Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu biểu hiện kháng thể đơn dòng kháng thụ thể her 2 trastuzumab trên dòng tế bào cho hướng đến ứng dụng điều trị bệnh ung thư vú

Luận án tiến sĩ về nghiên cứu biểu hiện kháng thể Trastuzumab trên dòng tế bào CHO, hướng đến ứng dụng điều trị hiệu quả bệnh ung thư vú.

• Tác giả: Nguyễn Quang Huy
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Minh Sĩ
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Kháng Thể Đơn Dòng Kháng Thụ Thể HER-2 (Trastuzumab) Trên Dòng Tế Bào CHO Hướng Đến Ứng Dụng Điều Trị Bệnh Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô 2 (HER-2)
• 1.2. Con đường truyền tín hiệu
• 1.3. Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp kháng thụ thể HER-2 (Trastuzumab). Chức năng sinh học. Ứng dụng điều trị lâm sàng. Phát triển thuốc tương tự sinh học Trastuzumab. Quá trình phát triển
• 1.4. Phát triển quy trình sản xuất. Đánh giá thuộc tính chất lượng. Đánh giá phi lâm sàng. Tình hình nghiên cứu sản xuất và thương mại hóa thuốc tương tự sinh học Trastuzumab
• 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện luận án
• 2.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong luận án
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Dòng tế bào
• 2.5. Môi trường nuôi cấy tế bào
• 2.6. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phát triển dòng tế bào CHO mang plasmid biểu hiện Trastuzumab có hoạt tính sinh học bằng công nghệ protein tái tổ hợp
• 2.6.2. Tạo dòng tế bào CHO-DG44 mang plasmid tái tổ hợp
• 2.6.3. Phát triển dòng tế bào đơn
• 2.6.4. Đánh giá đặc tính dòng tế bào đơn
• 2.6.5. Phát triển quy trình nuôi cấy và sản xuất Trastuzumab từ quy mô PTN đến pilot và thử nghiệm phi lâm sàng
• 2.6.5.1. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy quy mô PTN thể tích 50 mL
• 2.6.5.2. Thử nghiệm sản xuất Trastuzumab quy mô pilot thể tích 50 L
• 2.6.5.3. Thử nghiệm tinh sạch, thu nhận và đánh giá thuộc tính chất lượng sản phẩm sau cùng
• 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
• 3.1. Phát triển dòng tế bào CHO mang plasmid biểu hiện Trastuzumab có hoạt tính sinh học bằng công nghệ protein tái tổ hợp
• 3.2. Phát triển quy trình nuôi cấy và sản xuất Trastuzumab từ quy mô PTN đến pilot và thử nghiệm phi lâm sàng
• 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH, BÀI BÁO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Trastuzumab Điều Trị Ung Thư Vú

Ung thư vú (UTV) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ Việt Nam. Theo thống kê, UTV chiếm tỷ lệ cao trong số ca mắc mới và tử vong do ung thư ở nữ giới. UTV được chia thành nhiều nhóm, trong đó nhóm HER2 dương tính có tiên lượng xấu và nguy cơ cao. Trastuzumab, một kháng thể đơn dòng tái tổ hợp, được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhắm trúng đích HER2. Tuy nhiên, chi phí điều trị cao là một rào cản lớn. Nghiên cứu và sản xuất thuốc tương tự sinh học (biosimilar Trastuzumab) là một giải pháp tiềm năng để giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận điều trị cho bệnh nhân. Mục tiêu của nghiên cứu này là phát triển một quy trình sản xuất Trastuzumab biosimilar hiệu quả, chất lượng cao, mở đường cho ứng dụng rộng rãi trong nước. Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn, góp phần giảm gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân và hệ thống y tế.

1.1. Vai trò của Trastuzumab trong điều trị ung thư vú HER2 dương tính

Trastuzumab là một kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu vào protein HER2, một thụ thể tyrosine kinase thường biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư vú. Bằng cách gắn kết với HER2, Trastuzumab ức chế sự tăng trưởng và lan rộng của tế bào ung thư. Liệu pháp này đã được chứng minh là cải thiện đáng kể thời gian sống sót và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư vú HER2 dương tính. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy Trastuzumab có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các phương pháp điều trị khác như hóa trị và liệu pháp nội tiết. Hiệu quả của Trastuzumab đã thúc đẩy việc phát triển các thuốc tương tự sinh học, nhằm cung cấp các lựa chọn điều trị với chi phí thấp hơn.

1.2. Tổng quan về tế bào CHO và ứng dụng trong sản xuất dược phẩm

Tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary) là một dòng tế bào động vật có vú được sử dụng rộng rãi trong sản xuất dược phẩm sinh học, đặc biệt là các kháng thể đơn dòng. Tế bào CHO có khả năng biểu hiện protein phức tạp, tăng trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy và dễ dàng thích ứng với các quy trình sản xuất quy mô lớn. Việc sử dụng tế bào CHO cho phép sản xuất Trastuzumab với số lượng lớn và chất lượng ổn định. Công nghệ này đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng đối với ung thư vú HER2 dương tính trên toàn thế giới. Tế bào CHO là một nền tảng sản xuất dược phẩm quan trọng trong công nghệ sinh học.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Phát Triển Dòng Tế Bào CHO Ưu Việt

Phát triển một dòng tế bào CHO ổn định, năng suất cao cho sản xuất Trastuzumab là một thách thức lớn. Cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào, lựa chọn vector biểu hiện phù hợp, và kiểm soát chất lượng sản phẩm. Bên cạnh đó, đảm bảo tính ổn định di truyền của dòng tế bào và giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm là những yếu tố quan trọng. Nghiên cứu này tập trung vào việc vượt qua những thách thức này thông qua các phương pháp kỹ thuật di truyền, tối ưu hóa quy trình và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Mục tiêu cuối cùng là tạo ra một dòng tế bào CHO có khả năng sản xuất Trastuzumab biosimilar với hiệu quả và chất lượng tương đương Herceptin.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hiện Trastuzumab trong tế bào CHO

Hiệu suất biểu hiện Trastuzumab trong tế bào CHO chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm: lựa chọn promoter, trình tự mã hóa, mật độ tế bào, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ oxy hòa tan, và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng và yếu tố tăng trưởng. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đạt được năng suất cao. Các phương pháp như thiết kế thí nghiệm (DOE) có thể được sử dụng để xác định các điều kiện tối ưu. Ngoài ra, việc lựa chọn vector biểu hiện và phương pháp chuyển gen phù hợp cũng có thể cải thiện hiệu quả biểu hiện. Kiểm soát chặt chẽ các điều kiện nuôi cấy tế bào là chìa khóa để đạt được sản xuất Trastuzumab ổn định và hiệu quả.

2.2. Nguy cơ tạp nhiễm Mycoplasma và biện pháp phòng ngừa

Mycoplasma là một loại vi khuẩn nhỏ không có thành tế bào, thường gây tạp nhiễm trong các nuôi cấy tế bào. Tạp nhiễm Mycoplasma có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và chức năng của tế bào CHO, làm giảm hiệu suất sản xuất Trastuzumab. Để phòng ngừa tạp nhiễm, cần tuân thủ các quy trình vô trùng nghiêm ngặt, sử dụng môi trường và hóa chất đã được kiểm tra, và thường xuyên kiểm tra sự hiện diện của Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào. Các phương pháp kiểm tra bao gồm PCR, ELISA, và nhuộm huỳnh quang. Trong trường hợp phát hiện tạp nhiễm, cần loại bỏ tế bào nhiễm hoặc sử dụng các phương pháp điều trị để loại bỏ Mycoplasma.

III. Phương Pháp Phát Triển Dòng Tế Bào CHO Biểu Hiện Trastuzumab

Nghiên cứu này sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để phát triển dòng tế bào CHO có khả năng biểu hiện Trastuzumab. Quy trình bao gồm: tạo plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa Trastuzumab, chuyển gen vào tế bào CHO-DG44, chọn lọc dòng tế bào ổn định, và đánh giá đặc tính của dòng tế bào. Dòng tế bào được chọn lọc phải có khả năng biểu hiện Trastuzumab với năng suất cao, ổn định trong thời gian dài, và không bị tạp nhiễm. Phương pháp này cho phép tạo ra một dòng tế bào sản xuất Trastuzumab biosimilar với chất lượng và hiệu quả tương đương Herceptin.

3.1. Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp và chuyển gen vào tế bào CHO DG44

Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp bao gồm: khuếch đại gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của Trastuzumab bằng PCR, gắn các gen này vào vector biểu hiện phù hợp, và nhân bản plasmid trong vi khuẩn E. coli. Plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào tế bào CHO-DG44 bằng các phương pháp như điện di, liposome, hoặc virus. Sau khi chuyển gen, các tế bào được chọn lọc bằng kháng sinh để loại bỏ các tế bào không nhận plasmid. Các tế bào sống sót được nuôi cấy để phát triển thành các dòng tế bào ổn định.

3.2. Phương pháp chọn lọc và đánh giá đặc tính dòng tế bào đơn

Sau khi chuyển gen, các tế bào được pha loãng và nuôi cấy trong các giếng riêng biệt để tạo thành các dòng tế bào đơn. Các dòng tế bào đơn được sàng lọc để chọn ra các dòng có năng suất biểu hiện Trastuzumab cao. Năng suất biểu hiện được đo bằng các phương pháp như ELISA, Western blot, hoặc HPLC. Các dòng tế bào được chọn lọc cũng được kiểm tra về tính ổn định di truyền, sự tạp nhiễm, và khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú in vitro.

IV. Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất Trastuzumab Quy Mô Pilot 50L

Sau khi phát triển dòng tế bào CHO có năng suất cao, nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất Trastuzumab biosimilar quy mô pilot (50L). Quá trình tối ưu hóa bao gồm: điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy tế bào, phát triển quy trình tinh chế, và đánh giá chất lượng sản phẩm. Mục tiêu là đạt được năng suất sản xuất Trastuzumab lớn hơn 2 g/L, độ tinh sạch lớn hơn 98%, và hiệu suất thu hồi lớn hơn 65%. Sản phẩm cuối cùng phải có tính sinh học và độ an toàn tương đương Herceptin.

4.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng Trastuzumab

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng Trastuzumab trong quá trình sản xuất quy mô lớn, bao gồm: nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, tốc độ khuấy, và nồng độ các chất dinh dưỡng. Các yếu tố này được nghiên cứu và tối ưu hóa bằng các phương pháp như thiết kế thí nghiệm (DOE) và phân tích hồi quy. Mục tiêu là xác định các điều kiện nuôi cấy tế bào tối ưu để đạt được năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt nhất.

4.2. Quy trình tinh chế Trastuzumab và đánh giá thuộc tính chất lượng

Quy trình tinh chế Trastuzumab bao gồm: loại bỏ tế bào và các chất thải, cô đặc protein, và loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp tinh chế thường được sử dụng bao gồm: ly tâm, lọc, sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, và sắc ký lọc gel. Sản phẩm Trastuzumab sau khi tinh chế được đánh giá về các thuộc tính chất lượng như độ tinh khiết, độ đồng nhất, hoạt tính sinh học, và độ an toàn. Các phương pháp đánh giá bao gồm: SDS-PAGE, Western blot, HPLC, ELISA, và các xét nghiệm độc tính tế bào.

V. Ứng Dụng Kết Quả Đánh Giá Trastuzumab Biosimilar Tiền Lâm Sàng

Nghiên cứu đánh giá thuộc tính chất lượng của Trastuzumab biosimilar được sản xuất từ dòng tế bào CHO đã phát triển. Các kết quả cho thấy sản phẩm có tính sinh học và độ an toàn tương đương Herceptin. Sản phẩm có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú in vitro và kích hoạt phản ứng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC). Các thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật cũng cho thấy sản phẩm có hiệu quả và an toàn. Kết quả này mở đường cho các thử nghiệm lâm sàng và ứng dụng Trastuzumab biosimilar trong điều trị ung thư vú.

5.1. Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú in vitro

Khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú của Trastuzumab biosimilar được đánh giá bằng các xét nghiệm in vitro sử dụng các dòng tế bào ung thư vú HER2 dương tính. Các tế bào được nuôi cấy với các nồng độ khác nhau của Trastuzumab biosimilar và Herceptin. Sau thời gian nuôi cấy nhất định, số lượng tế bào sống sót được đo bằng các phương pháp như MTT hoặc WST-1. Kết quả cho thấy Trastuzumab biosimilar có khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú tương đương Herceptin.

5.2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học ADCC và độc tính tiền lâm sàng

Hoạt tính sinh học ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) của Trastuzumab biosimilar được đánh giá bằng các xét nghiệm in vitro sử dụng các tế bào miễn dịch và các tế bào ung thư vú HER2 dương tính. Các tế bào miễn dịch được hoạt hóa bởi Trastuzumab biosimilar và tấn công các tế bào ung thư. Hoạt tính ADCC được đo bằng cách đếm số lượng tế bào ung thư bị tiêu diệt. Các thử nghiệm độc tính tiền lâm sàng được thực hiện trên động vật để đánh giá độ an toàn của Trastuzumab biosimilar. Các động vật được tiêm Trastuzumab biosimilar với các liều khác nhau và được theo dõi về các dấu hiệu độc tính.

VI. Kết Luận Tương Lai Phát Triển Trastuzumab Biosimilar Bền Vững

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phát triển dòng tế bào CHO có khả năng sản xuất Trastuzumab biosimilar với hiệu quả và chất lượng tương đương Herceptin. Quy trình sản xuất quy mô pilot (50L) đã được tối ưu hóa để đạt được năng suất cao và độ tinh khiết tốt. Các thử nghiệm tiền lâm sàng cho thấy sản phẩm có tính sinh học và độ an toàn. Kết quả này mở ra triển vọng sản xuất Trastuzumab biosimilar trong nước, giảm chi phí điều trị và tăng khả năng tiếp cận cho bệnh nhân ung thư vú. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất, đánh giá hiệu quả lâm sàng, và thương mại hóa sản phẩm.

6.1. Các hướng nghiên cứu tiếp theo để cải thiện quy trình sản xuất

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tế bào, sử dụng các vector biểu hiện tiên tiến, và áp dụng các công nghệ tự động hóa để tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp tinh chế hiệu quả hơn để loại bỏ các tạp chất và nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm. Các nghiên cứu về tính ổn định của sản phẩm trong quá trình lưu trữ và vận chuyển cũng rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của Trastuzumab biosimilar.

6.2. Triển vọng thương mại hóa và ứng dụng rộng rãi Trastuzumab Biosimilar

Việc thương mại hóa Trastuzumab biosimilar sẽ mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân ung thư vú, hệ thống y tế, và nền kinh tế. Sản phẩm có giá thành thấp hơn sẽ giúp giảm gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân và tăng khả năng tiếp cận điều trị. Sản xuất trong nước sẽ giảm sự phụ thuộc vào nhập khẩu và tạo ra việc làm. Để đạt được mục tiêu này, cần có sự hỗ trợ từ chính phủ, các nhà đầu tư, và các chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược phẩm. Việc hợp tác giữa các trường đại học, viện nghiên cứu, và các công ty dược phẩm là rất quan trọng để thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghệ sinh học trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYEN QUANG HUY TREN DONG TE BAO CHO HUONG DEN UNG DUNG DIEU TRI BENH UNG THU VU LUAN AN TIEN SI SINH HOC TP. Hồ Chí Minh — Năm 2024 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYEN QUANG HUY Ngành: Sinh lý hoc người và động vật Mã số ngành: 62420104 Phản biện 1: PGS.

Hoang Anh Vũ Phản biện 2: PGS. Nguyễn Thị Thu Hoài Phản biện 3: TS. Lê Tuấn Anh Phản biện độc lập 1: PGS. Chir Văn Mén Phản biện độc lập 2: TS.

Vũ Thanh Thảo NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trịnh Thanh Hùng TP. Hồ Chí Minh — Năm 2024 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án Tiến sĩ Sinh học, chuyên ngành Sinh lý học người và động vật, với tên dé tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng thé đơn dòng kháng thụ thé HER-2 (Trastuzumab) trên dòng tế bào CHO hướng đến ứng dụng điều trị bệnh ung thư vú” là công trình nghiên cứu khoa học độc lập do cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Đỗ Minh Sĩ và TS.

Trịnh Thanh Hùng. Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không trùng lắp với các công trình đã công bố trong và ngoài nước. Luận án do chính bản thân tôi biên soạn dựa vào các tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng và không sao chép từ bất kỳ công trình khoa học, bài viết của cá nhân hay tô chức nào khác. Tôi chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Nghiên cứu sinh Nguyễn Quang Huy MỤC LỤC MỤC LLỤC.111 kg i LOT CAM ON 0c cceccsssessssssessesssessecssessesssessecsusssscsecsusssecsusssessessuessesssessessessseesesseseseess iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VA CHU CAI VIET TẮTT.---- 2-5: V DANH MỤC HÌNH ẢNH.0 viii DANH MỤC BANG BIEU 0.ccccceccsscsscsscssessessessesscsscsvcsssssssscsucsucssesueasesseaseaseseeaes xi DAT VAN )2777. TONG QUAN TAI LIEU 1. Thụ thé yếu tố tăng trưởng biểu mô 2 (HER-2) ooceeccesccsseesssessessteessesstessteesees 4 1. Con đường truyền tín hiệu.-- + 2 2 2+S£+E£+EE2EE2E2EE2E2EE2ErErrerreee 5 1.

Khang thé đơn dòng tái tổ hợp kháng thụ thé HER-2 (Trastuzumab). Chức năng sinh hỌC. Ứng dụng điều trị lâm sang. Phát triển thuốc tương tự sinh học Trastuzumab.

Quá trình phát triỀn.--- 2 2 2 £+SE+EE+E£EE2E2E12E12E121121121122122. Phát triển quy trình sản xuất. Đánh giá thuộc tính chất lượng. Đánh giá phi lâm sảằng.

Tình hình nghiên cứu sản xuất và thương mại hóa thuốc tương tự sinh học TrastUZUMab. VAT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Thời gian và địa điểm thực hiện luận án. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong luận án.

Đối tượng nghiên Cứu. Dòng tẾ bàO. Môi trường nuôi cấy tế bào. Nội dung và phương pháp nghiên CỨU.

Phát triển đòng tế bào CHO mang plasmid biêu hiện Trastuzumab có hoạt tính sinh học bằng công nghệ protein tái tổ hợp. Tạo dòng tế bào CHO-DG44 mang plasmid tái tổ hop. Phát triển dòng tế bào đơn. Đánh giá đặc tính dòng tế bào đơn.

Phát triển quy trình nuôi cấy và sản xuất Trastuzumab từ quy mô PTN đến pilot và thử nghiệm phi lâm sang. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy quy mô PTN thể tích 50 mL. Thử nghiệm sản xuất Trastuzumab quy mô pilot thé tích 50 L. Thử nghiệm tinh sạch, thu nhận và đánh giá thuộc tính chất lượng sản phẩm sau cùủng.

KET QUÁ - BAN LUẬN 3. Phát triển dong tế bào CHO mang plasmid biéu hiện Trastuzumab có hoạt tinh sinh học bằng công nghệ protein tái tỔ hợpp. Phát triển quy trình nuôi cấy và sản xuất Trastuzumab từ quy mô PTN đến pilot và thử nghiệm phi lâm sảng.-- 5 6 11193991 2119 11111 1g ng riệt 67 CHUONG 4. KET LUẬN - KIEN NGHỊ AL.-¿- 2-2 <SESE2EEEEx9E19E1511271111111111111 1111111111111 cre.

100 ii DANH MỤC CÔNG TRÌNH, BÀI BÁO TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 11 LỜI CẢM ƠN Lời đâu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đên hai thây hướng dẫn: 7S. Đồ Minh Sĩ và TS. Trịnh Thanh Hùng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, phương pháp và kinh nghiệm nghiên cứu trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo Công ty cô phần Công nghệ sinh học Dược Nanogen đã hỗ trợ kinh phí và tập thể cán bộ, nhân viên phòng Nghiên cứu và Phát triển, phòng Lên men, phòng Tinh chế đã tận tình giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài nghiên cứu tại công ty.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, góp ý và ủng hộ của: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tran Lê Bảo Ha, Trưởng Bộ môn Sinh lý học người và động vật - Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Đặng Thị Phương Thảo, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử và môi trường - Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Các Thầy Cô Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phó Hồ Chí Minh. Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn Ba Mẹ và Vợ đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc, động viên và ủng hộ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành Luận án. IV DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VA CHỮ CAI VIET TAT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADCC antibody-dependent cell- | gây độc tế bào phụ thuộc kháng thê mediated cytotoxicity bioreactor - hệ thống nuôi cấy tế bao động vật tự động CDR complementarity-determining | vùng xác định tính bô khuyết region cIEF capillary isoelectric focusing | điện di mao quản hội tụ đăng điện CHO Chinese Hamster Ovary dòng tế bao buồng trứng chuột đồng Trung Quốc CHO-DG44 | Chinese Hamster Ovary- | dòng tế bào buông trứng chuột DG44 đồng Trung Quốc bị đột biến mat gen mã hóa DHFR CLD cell line development phát triển dòng tế bào DNA deoxyribonucleic acid DNA DOE design of experiment thiét ké thi nghiém ĐVTN - động vật thi nghiệm EMA European Medicines Agency | Cơ quan Quan lý Dược phâm Châu Âu EP European Pharmacopoeia Dược điên Châu Âu erbb2 erythroblastic oncogene B gen mã hóa protein HER-2 FDA Food and Drug Administration |Cuc Quan ly Thuc pham va Dược pham Hoa Kỳ HER the human epidermal growth | thụ thể yếu tô tăng trưởng biêu mô factor receptor ở người Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt HPLC high performance liquid | sắc ký lỏng cao áp chromatography HSR hypersensitivity reaction phan ứng quá man HT hypoxanhthine and thymydine | hypoxanhthine va thymydine ICH International Conference on | Hội đồng quốc tế về hài hòa các Harmonization yêu cầu kỹ thuật đối với dược phẩm dùng cho người mAb monoclonal antibody khang thé don dong MAPK mitogen-activated protein | mitogen-activated protein kinase kinase miRNA micro ribonucleic acid RNA nhỏ không mã hóa mRNA messenger ribonucleic acid RNA thong tin MTX methotrexate methotrexate NCBI The National Center for | Trung tâm Thông tin Công nghệ Biotechnology Information Sinh hoc Quéc gia Hoa Ky PAGE polyacrylamide gel | dién di trén gel polyacrylamide electrophoresis PI3K phosphoinositide 3-kinases phosphoinositide 3-kinases PIP2 phosphatidyl inositol | phosphatidyl inositol biphosphat biphosphat 3,4 3,4 PIP3 phosphatidyl inositol 3,4,5 | phosphatidyl inositol 3,4,5 triphosphat triphosphat PPP pentose phosphate pentose phosphate PTEN phosphatase and ___ tensin | phosphatase and tensin homolog homolog PTN - phòng thi nghiệm VI Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt SFM serum free medium môi trường không chứa huyết thanh SPR surface plasmon resonance cộng hưởng phô plasmon bề mặt RNA ribonucleic acid RNA TCCS - tiêu chuan cơ sở trastuzumab | - thuốc tương tự sinh học biosimilar trastuzumab USPMC United States Pharmacopeia | Bản tóm tắt Thông tin thuốc của Medicines Compendium Dược điển Hoa Kỳ UTV - ung thu va vil DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biéu mô 2 (HER-2).

Con đường truyền tín hiệu của phức hợp thụ thé HER. Tính sinh miễn dich không mong muốn của các kháng thé đơn dong. Cau trúc cơ bản của kháng thé. Cơ chế tác động của Trastuzumab lên thụ thể HER-2.

Quá trình phát triển sinh phẩm bào chế gốc và thuốc tương tự sinh học. Cau trúc pUC57-Tras Le và pUC57-Tras Hc. Cấu trúc pNanogen-Hygro và pNanogen-Puro. Cấu trúc buồng đếm tế bào.- ¿- 2 2 £+S2+E+E2E2EE2EEEE2EE2EE2EErrerree 28 Hình 2.

Cau trúc plasmid tái tổ hợp mã hóa chuỗi nhẹ Trastuzumab. Cau trúc plasmid tái tổ hợp mã hóa chuỗi nặng Trastuzumab. Nguyên lý kỹ thuật ELISA gián tiẾp. Cơ chế tác động của MethotreXafe.-- -- 2 2 ++sz+s+Ezxzxzxzrerxee 35 Hình 2.

Nguyên lý hoạt động của kit nhuộm tế bào WST-1. Nguyên lý phương pháp sắc ký ái lực.----- + 2 z+sz+x++£z+xzzszxez 41 Hình 2. Nguyên lý phương pháp sắc ký trao đồi ion. Nguyên lý phương pháp lọc dòng tiếp tuyến.

Đường cong tăng trưởng của dòng tế bào CHO-DG44. Đường cong giết tế bào CHO-DG44 bằng kháng sinh. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli TOPIOF’ bằng phương pháp PCTR.

- -- -- 5 +11 vn TH TT TH TH HH HH HH ng 52 Hình 3. Kết quả giải trình tự nucleotide gen Tras Le và Tras He. Nong độ Trastuzumab tích lity trong dịch nuôi cấy tế bào sau 72 giờ chuyên ILO|. Phan trăm tế bào phục hồi sau sàng loc kháng sinh.

Năng suất sản xuất Trastuzumab của tế bào sau sàng lọc kháng sinh. Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện Trastuzumab của tế bào trước thích ứng Hình 3. Biéu đồ so sánh mức độ biểu hiện Trastuzumab của tế bao sau thích ứng Hình 3. Kết quả kiểm tra sự tạp nhiễm mycoplasma bằng phương pháp PCR.

Kết quả kiểm tra sự hiện hiện Trastuzumab bằng phương pháp điện di P. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học Trastuzumab bằng phương pháp thử nghiệm dựa trên tẾ bàO. Duong cong tăng trưởng của dòng HO6LD68 trong thí nghiệm khảo sát môi trường và chất bổ sungg.----¿- 2: +¿©+2+++2E++EEE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEeEEeerkrerkesree 69 Hình 3. Kết quả phân tích DOE trong thí nghiệm khảo sát môi trường và chất bố 5.

Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện Trastuzumab của dòng HO6LD68 trong thí nghiệm khảo sát môi trường và chất bồ sung khác nhau. Duong cong tăng trưởng của dòng H06LD68 trong thí nghiệm khảo sát phan trăm chất bổ SUNG. Sự biến động pH trong thí nghiệm khảo sát phan trăm chất bé sung. Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện Trastuzumab của dòng HO6LD68 trong thí nghiệm khảo sát phần trăm chất b6 sung.-- 2 + 2 2+ £+££+££+£++£z+£zzxz+xez 73 Hình 3.

Duong cong tăng trưởng của dòng HO6LD68 trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ và tốc độ lắc. Kết quả phân tích DOE trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ và tốc độ lắc.