉ hình thành cấu trúc song song [10].
Sự hình thành, tính ôn định và hình dạng của cau trúc G4 phụ thuộc rất nhiều vào các cation hóa trị 1 [11]. Sự hiện diện của ion K* sẽ tạo ra kiểu cấu trúc G4 hỗn hợp trong telomere người trong khi Na có xu hướng hình thành cấu trúc đối song song [12]. Trang 5 Ghế Vòng 3 5 song song không song song không song song hỗn hợp Hình 1.3: Các kiểu cấu trúc G4 Cấu trúc G4 được hình thành từ một, hai hoặc bốn sợi DNA (hoặc RNA) nhưng phần lớn các nghiên cứu tập trung vào G4 tạo nên từ một sợi DNA (hoặc RNA). Sự có mặt của các ion kim loại K* hoặc Na" là điều kiện cần dé trình tự lặp lại giàu guanine hình thành cau trúc G4 cũng như làm ôn định và bền vững chúng.